GB∕T 36082-2018 纳米技术 特定毒性筛查用金纳米颗粒表面表征 傅里叶变换红外光谱法 GB∕T36082-2018 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS_07.030
中华人民共和国国家标准
GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012纳米技术
特定毒性筛查用金纳米颗粒
表面表征
傅里叶变换红外光谱法
NanotechnologiesSurface characterization of gold nanoparticles for nanomaterialspecific toxicity screeningFT-IR method(ISO/TS 14101:2012,Surface characterization of gold nanoparticlesfor nanomaterial specific toxicity screening:FT-IR method,IDT)2018-03-15发布
中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局中国国家标准化管理委员会
2018-10-01实施
GB/T36082—2018/IS0/TS14101:2012前言
规范性引用文件
术语和定义
符号和缩略语
5样品制备
6FT-IR测试程序
应用举例
附录A（资料性附录）验证配体交换的实例次
附录B（资料性附录）金纳米颗粒表面结合生物化学分子的定性分析实例附录C（资料性附录）
窗片材料选择指南
参考文献
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草GB/T36082—2018/IS0/TS14101:2012本标准使用翻译法等同采用ISO/TS14101：2012《特定毒性筛查用金纳米颗粒表面表征：傅里叶变换红外光谱法》。
与本标准中规范性引用的国际文件有一致性对应关系的我国文件如下：GB/T32269：2015纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒，纳米纤维和纳米片(ISO/TS27687:2008.IDT)。
本标准作了如下编辑性修改：
为与归口标准化技术委员会现有标准系列一致，将标准名称修改为《纳米技术特定毒性筛查用金纳米颗粒表面表征傅里叶变换红外光谱法》；符号和缩略语中，由于g为重力加速度，×g为相对离心力单位符号，因此将X去掉-5.1.3中，为符合离心操作要求，将样品体积1.5mL修正为1mL；一附录A中，根据柠檬酸盐分子结构，增加注，建议将C一O的振动模式改为COO的振动模式：根据红外光谱振动频率分类规则，增加注，建议将1581cm-1C一0伸缩改为CO0反对称伸缩，将1396cm-1羧酸COH弯曲改为COH弯曲和COO对称伸缩，将1257cm-1羧酸C—O伸缩改为C—C伸缩振动，将1111cm-1醇C—O伸缩改为醇和醚的C一O伸缩振动；
7.2和附录B中，根据红外光谱振动频率分类规则，增加注，建议将3311cm-1N一H伸缩振动改为酰胺A带（N一H伸缩振动），将1653cm-1N一H弯曲改为酰胺I带（CO伸缩振动），将1550cm-1N-H弯曲改为酰胺Ⅱ带（N—H弯曲振动）。本标准由中国科学院提出。
本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279)归口。本标准负责起草单位：国家纳米科学中心。本标准参加起草单位：珀金埃尔默企业管理（上海）有限公司、北京大学。本标准主要起草人：郭玉婷、葛广路、华瑞、翁诗甫。1
GB/T36082—2018/IS0/TS14101:2012引言
金纳米颗粒由于尺寸、形状和表面配体易于控制，成为研究理化性质和细胞毒性之间关系的理想模型体系1-3。在金纳米颗粒各种性质中，人们发现其表面配体特性，如化学组成，分子结构和结合分子的数量，对决定金纳米颗粒的行为起到重要作用，比如在溶液中聚集或团聚的程度，在细胞培养液中与生物分子的键合，以及对活细胞的毒性[4-12]。另一方面，合成过程中的表面配体改性并不总是成功的，配体置换的程度宜在金纳米颗粒的特定细胞毒性测试前确定，以获得可靠和一致的结果FT-IR（傅里叶变换红外）吸收光谱是纳米颗粒表面配体鉴定和定量分析的重要工具之一：采用FT-IR方法可对结合在纳米颗粒表面的配体分子的结构和相对数量进行分析[18-20]。然而，金纳米颗粒是在水中合成的，且浓度很低，对测量结果的解释变得复杂。低浓度的金纳米颗粒测试得到的吸光度值很小，易受背景噪声或痕量杂质吸收的影响。由于细胞毒性测试是在水相环境中进行的，所以如果想研究表面特性对金纳米颗粒毒性的影响，需要分析在水溶液中的金纳米颗粒表面存在什么物质。然而，水分子在很宽的波数范围内对红外光有很强的吸收，所以无法用红外光谱对浓度非常低的溶质进行分析。因此有必要制定测试指南，使上述问题的影响最小化。在本标准中，力求制定一个检测干燥膜中的金纳米颗粒的表面结合化学基团的技术规范，以提供水溶液中金纳米颗粒的结合分子的信息。FT-IR测量程序的标准化将作为这一技术规范的基础，大量篇幅也将用于描述正确进行FT-IR分析所需要的样品制备过程。
HiiKAoNiKAca
1范围
GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012纳米技术特定毒性筛查用金纳米颗粒表面表征傅里叶变换红外光谱法本标准规定了测试纳米材料细胞毒性实验前后鉴别干燥金纳米颗粒薄膜中表面结合分子的傅里叶变换红外光谱法（FT-IR）。
注1：金纳米颗粒在测试之前表面可能已经结合了配体，在细胞毒性测试过程中也可能额外覆盖（或包覆）有机或生物分子。
注2：采用傅里叶变换红外光谱法分别检测磷酸二酯、胺或脂质的有关吸收谱带，可以分别确定结合在金纳米颗粒上的核酸、氨基酸、脂质或细胞膜的成分，但核酸、蛋白质或脂质的类型不能通过红外光谱具体确定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件ISO/TS27687纳米科技纳米物体的术语和定义纳米颗粒、纳米纤维和纳米片（Nanotechnologies-Terminology and definitions for nano-objects-Nanoparticle,nanofibre and nanoplate)3术语和定义
ISO/TS27687界定的以及下列术语和定义适用于本文件。为了便于使用，以下重复列出了ISO/TS27687中的一些术语和定义。3.1
衰减全反射模式attenuatedtotalreflectionmodeATR模式
一种仪器工作模式，在该模式下红外光在晶体内的人射角要大于临界角注：红外光在晶体的上表面被完全反射，其强度由于覆盖在晶体上表面材料的吸收而衰减。吸收的红外光频率用来确定化学基团，吸光度用于确定化学基团的数量3.2
透析dialysis
小分子或离子通过薄膜扩散与溶液中的大分子或悬浮物分离的过程。［ISO6107-2：2006，定义38]
傅里叶变换红外光谱Fouriertransforminfrared spectroscopy；FT-IR基于样品中化学基团对红外辐射的吸收，以鉴别和定量化学基团的一种分析化学技术。3.4
检出限limit of detection
根据给定的测量程序得到的测量值，β为由测量值漏报某种成分的概率，α为误报的概率。1
-iiKAoNniKAca
GB/T36082—2018/IS0/TS14101:2012注1：引自ISO/1EC指南99：2007.定义4.18注2：根据IUPAC推荐，α和β值均取0.05，重复5次空白实验标准偏差的2.776倍即为LOD注3：参见ISO17191。
limit of quantification;LOQ
定量下限
被测样品在可接受的准确度和精密度下能检测到的最低值。注1：LOQ可以确定为光度噪声标准偏差的10倍值，对于最小信号水平A将给出相对精确度A/A≤10%注2：参见参考文献[24]。
molecular weight cut-off value;MWCO截留分子质量
经过16h的透析后，截留量超过90%以上溶质的分子质量。注：参见参考文献[25]和[26]。3.7
纳米物体
nano-object
一维、二维或三维外部维度处于纳米尺度的物体。注：用于所有相互分离的纳米尺度物体的通用术语，［ISO/TS27687：2008.定义2.2
nanoparticle:NP
纳米颗粒
三个外部维度都在纳米尺度的纳米物体。注：如果纳米物体最长轴和最短轴的长度差别显著（大于3)时，用纳米棒或纳米片来表示纳米颗粒[ISO/TS276872008.定义4.1]
纳米尺度
nanoscale
处于1nm～100nm之间的尺寸范围。注1：本尺寸范围通常、但非专有地表现出不能由较大尺寸外推得到的特性。对于这些特性来说，尺度上，下限值是近似的。
注2：本定义中引人下限（约1nm)的目的是为了避免在不设定下限时，单个或一小簇原子被默认为是纳米物体或纳米结构单元。
[ISO/TS27687：2008.定义2.1]
预检（合格的）蒸馏水pre-testeddistilledwater；Dw经过FT-IR检测，证实不含红外吸收杂质的有效蒸留水。3.11
relative centrifugal force;RCF相对离心力
相对于地球重力的加速度力。
表面等离激元共振带
surface plasmon resonance band;SPR由固体表面附近区域内的电子集体振荡产生的吸收的光的频率范围。注：SPR发生在金属薄膜或金属纳米颗粒中4符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。2
HiiKAoNiKAca
AuNP：金纳米颗粒
IR：红外
MW：分子质量
SCM：含血清的介质
UV/Vis：紫外/可见
g：地球的重力加速度，作为相对离心力的一个参考单位5样品制备
去除未结合的分子
5.1.1通则
GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012由于FT-IR吸收光谱测量的是样品膜中所有分子，所以在制备样品膜前，除溶剂外，所有未结合的红外活性分子都需要从溶液中去除，以便正确检测结合在金纳米颗粒表面的分子。5.1.2透析
透析是一种采用合适的截留分子质量的膜将未结合分子与金纳米颗粒有效分开的方法。正确使用时，透析膜可以按照样品和透析液的体积比来降低透析后未结合分子的浓度，一般情况下可截留90%以上的纳来颗粒。建议截留分子质量小于被保留物质分子质量的一半，大于穿过透析膜物质分子质量的3倍。由于透析膜的效率取决于分子的电荷和形状，透析膜去除未结合分子的效率应在分离金纳米颗粒和未结合分子之前进行验证。在效率测试前，需要对透析膜进行测试，看它是否存在红外吸收杂质。杂质测试流程如下：
a）将0.5mL～3mL的DW装人透析袋中。将装有DW的透析袋用合适的夹子封好，在DW（体积≥600mL)水浴中透析16h。b）
使用溶剂浸湿的棉签清洁ATR晶体或IR窗片的表面。c）
从透析袋中取出所需体积（2μL或≥200μL)的液体d）
注：ATR方法使用2μL，透射方法使用量≥200μL。将所取液体滴在ATR晶体或IR窗片上，在脱水室中干燥（见5.2），这一过程称为滴干。e
采用6.2或6.3的程序测试溶解在所取液体中任何潜在杂质的FT-IR光谱。g)
如果在关注的频率范围内红外谱带没有高出检出限，则认为透析膜没有红外活性杂质。这种无红外活性杂质影响的膜可用于透析。检测透析效率的流程如下：a）将0.5mL～3mL仅含有能通过透析膜的分子的溶液装人透析袋中：通过透析膜的分子为交换前和交换后的表面配体，或血清中的生物分子，或键合实验中的细胞提取物：
样品溶液的浓度根据表面配体在纳米颗粒悬浮液可以存在的最大数量设定。这个值可能与交换过程中的配体分子添加量相等，或者由表面的金原子数估计，这可由晶格常数[27]和金纳米颗粒的直径计算得到。配体分子的最大数目是假设在配体之间无空间位阻条件下单层键合时表面上的金原子个数，b）将装有样品的透析袋用合适的夹子封好，在DW（体积≥600mL）水浴中透析16h，从透析袋中取出所需体积（2μL或≥200μL)的样品。c）
在ATR晶体或IR窗片上滴干样品溶液。采用6.2或6.3的程序测样品膜的FT-IR光谱。e)
从水浴中取出所需体积（2μL或≥200μL）的样品。f）
iiiKAoNikAcabZxz.net
GB/T36082—2018/IS0/TS14101:2012在ATR晶体或IR窗片上滴干样品溶液。g）
采用6.2或6.3的程序测试样品膜的FT-IR光谱比较步骤e)和h)得到的光谱。如果两个光谱都没有高于LOD的谱带，提高样品溶液浓度重复测试。由于透析袋和水浴中的样品在经过适当透析后具有相同的组分，所以如果它们的谱带都高于LOD并且强度在测试不确定度范围内相等，则认为膜是有效的。5.1.3离心
离心法可以用于分离金纳米颗粒与未结合的分子，尤其是当未结合的分子的分子质量太大找不到合适的截留分子质量透析膜时。离心速度不足将导致金纳来颗粒悬浮在上清液中，这可以从使用紫外/可见吸收光谱观察到的SPR谱带吸收来确定。离心速度过高将导致未结合的分子沉降。在使用离心方法进行FT-IR分析时，要确保溶液中重新悬浮的金纳米颗粒有足够的浓度。紫外/可见吸收光谱的SPR谱带能提供有效沉降和重新悬浮的信息。如果未结合分子的吸收谱能从SPR吸收区中排除，聚集/团聚程度则可通过金纳米颗粒的SPR吸收带变宽来估计。为了保证金纳米颗粒有效地沉降而不受未结合分子的干扰，确定离心力和离心时间组合的程序如下：
将1mL的金纳米颗粒溶液置于2mL的微量离心管中。采用表1中推荐的离心力和离心时间离心沉降金纳米颗粒。b）
尽可能多地移走管中的上清液.而不扰动沉积物；以DW为参比测量400nm～750nm范围内c
上清液的紫外/可见吸收光谱：
在探讨未结合分子的吸收情况时，检查金纳米颗粒的SPR谱带是否出现。d）如果SPR谱带的吸光度最大值高于0.05，即紫外/可见光谱定量分析的低限2，增加离心力或离心时间20%，重复步骤a）～c)[28]。如果SPR谱带的吸光度最大值低于0.05，沉降所需的离心力和离心时间已经足够。e
表1金纳米颗粒沉降所推荐的相对离心力和离心时间与颗粒直径的函数关系金纳米颗粒直径
样品体积
确定离心力和离心时间上限的程序如下：相对离心力
离心时间
将1mL除了金纳米颗粒外含有所有其他组分的溶液，如交换前后的自由配体溶液、SCM或f
细胞提取物，置于2mL微量离心管中。按照步骤a～e)确定的离心力和离心时间进行离心。g）
h）取1mL不包含任何潜在沉积物的上清液。i
取所需体积（2μL或≥200μL)上清溶液；置于ATR晶体或IR窗片上滴干溶液，并测量FTIR光谱。
振荡离心管中剩余溶液，取所需体积（2μL或≥200μL)剩余溶液，置于ATR晶体或IR窗片j
上滴干溶液，并测量FT-IR光谱
iiiKAoNikAca
GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012k）重复步骤f)～j)三次作为重复性实验；分别对上清液FT-IR光谱（光谱IR-1)和剩余溶液的FT-IR光谱（光谱IR-2)取平均值。比较“光谱IR-1”和“光谱IR-2”；如果“光谱IR-2”中高于定量下限（LOQ)的任何吸收谱带强度D
大于“光谱IR-1”的1.3倍，则应该减小离心力或离心时间以避免未结合分子沉降。如果“光谱IR-2”中高于定量下限（LOQ)的所有吸收谱带强度是“光谱IR-1吸收谱带强度的0.7倍～1.3倍，则离心力和离心时间的上限值确定m）如果由步骤a）～e)确定的离心力和离心时间高于由步骤f)～1)确定的上限值，则离心力和离心时间可以减小，直到上清液SPR吸光度最大值达到0.05时定为下限值。确定离心力和离心时间后，金纳米颗粒将通过以下步骤与未结合分子进行分离：n）将1mL金纳米颗粒溶液置于2mL微量离心管中。根据步骤a）～m)确定的离心力和离心时间沉降金纳米颗粒。o）
在不扰动沉积物的情况下，尽可能多地移走上清液。p）
在沉积物管中加人1mL的DW，振荡离心管30s得到稳定的悬浮物q
重复步骤o）～q)三次。
将步骤r)得到的溶液制备成样品膜用于FT-IR测试。如果在步骤9中得到的金纳来颗粒沉积物由于发生团聚而不能重新悬浮，为了使沉积物有效地重新悬浮，可加人少量的酸或碱：对于胺类功能化的金纳米颗粒，在步骤q)后加150μL浓度为1mol/L的HCl溶液到1mL金纳米颗粒的悬浮液中，再次振荡30s；对于羧酸盐功能化的金纳米颗粒，在步骤q)后加150μL浓度为1mol/L的NaOH溶液到1mL金纳米颗粒的悬浮液中，再次振荡30s；—这些添加物在步骤1)中被洗掉。5.2脱水干燥
水对红外光有强的吸收，样品膜应脱水。为了在ATR晶体或IR窗片上制备干燥的金纳米颗粒膜，应避免污染，应该按照下列程序做空白实验进行验证：a）测量在脱水室中金纳米颗粒溶液完全脱水所需的时间。脱水室可以是（真空）烘箱或（真空）干燥器。在使用真空烘箱或干燥器时，真空泵要选无油型，或者在干燥室和真空泵之间配备冷阱。
在金纳米颗粒脱水过程中，将空白的ATR晶体或IR窗片放在脱水室中。b)
测量通过空白ATR晶体或IR窗片的IR单光束光谱。c）
用高纯度异丙醇湿棉签清洁ATR晶体或IR窗片表面。测量通过清洁后的ATR晶体或IRd）
窗片的IR单光束光谱。
计算在脱水干燥室中干燥过的ATR晶体或IR窗片的FT-IR光谱e
如果在所关心的频率区域内没有出现高于LOD的红外谱带，则脱水过程没有引进红外活性杂质。否则需要找出杂质的来源，而且在重复步骤b）～e)时，将红外谱带吸光度降到LOD以下。
5.3样品管释放到蒸馏水中的杂质筛选实验些锥形管或微量离心管在装有蒸馏水超过几分钟后，会释放出烃类杂质；虽然这些杂质的吸光度值非常低（<10-3），但它会严重影响对金纳米颗粒表面配体的分析，因为金纳米颗粒本身的FT-IR吸光度值也可能非常低。最好避免使用释放烃类杂质的样品管。在检测来自样品管的杂质前，要检测蒸馏水是否含有杂质。蒸馏水的杂质检测流程如下：5
GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012取所需体积（2μL或≥200μL)的蒸馏水；a)
b）在ATR晶体或IR窗片上滴干的蒸馏水：测试通过ATR晶体或IR窗片的IR单光束光谱（见6.2或6.3）；c）
用高纯度异内醇湿棉签清洁ATR晶体或IR窗片表面，测量通过清洁后的ATR晶体或IR窗片的IR单光束光谱；
计算滴十的蒸馏水的FT-IR光谱：如果在所关心的频率区域内没有出现高于LOD的红外谱带，那么所用的蒸馏水不含红外活性杂质，这种蒸馏水称作\预检（合格的）蒸馏水（DW）”。否则需要找出杂质的来源，而且再重复步骤a)～e)时，将红外谱带吸光度降到LOD以下。在证实蒸馅水不含杂质后，来自样品管的FT-IR活性杂质对蒸馏水的污染可通过以下步骤测试样品管（微量离心管或锥形管）中加人DW至80%体积：a）
盖上盖子，振荡样品管30s；
蒸馏水在样品管中保留30min以上；d）
从样品管中取所需体积（2μL或≥200uL)的液体；在ATR晶体或IR窗片上滴干样品液体；e)
测量存放在样品管中的蒸馏水潜在杂质的FT-IR光谱（见6.2或6.3）；如果在所关心的频率区域内没有出现高于LOD的红外谱带，说明样品管不含红外活性杂质，g）
这种样品管称为“预检（合格的）样品管”。否则用DW或高纯度的异丙醇清洗样品管，干燥样品管并重复步骤a）～f）。如果在所关心的频率区域内仍有超过LOD的红外谱带，则使用其他公司提供的样品管，并从步骤a）～f)重复测试。6FT-IR测试程序
6.1通则
在本章中，描述了FT-IR分析的测试过程。可以使用ATR和透射法测试，透射法应使用非水溶性红外透光材料。
6.2ATR方法
ATR方法适用于薄膜定量分析，如溶液制备的金纳米颗粒薄膜。将一定量的金纳米颗粒悬浮液或溶液滴在ATR晶体元件上。溶剂蒸发后，金纳米颗粒或溶剂化分子形成薄膜，其厚度与浓度成正比。假设该膜与晶体保持紧密接触，而且膜的厚度小于ATR晶体表面隐失波的穿透深度，则测得的吸收信号正比于薄膜厚度。因为溶液中金纳米颗粒的浓度通常很低（<1umol/L），溶液制备的样品膜是非常薄的（厚度1um）。推荐使用ZnSe或金刚石作为ATR晶体材料，并具有2mm左右直径的圆形有效检测区域。这些材料是用作R窗片的很好材料：因为它们是非水溶性的，并且在红外区域具有高透过性。
使用ATR模式的主要优点之一是，由于ATR晶体有效区域小，FT-IR测试所需样品体积很小（约2uL）。使用ATR方法得到的FT-IR光谱吸收图形不能直接与采用透射方法得到图形进行比较，因为光在ATR晶体表面的穿透深度与其频率有关。然而，使用ATR方法得到的FT-IR光谱，如果和用同样的方法获得的光谱进行比较，并且在不超出方法的线性范围时，可以提供定量信息。将背景于扰降到最小，采用ATR方法进行FT-IR光谱测量的程序如下：a）打开FT-IR光谱仪，开启干燥氮气（N）气源，吹扫红外光学台光路。然后预热和吹扫仪器60min以上。充分吹扫所需时间应根据6.4中吹扫测试程序确定。通常建议将仪器一直保持在开机状态以维持仪器稳定。
GB/T36082—2018/ISO/TS14101:2012如果需要，使用液氮（N。）或设备附带的其他冷却系统冷却红外探测器。建议使用在6.4程序b)
中验证的持续时间内，能提供LOD至少为3.0X10-4吸光度单位的探测器。确认仪器已经稳定。
d）用高纯度异丙醇湿棉签清洁晶体。e）
在晶体上滴干样品。
测试样品单光束光谱，记录分辨率和测试所用时间。g）
使用溶剂浸湿棉签在原位清洁晶体。测试背景的单光束光谱。
从背景和样品单光束光谱计算样品的吸收光谱i）
最好先测试样品，后测量背景，因为这样时间间隔更短，并且不需移开晶体。6.3透射方法
高压压出来的锭片经常用在FT-IR光谱测量的透射方法中，然而锭片形态引起的背景变化会严重干扰金纳米颗粒的红外弱吸收。在制备透射方法测试所用的样品时，推荐在非水溶性、透红外光的窗片上制备脱水样品膜。从背景稳定性考虑，这种方法比锭片法得到的结果更可靠。利用透射法进行FTIR光谱测定的过程如下：
a）打开FT-IR光谱仪，开启干燥氮气（N2）气源，吹扫红外光学台光路。然后预热和吹扫仪器60min以上。充分吹扫所需时间应根据6.4中吹扫测试程序确定。通常建议将仪器一直保持在开机状态以维持仪器稳定。
b）如果需要，使用液氮（N2）或设备附带的其他冷却系统冷却红外探测器。建议使用在6.4程序中验证的持续时间内能提供LOD至少为3.0X10-4吸光度单位的探测器。c)
确定仪器已经稳定。
用高纯度异丙醇湿棉签清洁IR窗片。d）
在IR窗片上滴干样品
测量样品单光束光谱，记录分辨率和测试所用时间。取下IR窗片，利用溶剂浸湿棉签擦掉样品膜h）
测量背景的单光束光谱
从背景和样品单光束光谱计算样品的吸收光谱尽可能使用样品穿梭器取代步骤g）和h），样品穿梭器上可以安装两个窗片，分别用于样品和背景测量：
仪器配备样品穿梭器后，在测试样品和背景的单光束光谱过程中，红外光束方向的吹扫气氛保持稳定；
一在这种情况下，背景单光束光谱应采用清洁的、和制备样品膜所用窗片的材料和形状相同的空白窗片来进行测量；
分别测试样品空白窗片和背景空白窗片的红外吸收光谱，从样品的吸收光谱中减去这两个光谱的差谱
6.4充分吹扫所需时间的确定
6.4.1通则
即使在气态，FT-IR方法仍可以非常灵敏地检测分子化合物，所以需要吹扫红外光路，避免空气中水汽、二氧化碳和其他可能杂质的干扰。可以采用流动的干燥氮气（N，）吹扫红外光经过的整个区间。不充分的吹扫通常会在水汽和二氧化碳区出现红外谱带，这是由于测量样品和背景光谱时这些分子存7
GB/T36082—2018/IS0/TS14101:2012在浓度差。因此，在测量红外单光束光谱之前，应该确定充分吹扫所需的时间。充分吹扫所需时间应按照以下程序确定。
6.4.2ATR方法
ATR方法如下：
a）在提供干燥氮气进入仪器吹扫人口的同时，将清洁的ATR晶体放置在仪器晶体位置处。采集ATR晶体反射的红外单光束光谱作为背景。b）
等待预先设定的吹扫时间，例如10min。预先设定的时间最好和日常分析中样品和背景测试c）
之间的时间间隔相同。
采集ATR晶体反射的红外单光束光谱作为样品信息；计算清洁的ATR晶体的FT-IR吸收d）
光谱。
e）丝
继续等待预先设定的时间间隔，例如10min，和c)相同，进行进一步吹扫f)
采集ATR晶体反射的红外单光束光谱作为样品信息：计算清洁的ATR晶体的FT-IR吸收光谱。
g）比较由最后两次测量所获得的光谱：如果在整个波长范围内，这两个红外光谱吸收谱带均小于LOD，则充分吹扫所需时间确定为直到前一次测量的吹扫时间；否则，重复步骤b)～g)，直到在整个光谱范围内最后两次测量所得红外光谱吸收谱带在LOD内一致。
6.4.3透射方法
透射方法如下：
在提供干燥氮气进入仪器吹扫人口的同时，将清洁的R窗片放置在仪器窗片位置处b）
采集穿过IR窗片的单光束光谱作为背景。等待预先设定的吹扫时间，例如10min。预先设定的时间最好和日常分析中样品和背景测试c）
之间的时间间隔相同。
采集通过IR窗片的红外单光束光谱作为样品信息；计算清洁的IR窗片的FT-IR吸收光谱。d）
继续等待预先设定的时间间隔，例如10min，和c)相同，进行进一步吹扫e)
采集通过IR窗片的红外单光束光谱作为样品信息；计算清洁的IR窗片的FT-IR吸收光谱。比较由最后两次测量所获得的光谱：g
如果在整个波长范围内，这两个红外光谱吸收谱带均小于LOD，则充分吹扫所需时间确定为直到前一次测量的吹扫时间：否则，重复步骤b)一g），直到在整个光谱范围内最后两次测量所得红外光谱吸收谱带在LOD内一致。
6.5红外谱带的强度对浓度的线性范围为了进行定量分析，需要确定特定振动模式的红外谱带吸光度对金纳米颗粒浓度的线性范围；因为分子振动频带的吸光度可能会在分子与金纳米颗粒结合后发生改变，所以这里的定量不是对与金纳米颗粒结合的配体数量进行定量，而只是对谱带强度进行定量。当红外谱带强度对浓度的线性关系建立后，就有可能通过测量相关的谱带强度，确认配体交换程度（见7.1）。通过分别测量由一系列金纳米颗粒稀溶液制备的样品膜的红外谱带强度，可以得到配体的交换程度。确定红外谱带强度对浓度的线性范围的实验程序如下：
a）取所需体积（2μL或≥200μL)的样品，在ATR晶体或IR窗片上滴干溶液；8
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