标准号：GB/T 38172-2019
标准名称：蛋白A亲和层析介质
英文名称：Protein A affinity chromatographic medium
标准格式：PDF
发布时间：2019-10-18
实施时间：2019-10-18
标准大小：786K
标准介绍：本标准规定了蛋白A亲和层析介质的技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输。
本标准适用于蛋白A亲和层析介质的生产与检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文牛。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T191包装储运图示标志
GB/T5475离子交换树脂取样方法
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草
本标准由中国标准化研究院提出并归口。
本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术(苏州)有限
本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云
本标准规定了蛋白A亲和层析介质的技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和贮存。 本标准适用于蛋白A亲和层析介质的生产与检测。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38172—2019
蛋白A亲和层析介质
Protein A affinity chromatographic medium2019-10-18发布
国家市场监督管理总局
中国国家标准化管理委员会
2019-10-18实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38172—2019
本标准起草单位：中国科学院过程工程研究所、中国标准化研究院、中科森辉微球技术（苏州）有限公司。
本标准主要起草人：黄永东、赵岚、朱凯、吴学星、马光辉、苏志国、巩方玲、马爱进、杨维兴、王少云、秦佳。
1范围
蛋白A亲和层析介质
GB/T38172—2019
本标准规定了蛋白A亲和层析介质的技术要求、检测方法、检验规则、标签、标志、包装、运输和存。
本标准适用于蛋白A亲和层析介质的生产与检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。包装储运图示标志
GB/T 191
GB/T5475
GB/T6682
术语和定义
离子交换树脂取样方法
分析实验室用水规格和试验方法下列术语和定义适用于本文件。3.1
蛋白A亲和层析介质
protein A affinity chromatographic medium将重组蛋白A偶联至琼脂糖分离介质上制备的一类层析介质。技术要求
外观要求
蛋白A亲和层析介质应球形饱满、表面光滑，在光学显微镜下应具有透明性。4.2
性能要求
应符合表1中的规定。
表1蛋白A亲和层析介质的主要性能要求项目
范围粒径比（W教径）/%
平均粒径（a）/μm
最高流速/（cm/h）
配基密度（p)/（mg/mL）
动态载量（Qio%）/（mg/ml.）
90.0±13.5bZxz.net
≥300
GB/T38172—2019
菌落总数/（CFU/mL)
5-羟甲基糠醛脱落量/（μg/mL）表1(续）
粒径在45.0um~165.0μm范围内试样颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比8
在0.10MPa压力下可达最高流速。b
每毫升介质对人免疫球蛋白(h-IgG)的吸附量5检测方法
样品处理
按照GB/T5475直接从产品中抽取5mL样品，置于50mLG3型号砂芯漏斗中抽干5min。用符合GB/T6682的三级水清洗5次，每次2min，最后用真空泵在0.1MPa压力下抽干5min。将洗净的介质置于烧杯中，向其中补加三级水，保证介质上应有2cm的三级水。混勾后得到蛋白A亲和层析介质与水的混合体系。
5.1.2样品观测
用塑料吸管吸取混合体系置于载玻片上，调整显微镜放大倍数。以视野里80%以上面积均为蛋白A亲和层析介质为标准，用塑料吸管增减载玻片上的蛋白A亲和层析介质·最后用盖玻片压上。调节光学显微镜焦距，使视野中的影像清晰。拍摄蛋白A亲和层析介质照片并保存。粒径
样品处理
方法同5.1.1。
5.2.2样品检测
设置激光粒度仪参数如下：测量颗粒类型为通用型，分散剂类型为水，分析模式为单峰模式，添加样品进行测定。
5.2.3结果计算
5.2.3.1范围粒径比
按式（1)计算：
W粒径
...................(I)
式中：
W拉格
范围粒径比，%；
W。—一粒径为k（um)颗粒的体积与全部试样颗粒体积之比，%。5.2.3.2平均粒径
按式(2)计算：
式中：
d——所统计的一定数量介质颗粒的平均粒径，单位为微米（μm)；d，——单个颗粒的粒径，单位为微米（μm)；N—所统计的介质颗粒的数目
GB/T38172—2019
.（2)
在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5.3最高流速
5.3.1样品处理
方法同5.1.1
5.3.2样品装柱
选用$1.60cm×20.00cm的层析柱，将介质与水的混合浆液倒入层析柱中，堵住柱子出口，静置，控制介质床层高度为10.00cm士0.20cm，柱子上端充满水。打开柱子人口，以0.5mL/min的流速连续向柱中通入10个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。5.3.3样品测定
将层析柱连入中低压层析系统。测定时，从零开始设定一定流速（mL/min），保持该流速5min后，记录此时柱压P，（MPa）。继续增加流速，并测定相应流速下的柱压。直到压力达到0.10MPa为止，此时对应流速记录为V0.1。5.3.4结果计算
按式（3）计算：
式中：
Fmx—最高流速，单位为厘米每小时（cm/h）；Uo.1
在0.1oMPa压力下的体积流速，单位为毫升每分（mL/min）；层析柱截面积，单位为平方厘来（cm）：分钟转化为小时的换算系数。
在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5.4配基密度
5.4.1溶液配制
20g/L硼酸溶液
准确称取20.00g硼酸于250mL烧杯中，加入三级水溶解后定容至1000mL....(3)
GB/T38172—2019
5.4.1.2甲基红-溴甲酚绿指示剂准确称取3mg甲基红，1mg溴甲酚绿于50mL烧杯中，加人乙醇溶解后定容至100mL。5.4.2样品处理
按照方法5.1.1处理介质样品。
接着进行硝化处理，准确称取1.00g样品，移人干燥的100mL凯氏烧瓶中，加人50mg硒粉和5mL浓硫酸。置于电炉上加热。先用小火慢慢加热2h至液体呈透明淡绿色，然后改用大火继续加热30min，当液体澄清透明后停止加热，并自然冷却至室温。准确称量10.0mg蛋白A，溶于1mL水中。同时配制10.00g/mL、6.00mg/mL、3.00mg/mL、1.25mg/mL蛋白A标准溶液，各取1mL进行硝化处理。5.4.3样品测定
推确称取1mL硝化后样品，移入干燥的100mL凯氏定氮瓶中。加人10mL40%的氢氧化钠溶液，蒸汽浴进行反应。用25mL20g/L硼酸溶液（加入5滴6滴甲基红-漠甲酚绿指示剂，浅紫色）收集馏出液，冷凝器的出液口浸于硼酸溶液液面以下。硼酸溶液的体积达到45mL时冷凝器的出液口离开液面，用去离子水冲洗冷凝器的出液口，至最终体积为50mL时停止收集。用0.05mol/L的盐酸标准溶液滴定上述硼酸溶液至灰色或蓝紫色为终点，并记录消耗盐酸标准溶液的体积。建立蛋白A质量-消耗盐酸体积标准曲线。同时取1.00g空白介质进行上述操作，做空白对照。5.4.4结果计算
按式(4)计算：
式中：
一一蛋白A亲和层析介质配基密度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；蛋白A亲和层析介质上测定出的蛋白A质量，单位为毫克（mg）；mi
空白介质上测定出的蛋白A质量，单位为毫克（mg）；蛋白A亲和层析介质质量，单位为克（g）：1.4蛋白A亲和层析介质质量转化为体积的换算系数。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。5.5
动态载量
5.5.1溶液配制
5.5.1.1缓冲液A.pH7.0
准确称取4.17g十二水合磷酸氢二钠，1.27g二水合磷酸二氢钠和8.78gNaCl于500mL烧杯中，加人三级水溶解后，调pH为7.0，最后定容至1000mL，用0.45μm过滤膜进行过滤。5.5.1.2缓冲液B,pH3.0
准确称取7.51g甘氨酸，加人三级水溶解，调pH至3.0，最后定容至1000mL，用0.45μm过滤膜进行过滤。
5.5.1.3h-IgG样品（纯度>98%）GB/T38172—2019
用缓冲液A将h-IgG蛋白稀释，使用分光光度计在280nm处进行测定。最终浓度稀释至3.00mg/mL。采用吸光系数[1.33mL/（mg·cm）计算蛋白浓度。5.5.2样品处理
方法同5.1.1。
5.5.3样品装柱
选用Φ1.60cm×20.00cm的层析柱，将介质与水的混合浆液倒人层析柱中，堵住柱子出口，静置控制介质床层高度为5.00cm土0.20cm，柱子上端充满水。打开柱子入口，以2.0mL/min的流速连续向柱中通人10个柱体积的三级水，床层稳定后即可进行测试。5.5.4样品测定
将层析柱连在层析系统中，并检测280nm处紫外线（UV)信号，对载量测定过程进行监控。动态结合载量用10%穿透值表示。测量并记录样品h-IgG的100%UV信号，包括不结合到介质上的IgG亚类的紫外吸收。用缓冲液A以2.0mL/min的流速平衡层析柱至紫外基线平衡，以2.0mL/min的流速上样，待流穿曲线中h-IgG的UV信号浓度为10%的样品浓度时上样结束，记录上样体积。上样结束后用缓冲液A以2.0mL/min的流速平衡紫外信号至基线；用缓冲液B以2.0mL/min的流速进行洗脱。计算动态载量。非保留条件下穿透体积测定：将层析柱连在层析系统中，并检测280nm处UV信号，上样10μL1%内酮，记录出现UV信号时的体积。5.5.5结果计算
按式（5）计算：
C。(Vr-V.)
式中：
动态载量，单位为毫克每毫升（mg/mL）：C.
蛋白起始浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；（5)
一一柱出口蛋白浓度C达到入口蛋白浓度C。的10%时流出液体积，单位为毫升（mL）；V。——非保留条件下穿透体积，单位为毫升（mL）Vgel介质体积，单位为毫升（mL)。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%5.6菌落总数
5.6.1样品前处理
方法同5.1.1。
5.6.2样品测定
参照《中华人民共和国药典》（2015年版）（1105）非无菌产品微生物限度检查微生物计数法进行。取1mL抽干介质，加入1mL三级水，采用涡旋混合器混匀样品。将含有30mL胰蛋白陈大豆琼GB/T38172—2019
脂培养基的锥形瓶121℃灭菌20min，放人40.0℃恒温箱中.待培养基冷却到40.0℃时，用微量移液器吸取1mL混匀后的样品加入该锥形瓶中，混匀，把混合物倒入培养皿中，盖好上盖。在室温下使混合物凝固。把培养血置于恒温箱中35℃孵育5d。5.6.3结果计算
孵育期后检查培养皿。计数菌落形成单位数（CFU）在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值应不超过5CFU/mL悬浮液。5.75-羟甲基糠醛脱落量
5.7.1溶液配制
5.7.1.110%（体积分数）甲醇水溶液准确量取100mL色谱纯无水甲醇，与900mL二级水混合均匀，再用0.22μm孔径的滤膜过滤，超声除气泡。
5.7.1.25-羟甲基糠醛标准储备溶液准确称取适量的5-羟甲基糠醛标准物质于100mL容量瓶.用10mL10%甲醇水溶液溶解，定容，配成0.20mg/mL的标准储备液。
5.7.1.31mmol/L盐酸溶液pH3.0
量取0.083mL浓盐酸（12mol/L）稀释定容为1000mL，调节pH为3.0。5.7.1.4100mmol/L氢氧化钠溶液.pH13.0称取4.00g氢氧化钠固体，溶于100mL三级水中，待冷却至室温后用三级水定容为1000mL，调节pH为13.0。
5.7.1.5标准工作溶液
分别吸取5-羟甲基糠醛标准储备溶液5μL、15μL、25μL、40μL、50μL、100μL、1mL、2mL至100mL容量瓶中，用10%甲醇水溶液稀释至刻度，配成0.01g/mL、0.03μg/mL、0.05μg/mL、0.08pg/mL0.10μg/mL、0.20μg/mL、1.00μg/mL、2.00uμg/mL标准工作溶液。现配现用。5.7.2样品处理
清洗方法同5.1.1。取若干份1.00g抽干蛋白A亲和层析介质置于带盖玻璃试管内。分别取10mLpH3.0、pH13.0的溶液置于各试管内，样品管在40.0℃条件下培养。7d后.将上层清液转移到干净的试管内。
上层清液经旋转蒸发（60℃，50r/min），定容至2mL，加人等体积12mol/L盐酸，100℃水解1h。定容至5mL。用0.45μm的滤膜过滤，得到样品待测液。5.7.3样品测定
高效液相色谱条件：色谱柱选择C1.5μm，250mm×4.6mm（内径）。流动相是10%甲醇水溶液。流速1.0mL/min。检测波长285nm。柱温30℃。进样量10μL以上述高效液相色谱条件对标准工作溶液和样品待测液进行检测。记录标准工作溶液的保留时间以及峰面积，以峰面积对相应浓度绘制标准工作曲线。以标准工作溶液的保留时间对样品进行定性，并记录下该保留时间处峰的面积，用标准工作曲线对样品进行定量。5.7.4结果计算
按式（6)计算：
式中：
每毫升介质中5-羟甲基糠醛的脱落量，单位为微克每毫升（ug/mL）；GB/T38172—2019
从工作曲线求得的试样溶液中5-羟甲基醛的浓度，单位为微克每毫升（uμg/mL）；c
V试样经盐酸水解后最终的定容体积，单位为毫升（mL）；m
称取的蛋白A亲和层析介质的质量，单位为克（g）；1.4蛋白A亲和层析介质质量转化为体积的换算系数。在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%检验规则
6.1组批
同一工艺周期生产，质量均一的产品为一批6.2抽样
按GB/T5475的规定进行。
6.3出厂检验
每批产品出厂前应进行检验，检验合格的产品方可出厂。出厂检验项目为第4章中规定的粒径、最高流速、配基密度、动态载量和菌落总数。6.4
型式检验
6.4.1正常生产时，每半年应进行一次型式检验，有下列情况之一时应进行型式检验：a)
新产品试制鉴定时；
正常生产后，如原料、工艺、设备有较大变化，可能影响产品性能时：b）
产品停产半年以上恢复生产时；d)
出厂检验结果与上次型式检验有较大差异时：e)
监督机构提出要求时。
型式检验项目为第4章中规定的所有项目。判定规则
6.5.1出厂检验判定和复检
格品。
出厂检验项目符合6.3中项目要求，判定本批为合格品出厂检验项目1～2项不符合要求，应复检，复检后如仍有1项不符合要求，则判定该批为不合3出厂检验项目超过2项不符合要求，判定该批产品为不合格品。6.5.1.3
GB/T38172—2019
型式检验判定和复检
型式检验项目符合6.4中项目要求，判为合格品6.5.2.1
型式检验项目1～3项（含3项）不符合要求，应复检，复检后如仍有1项不符合要求，则判定该6.5.2.2
批为不合格品。
6.5.2.3型式检验项目超过3项不符合要求，判定该批产品为不合格品。7标签、标志、包装、运输和贮存标签
应至少包括以下内容：
产品名称；
型号；
体积；
生产批号；
生产组织；
生产日期；
有效期；
注意事项。
包装储运标识应符合GB/T191的规定。7.3
宜选用塑料瓶包装，包装材料应确保产品在运输、贮存时不被污染和泄漏。运输
应在常温环境下运输，避免过冷或过热，且采取措施防止产品失水。7.5
应在4℃～8℃环境下贮存，有效期为五年，超过有效期可按本标准规定进行复验，若复验结果符合标准要求，仍可使用。
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