GB∕T 37873-2019 合成基因质量评价通则 GB∕T37873-2019 标准压缩包解压密码：www.bzxz.net

ICS03.120
中华人民共和国国家标准
GB/T37873—2019
合成基因质量评价通则
General assessment of quality evaluation for synthesized genes2019-08-30发布
国家市场监督管理总局
中国国家标准化管理委员会
2019-08-30实施
规范性引用文件
术语和定义
质量要求
完整性
序列一致性
评价方法
样品与试剂
纯度检测
总量检测
完整性检测
序列一致性检测
附录A（资料性附录）
附录B（资料性附录）
合成基因电泳图
琼脂糖凝胶电泳检测方法
GB/T37873—2019
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家标准物质研究中心提出并归口。GB/T37873—2019
本标准起草单位：深圳华大生命科学研究院（原深圳华大基因研究院）、中国计量科学研究院、深圳华大基因科技有限公司、青岛华大基因研究院。本标准主要起草人：王云、王晶、沈玥、傅博强、赵宏翠、龚剑辉、陈泰、刘心、杜佳婷、谢强、牛春艳。m
1范围
合成基因质量评价通则
本标准规定了合成基因的术语和定义、质量要求、评价方法GB/T37873-—2019
本标准适用于基于生物化学合成的合成基因(100bp～20kb)DNA的质量评价。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T34796—2017水溶液中核酸的浓度和纯度检测紫外分光光度法
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
synthesizedgene
合成基因
用生物化学方法，按照设定的核苷酸序列人工合成的双链DNA，3.2
DNA测序DNAsequencing
对DNA分子的核昔酸排列顺序的测定，也就是测定组成DNA分子的A、T、G、C的排列顺序。常用的方法有桑格-库森法和马克萨姆-吉尔伯特法等。［JJF1265—2010，定义5.17]
fsequence alignment
序列比对
比较两个或两个以上核苷酸或者氨基酸序列间相似性的过程『GB/T29859—2013.定义2.2.174质量要求
4.1总则
合成基因的DNA序列，在符合国际基因合成联盟（IGSC)生物安全要求条件下，其质量要求，包括DNA纯度、总量、完整性与序列一致性。4.2纯度
在pH值为7.0～8.5条件下，OD260/OD28的比值在1.8～2.0之间，且OD260/OD230≥2.0，符合GB/T34796—2017中8.3.2的要求。4.3总量
合成基因DNA的总质量，不低于客户需求。一般不低于1ug。1
GB/T37873—2019
4.4完整性
合成基因DNA完整性，反映了合成基因DNA的降解情况。经琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图中明亮条带大小与目标条带一致，且亮度集中程度高，明亮条带间的亮度低，表明DNA完整性高。合成基因主要包括线性的合成基因片段与环状的合成基因质粒两种类型，要求如下：a）合成基因片段：条带单一，无其他杂质条带；b）合成基因质粒：存在目标条带且条带明亮。酶切后，存在与合成基因DNA大小一致的条带，参见附录A。
序列一致性
合成基因DNA的测序序列与设定序列完全匹配5评价方法
5.1样品与试剂
5.1.1样品
基于生物化学合成的合成基因样品，应于一20℃贮存。5.1.2试剂
实验室使用的试剂为不含DNA酶的分析纯化学试剂或生化试剂。实验室配制的试剂应有明晰标识，包括试剂名称、浓度、配制时间等。5.2
纯度检测
采用分光光度法测定合成基因DNA的OD26、OD280OD230。OD26测量值范围应为0.05~1.0；当不在此范围时，应对合成基因DNA溶液进行稀释或浓缩，以达到检测值范围。首先用溶解合成基因样品相同的缓冲液（如去离子水、TE缓冲液）校正紫外分光光度计，分别在230nm、260nm和280nm波长下调零。取2μL样品，测定230nm、260nm和280nm波长下吸光值。根据测量值计算260nm光密度与280nm光密度的比值（OD260/OD2g）和260nm光密度与230nm光密度的比值（OD2s0/OD230）。
在分光光度纯度分析中，核酸在260nm处达到最大吸收峰，蛋白质、其他多糖杂质分别在280nm和230nm处有最大吸收峰，根据OD2/ODz8和ODz60/OD23a的值估计DNA样品的纯度。高纯度DNA的OD260/OD28值为1.8～2.0，OD260/OD230大于或等于2。5.3总量检测
根据分光光度计测得的OD260，按照式（1)计算样本中DNA的质量浓度（o），按照式（2)计算样本中DNA总质量（m）。
p=ODzaXNXF
式中：
p—DNA的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；N—样本稀释倍数；
F——转换因子，双链DNA转换因子为50μg/mL。m=pxv
·（2)
式中：
DNA总质量，单位为微克（ug）)；DNA的质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；p
V样本体积，单位为毫升（mL）。5.4
完整性检测
GB/T 37873—2019
对合成基因DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并使用凝胶成像系统进行结果分析，参见附录B。利用限制性核酸内切酶对合成基因DNA进行酶切鉴定。5.5
序列一致性检测
对合成基因DNA样品进行测序分析，得到合成基因的序列信息，并与设定序列进行序列比对，形成测序结果比对图。
GB/T37873—2019
合成基因电泳图见图A.1~图A.2。Mlancl
附录A
（资料性附录）Www.bzxZ.net
合成基因电泳图
Mlancl
Mlanei
23 130
图中所示为不同长度质粒DNA的电泳图，其中a)图中lanel样品为载有～2kb长度合成基因的质粒DNA；b)图中lanel样品为载有～5kb长度合成基因的质粒DNA；c)图中lanel样品为载有～8kb长度合成基因的质粒DNA；d)图中lanel样品为载有～13kb长度合成基因的质粒DNA。图中的“M\表示LambdaDNA/HindIMarker。注：在质粒提取过程中，由于机械力、酸碱度、试剂等原因，可能使质粒DNA链发生断裂，所提取的质粒通常呈现三种构型，包括超螺旋质粒DNA、线性质粒DNA、开环质粒DNA图中明亮的条带为超螺旋质粒DNA，较暗条带为开环质粒DNA；a)
b）图中明亮条带为开环质粒DNA；c)
和d)图中明亮条带为开环质粒DNA，较暗条带为线性质粒DNA。图A.1
质粒DNA电泳图（1%琼脂糖凝胶）Mlanel
毅休NA
合成莱NA
心557
Mlaunei
载称NA
个成基因LNA
Mlunel
合吨因DNA
体DNA
图中所示为载有不同长度合成基因的质粒酶切电泳图，其中a)图中lanel样品为合成基因DNA长约246bp.载体DNA长约3.1kb的质粒酶切DNA；b)图中lanel样品为合成基因DNA长约1.7kb，载体DNA长约2.7kb的质粒酶切DNA；c)图中lanel样品为合成基因DNA长约6.1kb，载体DNA长约2.1kb的质粒酶切DNA。图中的M\表示DNAMarker，其中a)图中为25obp-DNAladder，b)，c)图中为LambdaDNA/HindⅢMarker。图A.2
2合成基因酶切电泳图（1%琼脂糖凝胶）4
B.1凝胶制备
B.1.1琼脂糖凝胶配制
附录B
（资料性附录）
琼脂糖凝胶电泳检测方法
GB/T37873—2019
按表B.1选择凝胶浓度，计算后称取相应质量的琼脂糖，放人锥形瓶中，加入适量的1×TAE电泳缓冲液。置于微波炉中加热至完全溶化·加人核酸染料（如溴化乙锭等）。水平放置托盘于制胶模具内：在一端插好梳子，缓慢倒入已冷至60℃左右的胶液，使之形成均匀水平的胶面。凝胶凝固后，缓慢拔起梳子，放进电泳槽内，使加样孔端置于阴极端。在槽内加入1XTAE电泳缓冲液直至液面覆盖过胶面。
琼脂糖凝胶电泳分离范围
琼脂糖凝胶浓度/%
凝胶孔加样
可分辨的线性DNA大小范围/kb
把待检测样品，按以下量混匀，用移液枪加至凝胶的加样孔中。1μL加样缓冲液（6×）+5μL待测DNA样品（总量100ng~500ng）。B.2
凝胶电泳
接通电泳仪和电泳槽并接通电源，调节稳压输出，电压最高不超过5V/cm，开始电泳。点样端放阴极端。当溴酚蓝移动至距胶板前沿约1cm处，即可停止电泳B.3
电泳成像
将凝胶放在凝胶成像系统内的样品台，关上样品室外门，打开程序，调整清晰度等参数，拍照留存。B.4结果分析
利用凝胶成像系统软件分析目标DNA条带大小，并判断区分合成基因条带。
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