标准号：GB 31660.7-2019 标准名称：猪组织和尿液中赛庚啶及可乐定残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 英文名称：Determination of cyproheptadine and clonidine residues in pig tissues and urine by Iiquid chromatogr aphy-tandem mass spectrometry method 标准格式：PDF 发布时间：2019-09-06 实施时间：2020-04-01 标准大小：538K 标准介绍：1范围 本标准规定了猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定的制样和液相色谱-串联质谱测定方法， 本标准适用于猪肌肉、肝脏、肾脏及尿液中赛庚啶和可乐定残留量的检测。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适 用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GBT6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 组织试样中残留的赛庚啶或可乐定，用酸性乙腈提取，液相色谱-串联质谱测定，内标 法定量。尿液中残留的赛庚啶或可乐定，经酸化、固相萃取柱浄化，液相色谱-串联质谱测 定，内标法定量 4试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GBT6682规定的一级水 4.1试剂 41.1甲醇(CHOH)：色谱纯。 41.2乙腈(CH3CN)：色谱 41.3甲酸( HCOOH)：色谱 414氨水(NHOH)。

中华人民共和国国家标准
GB 31660.72019
食品安全国家标准
猪组织和尿液中赛庚啶及可乐定残留量的测定、液相色谱-串联质谱法
National food safetystandard-Determination of cyproheptadine and clonidine residues in pig tissuesand urine by Iiquid chromatography-tandem mass spectrometry method2019-09-06发布bzxz.net
中华人民共和国农业农村部
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2020-04-01实施
本标准系首次发布。
GB31660.7—2019
1范围
食品安全国家标准
GB31660.7—2019
猪组织和尿液中赛庚啶及可乐定残留量的测定液相色谱-串联质谱法
本标准规定了猪组织和尿液中赛庚啶和可乐定的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。本标准适用于猪肌肉、肝脏、肾脏及尿液中赛庚啶和可乐定残留量的检测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682
3原理
分析实验室用水规格和试验方法组织试样中残留的赛庚啶或可乐定，用酸性乙睛提取，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。尿液中残留的赛庚啶或可乐定，经酸化、固相萃取柱净化，液相色谱-串联质谱测定，内标法定量。
4试剂和材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1试剂
4.1.1甲醇（CH,OH）：色谱纯。4.1.2乙腈（CH3CN）：色谱纯。4.1.3甲酸（HCOOH）：色谱纯。4.1.4氨水（NH4OH）。
4.1.5盐酸（HCI）。
4.1.6硫酸镁（Mg2SO4）。
4.1.7氯化钠（NaCI）。
4.2溶液配制
4.2.11mol/L盐酸溶液：取盐酸90mL，用水稀释至1000mL。1
4.2.21%甲酸乙腈溶液：取甲酸5mL，用乙晴稀释至500mL4.2.30.1%甲酸溶液：取甲酸1mL，用水稀释至1000mLGB31660.7—2019
4.2.4乙-0.1%甲酸溶液：取0.1%甲酸溶液80mL，加乙腈至100mL，混匀4.2.55%氨水甲醇溶液：取氨水5mL，用甲醇稀释至100mL。4.3标准品
4.3.1盐酸赛庚啶（Cyproheptadinehydrochloride,C2iH2iN·HCl,CAS号：969-33-5）、盐酸可乐定（Clonidinehydrochloride,C,HioCl,N3，CAS号：4205-91-8）：含量均≥98.0%。4.3.2内标：盐酸二苯拉林（Diphenylpyraline,C,H/3NO·HCl,CAS号：61-76-7）、盐酸可乐定-D4（Clonidine-D4hydrochloride,C,H.D4Cl,N）：含量均≥98%。4.4标准溶液制备
4.4.1标准储备液（1mg/mL）：取盐酸赛庚啶、盐酸可乐定、盐酸二苯拉林和盐酸可乐定-D4标准品各约10mg，精密称定，分别于10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，配制成浓度分别为1mg/mL的盐酸赛庚啶、盐酸可乐定、盐酸二苯拉林和盐酸可乐定-D4标准贮备液。4℃下保存，有效期6个月。4.4.2混合标准工作液（10μg/mL）：分别精密量取盐酸赛庚啶和盐酸可乐定标准贮备液各1mL，于100mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，制成浓度为10μg/mL的盐酸赛庚啶和盐酸可乐定标准工作液。4℃下保存，有效期3个月。4.4.3混合内标中间液：分别精密量取盐酸二苯拉林储备液100μL、盐酸可乐定-D4储备液1mL，于100mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，配制成含盐酸二苯拉林1μug/mL和盐酸可乐定-D410ug/mL的混合内标中间液。于4℃下保存，有效期1个月。4.4.4混合内标工作液：精密量取混合内标中间液1mL，于10mL量瓶中，用乙睛-0.1%甲酸溶液稀释至刻度，配制成含盐酸二苯拉林100ng/mL和盐酸可乐定-D41ug/mL的混合内标工作液，临用现配。
4.4.5标准曲线制备：精密量取混合标准工作液和混合内标工作液适量，用乙睛-0.1%甲酸溶液稀释成赛庚啶和可乐定浓度为0.5、1、10、50和100ug/L系列混合标准工作液，其中含盐酸二苯拉林的浓度和盐酸可乐定-D4的浓度分别为5μg/L和50ug/L，临用现配。4.5材料
4.5.1C18粉：碳载量25.0-28.0。4.5.2混合型强阳离子固相萃取柱，60mg/3mL或相当者。2
4.5.3滤膜：0.22μm，水相。
仪器和设备
液相色谱一串联质谱仪：配电喷雾电离源。分析天平：感量0.00001g和0.01g。5.2
均质机。
冷冻离心机：8000r/min以上。
涡旋振荡器。
氮吹仪。
固相萃取装置。
pH计。
离心管：50mL。
试样的制备与保存
试料的制备
6.1.1猪肌肉、肝脏、肾脏
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎并使均质。取均质的供试样品，作为供试试料。取均质的空白样品，作为空白试料。GB31660.7—2019
取均质的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.1.2猪尿样
取适量新鲜或解冻的空白或供试猪尿，使用前恢复室温，混匀，如有混浊，离心后取上清液备用。
取备用的供试样品，作为供试材料。一取备用的空白样品，作为空白材料。取备用的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2
2试料的保存
-20℃以下保存。
测定步骤
7.1提取
7.1.1组织样品
GB31660.72019
取试料2g（准确至土20mg），于50mL离心管中，加50μL混合内标工作液，猪肌肉试样加Ci8粉0.5g，肝脏、肾脏加硫酸镁3.0g、氯化钠2.0g，振荡混匀，加1%甲酸乙腈10mL，充分振荡，于8000r/min离心5min，取上清液，于离心管中，50℃水浴氮气吹干。加乙睛-0.1%甲酸溶液1.0mL使溶解，0.22um滤膜滤过，液相色谱-串联质谱仪测定。7.1.2尿样
取试料5.0mL，于50mL离心管中，加50μL混合内标工作液，用1mol/L盐酸调pH小于2，涡旋混匀，8000r/min4℃离心10min，将全部上清液转移至另一50mL离心管中，备用。
7.2净化
尿样：取固相萃取柱，依次用甲醇、水各3mL活化。取备用液全部过柱，用0.1%甲酸溶液3mL和甲醇3mL依次淋洗，抽干2min，用5%氨水甲醇溶液3mL洗脱，收集洗脱液，于50℃水浴氮气吹干，用乙腈-0.1%甲酸溶液1.0mL溶解，0.22um滤膜滤过，液相色谱-串联质谱仪测定。
7.3测定
7.3.1色谱条件
a）色谱柱：Cis（100mm×2.1mm，1.8um），或相当者：b）柱温：30℃；
c）进样量：10μL；
d）流速：0.3mL/min
e）流动相：A：乙腈；B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序
时间min
7.3.2质谱条件
a）离子源：电喷雾离子源：
b）扫描方式：正离子扫描：
c）检测方式：多反应监测：
d）离子源温度：150℃：
e）脱溶剂温度：500℃；
f)毛细管电压：3.0V：
g）定性离子对、定量离子对、锥孔电压和碰撞能量见表2。80
GB31660.72019
表2药物的定性、定量离子对及锥孔电压、碰撞电压的参考值药物
赛庚啶
二苯拉林
可乐定
可乐定-D4
7.4测定法
7.4.1定性测定
定量离子对
288.1 > 191.0
282.1 >115.9
230.0>212.8
234.0>216.8
定性离子对
288.0>191.0
288.0>215.0
282.1>115.9
230.0>159.7
230.0>212.8
234.0>216.8
锥孔电压
碰撞能量
在同样测试条件下，试样液中赛庚啶和可乐定的保留时间与标准工作液中相应的保留时间之比，偏差在±5%以内，且检测到的离子的相对丰度，应当与浓度相当的校正标准溶液相对丰度一致。其允许偏差应符合表3要求。表3定性确证时相对离子丰度的最大允许误差5
相对离子丰度
允许的最大偏差
7.4.2定量测定
>20%至50%
>10%至20%
GB31660.7—2019
≤10%
取试样溶液和标准溶液，作单点校准，按内标法定量。标准溶液及试样溶液中的化合物组份及内标的响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，赛庚啶、可乐定及内标标准溶液特征离子质量色谱图见附录A。7.5空白试验
除不加试料外，采用完全相同的步骤进行平行操作。8结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按式（1）～（2）计算：组织样品：
X= A×Ais×C,×Cs×V
As×AsxCis×m
尿液样品：
X= 4×As×C,×Cs×
As×As×Cis×V
式中：
X一试样中赛庚啶或可乐定残留量，单位为微克每千克（ug/kg）或微克每升（μug/L）：Cis一试样溶液中赛庚啶或可乐定对应内标物浓度，单位为微克每升（ug/L）；Cs一混合标准工作液中赛庚啶或可乐定浓度，单位为微克每升（ug/L）；Cis一混合标准工作液中赛庚啶或可乐定对应内标物浓度，单位为微克每升（μug/L）：A一试样溶液中赛庚啶或可乐定峰面积；Ais一试样溶液中赛庚啶或可乐定对应内标物峰面积As一混合标准工作液中赛庚啶或可乐定峰面积；Ais一混合标准工作液中赛庚啶或可乐定对应内标物峰面积；V一溶解残余物所用溶液体积，单位为毫升（mL）；m一供试样品质量，单位为克（g）。Vm一供试尿样体积，单位为毫升（mL）；a
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计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字，检测方法灵敏度、准确度和精密度9.1
灵敏度
本方法的猪肌肉、肝脏和肾脏中赛庚啶和可乐定检测限为0.5ug/kg，定量限为1ug/kg，猪尿中赛庚啶和可乐定检测限为o.5ug/L，定量限为1ug/L。2准确度
本方法在猪肉、猪肝和猪肾中1～10μg/kg、猪尿中1～10ug/L添加浓度水平上的回收率60%~120%。
3精密度
本方法批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤30%。7
附录A
（资料性附录）
特征离子质量色谱图
TITTTTT
TTTTTTTTTT
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2: mRM of 3 Channels Es+
234 216.8 (CI0-D4)
1: mRM of 2 Channels Es+
230>212.8 (CLO)
3: MRM of 2 Channels Es+
282.1 115.9 (DPP)
TTTTTT
4: MRM of 2 Channels Es+
288> 191 (CYP)
m Time
图A.1赛庚啶、可乐定及内标标准溶液特征离子质量色谱图（10μg/L）1-赛庚啶特征离子质量色谱图（288.0>191.0）2-二苯拉林特征离子质量色谱图（282.1>115.9）3-可乐定特征离子质量色谱图（230.0>212.8）4-可乐定-D4特征离子质量色谱图（234.0>216.8）8
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