标准号：HJ 1069-2019
标准名称：水质 急性毒性的测定 斑马鱼卵法
英文名称：Water quality-Determination of the acute toxicity-Zebrafish(Danio rerio) eggs method
标准格式：PDF
发布时间：2019-12-31
实施时间：2020-06-30
标准大小：1480K
标准介绍：贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水质急性毒性测定的斑马鱼卵方法，制定本标准本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中急性毒性的斑马鱼卵法。本标准的附录A~附录G为资料性附录
本标准为首次发布
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订 本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法。
本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。
2规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本
GBT6920水质pH值的测定玻璃电极法
3267水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法
污水监测技术规范
水质溶解氧的测定电化学探头法
HJT91地表水和污水监测技术规范
HJT164地下水环境监测技术规范

中华人民共和国国家环境保护标准HJ1069-2019
水质急性毒性的测定
斑马鱼卵法
Water qualityDetermination of the acute toxicityZebrafish (Daniorerio)eggsmethod（发布稿）
本电子版为发布稿。请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。2019-12-31发布
2020-06-30实施
生态环境部发布
适用范围
规范性引用文件
术语和定义．
方法原理
干扰和消除
试剂和材料.
仪器和设备：
试验步骤.
结果计算与表示
有效性、敏感性与精密度
质量保证和质量控制
试验报告
废弃物处置
附录A（资料性附录）斑马鱼卵相关发育阶段附录B
附录C
附录 D
附录E
附录F
（资料性附录）
斑马鱼种鱼剔养及维持
（资料性附录）产卵盒参考图片（资料性附录）斑马鱼卵鉴别
（资料性附录）
24孔细胞培养板试验布局设置方案。（资料性附录）推荐的数据记录表寇式法计算EC50
附录G
（资料性附录）
为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范水质急性毒性测定的斑马鱼卵方法，制定本标准。本标准规定了测定地表水、地下水、生活污水和工业废水中急性毒性的斑马鱼卵法。本标准的附录A～附录G为资料性附录。本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。本标准起草单位：江苏省常州环境监测中心、中国环境科学研究院环境基准与风险评估国家重点实验室。
本标准验证单位：中国环境科学研究院环境分析测试技术中心、中国环境监测总站、生态环境部南京环境科学研究所、浙江省环境监测中心、浙江省农业科学院农产品质量标准研究所和江苏国创环保科技有限公司。本标准生态环境部2019年12月31日批准。本标准自2020年6月30日起实施。本标准由生态环境部解释。
1适用范围
急性毒性的测定
斑马鱼卵法
本标准规定了测定水质急性毒性的斑马鱼卵法本标准适用于地表水、地下水、生活污水和工业废水的急性毒性测定。2规范性引用文件
本标准内容引用了下列文件中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T6920水质pH值的测定玻璃电极法GB/T13267水质物质对淡水鱼（斑马鱼）急性毒性测定方法HJ91.1污水监测技术规范
HJ506水质溶解氧的测定电化学探头法HJ/T91地表水和污水监测技术规范HJ/T164地下水环境监测技术规范3术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。3.1
鱼卵fishegg
指处于卵膜破裂前整个发育阶段的卵细胞，斑马鱼卵相关发育阶段参见附录A。3.2
稀释倍数dilutionleve
原水样占稀释后水样总体积分数的倒数，一般用D来表示。例如，水样未稀释，则稀释倍数D-1：取250ml水样稀释至1000ml（即体积分数为25%），则稀释倍数D=4。3.3
最低无效应稀释倍数lowest ineffectivedilution测试中不产生测试效应的最低稀释倍数，本标准指不少于90%鱼卵存活时水样的最低稀释倍数，用LID表示。
半数效应浓度ECs
指暴露48h后使50%斑马鱼卵产生效应的原水样占稀释后水样总体积的百分数，用ECs0表示。本标准中EC5o即半数致死浓度LC501
参比物质referencesubstance
测试中，用于验证方法敏感性的已知阳性对照物质，如本标准中3,4-二氯苯胺4方法原理
使用多孔细胞培养板，在微孔板对照、阴性对照和阳性对照控制的条件下，将4-细胞期～128-细胞期的斑马鱼受精卵置于不同稀释倍数的水样中，在26℃土1℃的条件下培养48h，根据鱼卵存活与死亡的统计数据计算LID或ECso值，表征水样的急性毒性。5干扰和消除
水样浊度或色度干扰测试终点判断，可用塑料滴管（7.11）缓慢从多孔细胞培养板（7.8）中吸出一定量的水样后再行观测，避免触碰鱼卵；观测结束后，若需继续暴露，则用塑料滴管（7.11）将原水样移回，恢复原有暴露体积。6试剂和材料
受试生物
6.1.1种鱼
使用健壮、无疾病、无畸形、产卵量及受精率高的野生型斑马鱼作为种鱼用于产卵。成鱼体长3.5cm左右，鱼龄在6月～24月之间。健康雌鱼腹部银亮，饱满膨大。健康雄鱼体型修长，腹部扁平，身体带有金黄色光泽。种鱼在产卵前6个月不使用任何药物。种鱼养及维持具体条件见附录B。
6.1.2鱼卵
确保试验鱼卵受精率≥70%，处于4-细胞期～128-细胞期（见附录A）。6.2试剂
除非另有说明，分析时使用符合国家标准的分析纯试剂。试验用水使用新制蒸馏水或去离子水，满足pH值6.5～8.5，电导率<10μS/cm的要求。6.2.1氢氧化钠（NaOH）。
6.2.2氯化钙（CaCl22H2O）
6.2.3硫酸镁（MgSO47H2O）。
6.2.4碳酸氢钠（NaHCO3）。
6.2.5氯化钾（KCI）。
6.2.63,4-二氯苯胺（C6HsC2N），优级纯。6.2.7盐酸：p（HCI）=1.19g/ml。2
6.2.8盐酸溶液：c（HCI）=0.1mol/L。量取8.3ml盐酸（6.2.7），用水定容至1000ml6.2.9氢氧化钠溶液：c（NaOH）=0.1mol/L。称取4g氢氧化钠（6.2.1），溶于少量水中，用水定容至1000ml。6.2.10参比物质3,4二氯苯胺储备液：P（C6HsCl2N）=100mg/L。称取0.05g3,4-二氯苯胺（6.2.6），溶于少量标准稀释水（6.2.16）中，用标准稀释水（6.2.16）定容至500ml，静置24h，调节pH值至7.0。避光冷藏保存，储备液可储存6个月。
6.2.11参比物质3,4-二氯苯胺工作液：p（C6HsCl2N）=3.7mg/L量取3.7ml参比物质3,4-二氯苯胺储备液（6.2.10），用溶解氧浓度达空气饱和值的标准稀释水（6.2.16）定容至100ml，使用前按8.2.1步骤平衡至26℃土1℃。该溶液作为阳性对照，临用前现配。
6.2.12氯化钙储备液：P（CaCl2·2H20O）=11.76g/L。称取11.76g氯化钙（6.2.2），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可储存6个月。6.2.13硫酸镁储备液：p（MgSO47H2O）=4.93g/L。称取4.93g硫酸镁（6.2.3），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可储存6个月。6.2.14碳酸氢钠储备液：P（NaHCO3）=2.52g/L。称取2.52g碳酸氢钠（6.2.4），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可储存6个月。6.2.15氯化钾储备液：P（KCI）=0.22g/L。称取0.22g氯化钾（6.2.5），溶于少量水中，用水定容至1000ml。可储存6个月。6.2.16标准稀释水。
将氯化钙储备液（6.2.12）、硫酸镁储备液（6.2.13）、碳酸氢钠储备液（6.2.14）和氯化钾储备液（6.2.15）四种储备液各25ml混合，用水定容至1000ml。7仪器和设备
7.1冷藏采样箱：2℃~8℃；
7.2pH计：测量范围0～14，最小分度为0.1pH单位；7.3溶解氧测定仪：测量范围0mg/L~20mg/L，最小分度为0.1mg/L；7.4倒置显微镜或体视显微镜：最小放大倍数为30x；7.5冰箱：冷藏室2℃~8℃：冷冻室≤-18℃；7.6恒温培养箱或恒温室：温度可调至26℃土1℃；7.7斑马鱼养殖系统：包括净水、储水、供水、水质控制及循环等系统：7.8多孔细胞培养板：每孔容积2.5ml～5ml或采用其它相同功能的细胞培养板，可选择市售：
7.9产卵盒：情性材料，推荐尺寸：20cm×10cm×11cm（参见附录C），可选择市售：7.10温度计：0℃~50℃
塑料滴管：5ml，口径大于3mm
一般实验室常用器血和设备。
8样品bZxz.net
8.1样品的采集和保存
根据样品性质及监测需要使用1000ml及以上容量的棕色玻璃瓶（或聚丙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯材质的容器）按照HJ91.1、HJ/T91或HJ/T164的要求进行水样的采集，水样沿瓶内壁缓慢倒入，并与瓶塞间不留空隙。水样采集后，立即于2℃～8℃避光运输和保存，并尽快进行试验，保存时间最长不超过48h。水样若需长期保存，则上述水样采集后应尽快送回实验室冷冻（≤-18℃）保存，保存前将水样充分混匀后按每1000ml容器盛装500ml～700ml水样的量分装，保存期不超过2个月。
8.2样品预处理
8.2.1温度
冷冻保存的水样需在不超过25℃水浴轻微振荡解冻，或在2℃～8℃冷藏过夜解冻。受试水样在试验开始前，放置于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，26℃1℃避光平衡至恒温后用于试验。
8.2.2pH值
按照GB/T6920方法测定水样pH值。当pH值<6.5或pH值>8.5时，使用盐酸溶液（6.2.8）或氢氧化钠溶液（6.2.9）调节水样pH值至6.5~8.5，尽量减少酸碱调节液的用量：以减少对水样浓度的影响。测定并记录调节后的水样pH值，按后续步骤进行水样测定当pH值的影响需要反映在试验结果中或者调节pH值会引起水样物理变性或化学反应时，则不调节水样pH值。
根据水样测定的实际需求，也可对pH值调节前后的水样同时开展试验比较8.2.3溶解氧
按照HJ506方法测定水样溶解氧浓度，确保用于暴露试验（9.3）步骤中的每个稀释水样中初始溶解氧浓度不低于4mg/L（大约50%饱和度）。若要充氧，溶解氧浓度不超过相应饱和溶解氧值。
8.3样品稀释
8.3.1预实验
当浓度难以预估时需进行预试验，以稀释比为10选择3个连续浓度的稀释水样，每浓度以5粒鱼卵按9.3～9.6部分进行试验，以确定鱼卵死亡率100%～0%与稀释水样浓度大致对应的范围。
8.3.2测定LID时稀释
为保证最高稀释倍数水样鱼卵存活率≥90%、最低稀释倍数水样鱼卵存活率尽可能<4
90%，一般选择连续的4个～5个（鱼卵存活率与水样浓度的大致对应关系已知时选2个~3个）稀释倍数水样，水样的稀释参照表1。表1
水样的稀释
稀释倍
原水样占稀释后
水样总体积分数
测定ECso时稀释
形成的稀释水样
1倍稀释水样（即原水样）
2倍稀释水样
3倍稀释水样
4倍稀释水样
6倍稀释水样
8倍稀释水样
12倍稀释水样
16倍稀释水样
24倍稀释水样
32倍稀释水样
所需标准
稀释水
稀释水样的组成（ml）
所需水样体积
原水样200
原水样100
原水样70
2倍稀释水样100
3倍稀释水样100
4倍稀释水样100
6倍稀释水样100
8倍稀释水样100
12倍稀释水样100
16倍稀释水样100
所得稀释
水体积
为保证稀释水样最大浓度的死亡率为100%或与之接近，稀释水样最小浓度的死亡率为0%或与之接近，一般按一定稀释比（一般≤2）选择5个连续浓度的稀释水样，以上用于样品稀释的标准稀释水，稀释前应按8.2.1步骤平衡水温至26℃土1℃并用空气曝气至溶解氧浓度达到空气饱和值。9试验步骤
9.1配种
试验前一天傍晚开始斑马鱼种鱼（6.1.1）配种，将洗净晾干后的产卵盒（7.9）内缸套入外缸，插入隔板，加入约2/3缸标准稀释水（6.2.16），选取体长及鱼龄相当、性发育特征明显、健康活跃的雌雄种鱼，在左右两个隔间中分别加入1尾雌鱼和2尾雄鱼，盖上盖板，于恒温培养箱或恒温室（7.6）中避光放置过夜。按以上步骤至少进行3组种鱼的配种。9.2产卵及鱼卵初筛
次日光照开始后，打开产卵盒（7.9）盖板，提取内缸，弃去外缸内的水后再放回内缸，沿内缸壁小心加入标准稀释水（6.2.16），以水面距内缸底部约2个种鱼体宽为宜，避免伤害种鱼。抽开隔板，让雌雄种鱼交配产卵，30min后检查各缸种鱼产卵情况，分别收集已产卵各缸内相应鱼卵，用标准稀释水（6.2.16）冲洗至结晶血中，在恒温培养箱或恒温室（7.6）5
中静置45min后，结晶皿以黑底相衬，侧面加以灯光观察，每个结晶皿中随机选取鱼卵20粒按照附录D.1的方法识别受精鱼卵，避免伤害鱼卵。统计每组种鱼所产鱼卵的受精率，至少选取受精率≥70%的3组鱼卵混合备用。9.3暴露试验
将已配制好的不同浓度的稀释水样按附录E设置的试验布局加至多孔细胞培养板（7.8），每孔2ml
上述稀释水样各取60ml~70ml于不同的培养血中，用塑料滴管（7.11）在备用鱼卵中各取圆润、饱满、完整的20粒加入上述培养血中，将各培养血在倒置显微镜或体视显微镜（7.4）下逐一进行观测，选取4-细胞期～128-细胞期（参见附录A）的受精卵，去除在细胞分裂时有明显异常（如不对称、有囊泡或无卵膜等）或者卵膜损伤的鱼卵。在已加入水样的多孔细胞培养板（7.8）对应孔中各加入1粒受精卵，盖上盖板。以上操作过程应在鱼卵（9.2）静置45min后60min内完成。将上述多孔细胞培养板（7.8）于恒温培养箱或恒温室（7.6）中，按附录B的水温和光照条件进行48h暴露试验。
9.4鱼卵镜检判定测试终点
以卵凝结、体节未形成、尾部未分离及无心跳为测试终点，判定方法如下（参见附录D.2）a）卵凝结
凝结的鱼卵显微镜下内含物完全不透明，质地较硬。在肉眼观察下凝结的鱼卵呈不透明及灰暗的状态。
b）体节未形成
鱼卵卵黄囊外侧胚胎中后部，无体节者为体节未形成。c）尾部未分离
正常发育的鱼卵，胚胎的尾部会伸长，与卵黄囊相分离。若无，则表明尾部未分离。若48h后，胚胎尾部分离程度与24h时相比未有明显变化，同样也判定为尾部未分离d）无心跳
斑马鱼卵胚胎心脏位于卵黄囊与胚胎头部间，观测该区域是否有节律的震动，若无，则表明无心跳。
将上述暴露试验的多孔细胞培养板（7.8）置于倒置显微镜或体视显微镜（7.4）下按表2要求进行鱼卵镜检。
鱼卵暴露24h和48h后，出现任一测试终点情况则判定鱼卵死亡，统计每一稀释水样鱼卵的存活率和死亡率。
测试终点
观测方式
暴露24h
暴露48h
卵凝结
显微镜或肉眼
鱼卵镜检观测要求
体节未形成
显微镜
注：“+\表示观测、判断并记录，“\表示无需此观测，9.5
5对照试验
尾部未分离
显微镜
每批水样试验时，按附录E试验布局及9步骤进行对照试验a）微孔板对照
以标准稀释水（6.2.16）为水样进行微孔板对照试验。b）阴性对照
以标准稀释水（6.2.16）为水样进行阴性对照试验。c）阳性对照
以3.4-二氯苯胺工作液（6.2.11）为水样进行阳性对照试验。无心跳
显微镜
以上9试验步骤均使用标准稀释水（6.2.16）用于配种（9.1）、产卵及鱼卵初筛（9.2）、微孔板对照和阴性对照试验（9.5），应按8.2.1步骤平衡水温至26℃±1℃，并用空气曝气至溶解氧浓度至少达到空气饱和值的80%。所涉实验室温度控制在26℃左右，恒温培养箱或恒温室（7.6）温度控制在26℃1℃。结果计算与表示
鱼卵存活率在90%及以上的最低稀释倍数，即为最低无效应稀释倍数LID。LID的结果应为整数，如LID-2。
水样EC50可按附录G方法计算，也可采用概率单位法、直线内插法等其他方法来计算结果保留至小数点后1位。
11有效性、敏感性与精密度
11.1有效性及敏感性
六家实验室对阴性对照水样（6.2.16标准稀释水）进行了6次重复测定：存活率介于90%~100%。
六家实验室对阳性对照水样（6.2.11参比物质3.4-二氯苯胺工作液）进行了6次重复测定：死亡率介于40%～60%。
11.2精密度
六家实验室分别对阴性对照水样（6.2.16标准稀释水）、p=1.3mg/L、p=3.7mg/L、p=6.3mg/L的低、中、高三个浓度水样（用阳性参比物质3,4-二氯苯胺配制）进行了斑马鱼7
卵急性毒性的测定，每个水样平均测定6次：前三者鱼卵存活率实验室内相对标准偏差分别为0.0%~5.8%、4.5%~8.5%、9.7%~18.1%，实验室间相对标准偏差分别为1.8%、3.5%13.6%，重复性限为12.9%、15.5%、17.1%，再现性限为12.7%、16.8%、23.4%；后者鱼卵死率实验室内相对标准偏差为0.0%5.3%，实验室间相对标准偏差为1.5%，重复性限为10.6%，再现性限为10.6%。
六家实验室分别对生活污水（城镇污水处理厂排水，LID-2）、工业废水（含有机化工废水及重金属废水，LID-4）进行了斑马鱼卵急性毒性的测定，每个水样平均测定6次：当生活污水和工业废水水样均处于最低无效应稀释倍数LID时，鱼卵存活率实验室内的相对标准偏差分别为5.3%～5.5%、5.3%～5.8%，实验室间相对标准偏差分别为1.9%、1.4%，重复性限为14.5%、14.8%，再现性限为14.2%、14.0%。六家实验室对阳性参比物质3,4-二氯苯胺（ECs0=3.1mg/L）进行了斑马鱼卵急性毒性EC50的测定，每个实验室各测定6次：实验室内相对标准偏差为2.9%～12.7%，实验室间相对标准偏差为7.3%，再现性限为0.9mg/L，重复性限为1.2mg/L。质量保证和质量控制
12.1微孔板对照试验
培养48h后，微孔板对照组鱼卵不得死亡，否则相应多孔细胞培养板所对应的数据无效。
12.2阴性对照和阳性对照试验
阴性对照和阳性对照试验结果符合下列要求，结果方为有效。否则，应查明原因后重新进行试验。
a）阴性对照
培养48h后，阴性对照组鱼卵存活率≥90%：b）阳性对照
培养48h后，阳性对照组鱼卵死亡率>10%13试验报告
试验报告要求包括但不限于以下几个信息：a）样品的名称、性质、来源、保存方法及保存时间；b）试验前样品的pH值、溶解氧浓度及前处理方法；c）试验环境条件，试验用标准稀释水的性质，如水温、溶解氧等情况d）微孔板对照、阴性对照和阳性对照试验是否符合质量控制规定的要求：e）试验结果报告。
14废弃物处置
试验用斑马鱼卵放入冰水混合液（冰的体积不少于50%）中30min以上进行灭活处理后按一般废弃物处置。具有急性毒性的水样、含有3,4-二氯苯胺的废液按危险废物处置。8
合子期1-细胞期
囊胚期128-细胞期
原肠期30%外包
体节期6体节
孵化期
附录A
（资料性附录）
斑马鱼卵相关发育阶段
卵裂期4-细胞期
囊胚期球形
原肠期75%外包
体节期18体节
卵裂期8-细胞期
囊胚期顶
原肠期尾芽
原基期
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