标准号：GB 31660.4-2019 标准名称：动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 英文名称：Determination of megestrol acetate and medroxyprogesterone acetate residues in animal derived foods by liquid chromatography -tandem mass spectrometry 标准格式：PDF 发布时间：2019-09-06 实施时间：2020-04-01 标准大小：420K 标准介绍：本标准规定了动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留检测的制样和液相色谱 串联质谱测定方法 本标准适用于猪、牛、羊肌肉、脂眆、肝脏、肾脏和牛奶中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕 残留量的检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本 适用于本文件，凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件 GBT6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 化，可样线流相即地眼法定左取，正已，最合子柱净 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合(B/682规定的一级水。 4.1.1乙腈(CH2CN)：色谱纯。 4.12甲醇(CH2OH) 4.13甲酸( HCOOH)：色谱纯。 44乙酸(CH3COOH) 45正己烷(CH14 4.1.6乙酸乙酯( CHaCOOC,H) 41,7乙酸铵(CH3 COON4) 2溶液配制

中华人民共和国国家标准
GB31660.42019
食品安全国家标准
动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法National food safety standard-Determination of megestrol acetate and medroxyprogesterone acetateresidues in animal derivedfoods by Iiquid chromatography-tandemmassspectrometry
2019-09-06发布
中华人民共和国农业农村部
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场监督管理总局
2020-04-01实施
本标准系首次发布。
GB31660.42019
食品安全国家标准
GB31660.42019
动物性食品中醋酸甲地字酮和醋酸甲羟孕酮残留量的测定液相色谱-串联质谱法
1范围
本标准规定了动物性食品中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留检测的制样和液相色谱串联质谱测定方法。
本标准适用于猪、牛、羊肌肉、脂肪、肝脏、肾脏和牛奶中醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮残留量的检测。
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理
试样中残留的醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮经乙睛提取，正己烷除脂，混合阳离子柱净化，甲醇洗脱，液相色谱-串联质谱法测定，内标法定量。4试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的一级水。4.1试剂
乙睛（CH3CN）：色谱纯。
甲醇（CH,OH）
甲酸（HCOOH）：色谱纯。
乙酸（CH,COOH）。
正已烷（CeH14）。
乙酸乙酯（CH.COOC,Hs）。
乙酸铵（CH,COONH4）。
溶液配制
GB31660.42019
4.2.10.2mol/L乙酸铵缓冲液：取乙酸铵15.4g，加水900ml使溶解，用乙酸调pH值至5.2加水稀释至1000mL。
4.2.22%甲酸水溶液：取甲酸2mL，加水溶解并稀释至100mL。4.2.30.1%甲酸水溶液：取甲酸1mL，加水溶解并稀释至1000mL。4.2.450%甲醇水溶液：取甲醇50mL，加水溶解并稀释至100mL。4.2.530%甲醇水溶液：取甲醇30mL，加水溶解并稀释至100mL。4.2.60.1%甲酸水乙腈溶液：取0.1%甲酸水溶液20mL，加乙睛溶解并稀释至100mL，混匀。
4.3标准品
醋酸甲地孕酮（Megestrolacetate,C24H32O4,CAS:595-33-5）、醋酸甲羟孕酮4.3.1
（Medroxyprogesteroneacetate,C24H3404,CAS:71-58-9），含量均≥98.0%。4.3.2，内标：氛代醋酸甲地孕酮（megestrolacetate-D3，C24H29D304），含量≥98.0%。4.4标准溶液制备
4.4.1标准贮备液：取醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标准品各约10mg，精密称定，于100ml棕色量瓶中，用乙睛溶解并稀释至刻度，配制成浓度为0.1mg/mL的醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标准贮备液。-20℃保存，有效期6个月。4.4.2内标贮备液：取氛代醋酸甲地孕酮标准品约10mg，精密称定，于100mL棕色量瓶中，用乙睛溶解并稀释至刻度，配制成0.1mg/mL的氛代醋酸甲地孕酮贮备液。-20℃保存，有效期为6个月。
4.4.3混合标准工作液：精密量取醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮标准贮备液各0.5mL，于50mL棕色量瓶中，用乙睛稀释至刻度，配制成浓度均为1μg/mL混合标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
4.4.4内标工作液：精密量取内标贮备液0.5mL，于50mL棕色量瓶中，用乙睛稀释至刻度，配制成浓度为1ug/mL的内标标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。4.4.5标准曲线的制备
精密量取适量混合标准工作液及内标标准工作液，用流动相稀释配制成浓度为2、5、25、50、100ng/mL的系列标准溶液（内标均为20ng/mL）。以特征离子质量色谱峰面积比为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。4.5材料
4.5.1混合阳离子固相萃取柱：60mg/3mL，或相当者。4.5.2，β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶。微孔滤膜：0.22μm
5仪器和设备
液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。分析天平：感量0.00001g和0.01g。氮吹仪。
旋涡混合器：3000r/min
超声波萃取仪。
移液枪：200μL，1mL，5mL。
离心机：10000r/min。
梨形瓶：100mL。
旋转蒸发器。
固相萃取装置。
试料的制备与保存
6.1试料的制备
GB31660.42019
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，绞碎，并使均质。脂肪组织于60℃水浴中融化一一取均质后的供试样品，作为供试试料。一一取均质后的空白样品，作为空白试料。取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试料。6.2试料的保存
-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。7
测定步骤
取试样2g（准确到土20mg），于50mL离心管中，加内标工作液40μuL，加0.2mol/L乙酸铵缓冲液4mL，涡旋混匀后加入β-盐酸葡萄糖醛苷酶/芳基硫酸酯酶40uL，于37℃下避光水浴低速振荡，酶解12h。
2提取
7.2.1肌肉、肝脏、肾脏组织
试样经酶解后，加乙酸乙酯10mL，于旋涡振荡器上剧烈振荡10min，4000r/min离心5min，取上清液至梨形瓶中。残渣加乙酸乙酯10mL重复提取1次，合并上清液，50℃旋转蒸发至干。加乙睛10mL、正已烷5ml使溶解，转至50ml离心管中，低速涡旋10s，3000r/minm
GB31660.42019
离心2min，弃正已烷层，下层液于50℃旋转蒸发至于，加30%甲醇水溶液3mL，溶解，备用。
7.2.2脂肪组织
试样经酶解后，加乙腈10mL，于旋涡振荡器上剧烈振荡0.5min，50℃超声提取10min，4000r/min离心5min，取上清液移至另一50mL离心管中。残渣加乙睛10mL重复提取1次。合并上清液，加正已烷4mL，低速涡旋10s，3000r/min离心2min，弃正已烷层。加正已烷4mL，再次除脂。下层50℃旋转蒸发至干，加入30%甲醇水溶液3mL溶解，备用。7.3净化
混合阳离子固相萃取柱用甲醇、水各3mL活化，取备用液过柱，依次用水、50%甲醇溶液各3mL淋洗，抽干。用甲醇5mL洗脱，洗脱液于50℃下氮气吹干。用0.2mL乙睛（80%）-0.1%甲酸溶液溶解残余物，涡旋混匀，过0.22um滤膜或15000rpm高速离心10min，取上清液，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。7.4测定
7.4.1液相色谱参考条件
a）色谱柱：Cis色谱柱（50mm×2.1mm,1.7um），或相当者；b）流动相：A：0.1%甲酸乙睛，B：0.1%甲酸溶液，梯度洗脱，见表1c）流速：0.2mL/min；
d）柱温：30℃；
e）进样量：10μL。
表1液相色谱梯度洗脱条件
时间，min
7.4.2质谱参考条件
流速，mL/min
a）离子源：电喷雾（ESI）离子源；b）扫描方式：正离子扫描：
c）检测方式：多反应监测；
d）电离电压：3000V：
e）源温：100℃；
f）雾化温度：350℃；
g）锥孔气流速：25L/h；
h）雾化气流速：450L/h；
i）定性离子对、定量离子对和碰撞能量见表2。GB31660.42019
表2定性离子对、定量子离子、锥孔电压和碰撞能量化合物名称
醋酸甲地孕酮
醋酸甲羟孕酮
氙代醋酸甲地孕酮
7.4.3测定法
定性离子对及碰撞
能量，eV
385/267(20)
385/325（18）
387/285（28）
387/327（18)
388/270（18）
定量离子对及碰撞
能量，ev
385/267（20）
387/327（18）
388/270（18）
锥孔电压，V
取试样溶液和标准溶液，作单点或多点校准，按内标法以峰面积比计算。试样溶液及标准溶液中醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮与氛代醋酸甲地孕酮的峰面积比应在仪器检测的线性范围之内。试样溶液的离子相对丰度与标准溶液的离子相对丰度相比，符合表3的要求。醋酸甲地孕酮、醋酸甲羟孕酮和氛代醋酸甲地孕酮多反应监测特征离子质量色谱图见附录A。表3定性确证时相对离子丰度的允许偏差相对离子丰度，%
7.5空白试验
除不加试料外，均按上述测定步骤进行。结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按式（1）计算：A× Ais × Cs ×Cis ×V
As×As×Cis×m
式中：
允许偏差，%
X一试样中被测物质的残留量，单位为微克每千克（μg/kg）；GB31660.42019
C一标准工作溶液中被测物质的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）：Cis一试样溶液中内标的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；Cis一标准工作溶液中内标的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；A一试样溶液中被测物质的峰面积：Ais一标准工作溶液中内标的峰面积：Ai—试样溶液中内标的峰面积；A一标准工作溶液中被测物质的峰面积：V一试样溶液定容体积，单位为毫升（mL）：m一试料质量，单位为克（g）。计算结果需扣除空白值。测定结果用两次平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。检测方法的灵敏度、准确度和精密度9.1灵敏度
本方法的检测限为0.5ug/kg，定量限为1ug/kg9.2准确度免费标准bzxz.net
本方法在1μg/kg～5μg/kg添加浓度水平上的回收率为70%～120%。9.3精密度
本方法的批内相对标准偏差≤20%，批间相对标准偏差≤20%。6
100208-std1
100208-std1
100208-std1
。0.100.31
100208-stdt
100208-std1
附录A
（资料性附录）
特征离子质量色谱图
GB31660.42019
1:MRMof1Cha
02:MRMof2channeleES27
n3e7e5285
2.853,003,24
2,372,552
3:MRMof2Changel5325
B:MRMof
图A.1ng/mL混合标准溶液特征离子质量色谱图4.00
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