标准号：GB/T 38578-2020
标准名称：水产源致敏性蛋白快速检测 毛细管电泳法
英文名称：Rapid determination of the allergenic protein from aquatic animals origin-
Capillary electrophoresis
标准格式：PDF
发布时间：2020-03-31
实施时间：2020-03-31
标准大小：1.31M
标准介绍：1范围
本标准规定了用毛细管电泳法测定水产源致敏性蛋白的方法。
本标准适用于甲壳类原肌球蛋白、甲壳类精氨酸激酶和鱼类小清蛋白含量的快速检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T30891水产品抽样规范
本标准规定了用毛细管电泳法测定水产源致敏性蛋白的方法。 本标准适用于甲壳类原肌球蛋白、甲壳类精氨酸激酶和鱼类小清蛋白含量的快速检测。

ICS07.080
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中华人民共和国国家标准
GB/T38578—2020
水产源致敏性蛋白快速检测
毛细管电泳法
Rapid determination of the allergenic protein from aquatic animals origin-Capillaryelectrophoresis
2020-03-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-03-31实施
TKAa~cJouaKA
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。iHKAa~cJouaKA
GB/T38578—2020
本标准起草单位：中国标准化研究院、绿城农科检测技术有限公司、浙江工商大学，北京工商大学、北京萨姆伯科技有限公司、集美大学、湖南农业大学、温州大学、荣成市华通海洋生物科技有限公司本标准主要起草人：马爱进、王川不、何晓明、周瑾茹、傅玲琳、贾英民、吴琦、郝帅、刘光明、周辉、陈孝敬、王融、刘粪翔、刘忠市、工彦波。iKAa-cJouaKA
1范围
KAa~cJouaKAa
GB/T38578—2020
水产源致敏性蛋白快速检测
毛细管电泳法
本标准规定了用毛细管电泳法测定水产源致敏性蛋白的方法。本标准适用于甲壳类原肌球蛋白、甲壳类精氨酸激酶和鱼类小清蛋白含量的快速检测。2规范性引用文件
下列义件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T30891水产品抽样规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
致敏性蛋白
allergenic protein
能够使机体产生过敏反应的蛋白质。4原理
试样中的致敏性蛋白经蛋白提取液提取和阴离了交换层析纯化，采用毛细管电泳法测定，迁移时间定性，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水
GB/T6682规定的一级水。
5,2甲醇
色谱纯。
三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液
三羟甲基氨基甲烷1.21g，加900mL双蒸水溶解，用6mol/L盐酸溶液调pH至7.5，用蒸馏水定容至1000mL，用0.45μm滤膜过滤，超声震荡（功率200W）30min，室温保存。1
GB/T38578—2020
5.4氯化钠溶液
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氯化钠14.61g，适量去高子水溶解，定容至500mL，用0.45um滤膜过滤，超声震荡（功率200W）30min，室温保存。
5.5磷酸盐缓冲液
氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，磷酸氢二钠1.44g，磷酸二氢钾0.24g，将上列试剂加入定量容器中，蒸馏水溶解后定容至1000mL，用6mol/L盐酸溶液调pH至7.4，用0.45um滤膜过滤，超声震荡（功率200W）30min室温保存。
5.6虾原肌球蛋白标准样品
纯度≥98%。
5.7虾精氨酸激酶标准样品
纯度≥98%
5.8鱼小清蛋白
纯度9%
5.9标准品储备夜
致敏性蛋标准品（虾原肌球蛋白、虾精氨酸敏酶
液于1.5工离心管中，州需游
匀·制得
01me/L氧化钠溶液
清蛋白
，加人
mL酸盐缓冲
各瓶每100L分装成
mg/mL蛋点
标准储备Www.bzxZ.net
管，冻存于
氢氧化钟4.00g.适量双蒸求馨解后定容至：190m上：用0.46折建膜过售，超震功率200W）30min，室温保存。
5.110.1mul/L氢氧化钠溶液
氢氧化钠0.400适量双燕水溶解后定容至100mL用0.45um滤膜过滤声震荡（功率200W）30min，室温保存。
硼酸-硼砂缓冲溶液
精密称取四硼酸钠（NaBO,·10HO)0.9525加人80mL双蒸水溶解，用1mol/L氢氧化钠溶液调pH至9.2.用双蒸水定容至100mL，用0.45μm滤膜过滤，超声震荡（功率200W）30min，室温保存。
5.13标准品工作液
吸取标准品储备液5uL、10ul25L、40L、50L，分别置于5个1.5m塑料离心管，加人1mL磷酸盐缓冲液，漩渴震荡混匀，每种标准品工作液的质量浓度均为5μg/mL10μg/ml、25μg/mL、40μg/mL.50μg/mL，4℃保存2周。5.14苯甲基磺酰氟溶液
苯甲基磺酰氟0.174&，溶丁10mL异丙醇，漩涡需荡混勾，保存于一20℃。2
5.15蛋白提取液
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GB/T38578—2020
在预冷的1mL裂解液中分别加入1μL蛋白酶抑制剂、10μL磷酸酶抑制剂及5L0.1mol/L苯甲基磺酰氟溶液，混勾后置冰上保存待用。6仪器设备
6.1高效毛细管电泳仪：配有波长范围为214nm~-220nm的紫外检测器、正极高压组件、石英毛细管（总长45cm，内径75μm）。
低温离心机：13000g。
pH计：精密度0.01。
微孔滤膜：0.45μm，水相。
001g001g和0.0001g.
分析天平：感量
蛋白纯化仪：两有自分部收集器。7试验条件
毛细管柱处理方法
轴管柱化。依次用甲尊神
新毛细
泰馏水
30min，蒸增水冲洗5min，最后再用调酸-翻教爱冲溶液中洗每种样品分新前，用硼酸
事砂纸
氧化钠溶液冲洗出蒸螺水冲洗
测试操作条件
测试操作条件见验1。
毛细管
n1molL氢氧化钠容液冲洗
质，依次用蒸馏水冲光3min，
表1测试操作条件
波长/nm
盖度/℃
进样条件
分析条件
8样品制备
进样压力/Pa
进样时间/s
分离电压/kV
检测时间/min
鱼类小清蛋白
甲壳类原肌球蛋
甲壳类精氨酸激酶
按GB/T30891规定，抽取具有代表性的水产源样本至少500g，用四分法缩减至100g；放置冰上，切成廉状。用液氮研磨至粉末状，低温保存备用。GB/T38578—2020
9试验步骤
9.1蛋白提取
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快速称取研磨后的样品0.100g放人1.5ml.预冷离心管内，加人1.0mL蛋白提取液，漩满混匀后4C静冒2h，10000r/min，4C离心5min，取上清液，分装保存于一80℃，应避免反复冻融。提取蛋白上清液后，再用阴高子交换层析（1mLDEAEscpharascF.F.预装柱）纯化蛋白上清液，2mL蛋白上清液以0.5mL/min的流速上样，再用40mL0.01mol/L三羟甲基氮基甲烷盐酸缓冲液和0.5mol/L氯化钠溶液线性洗脱，洗脱速度为1mL/min，根据出峰情况，收集蛋白洗脱液，所得样品一80C冷冻备用。
9.2蛋白提取率测定
在按第8章处理好的样品中，加人1mg致敏性蛋白标准品，用液氮研磨至粉末状。快速称取研磨后的加标样品0.100g放入1.5mL预冷离心管内，加入1.0mL蛋白提取液，漩涡混匀后4℃静置2h，10000r/min，4℃离心5min，取上清液.分装保存于一80℃C，应避免反复冻融。提取蛋白上清液后，再用阴离子交换层析（1mLDEAEsepharoseF.F.预装柱）纯化蛋白上清液，2mL蛋白上清液以0.5mL/min的流速上样，再用40mL0.0lmol/L二羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液和0.5mol/L氯化钠溶液线性洗脱，洗脱速度为1mL/min，根据出峰情况，收集蛋白洗脱液，所得加标样品一80C冷冻备用。采用BCA法测定样品和加标样品的蛋白含量。蛋白提取率按式(1)计算：
式中，
蛋白提取率，%；
X=-PixV
PoXV+m
加标样品液蛋白质量浓度，单位为微克每毫升（μug/mL）；P
V.加标样品液体积，单位为毫升（mL)：po—样品液蛋白质量浓度，单位为微克每毫升（μg/mL)；V。一样品液体积，单位为毫升（mL)）；致敏性蛋白标准品质量，单位为毫克（mg），m
9.3测定
9.3.1取样品液200置于样品瓶中，压力进样5s后，采用毛细管电泳法分离测定，分析时间为10min~15min.
9.3.2采用外标校准曲线法定量测定。以系列致敏性蛋白标准溶液质量浓度为坐标，毛细管电泳峰画积为纵坐标，作标准曲线线性回归方程，样品的峰面积与标准曲线比较定量。标准溶液和样品提取液中致敏性蛋白的响应值应在仪器测定的线性范围内。标准溶液毛细管电泳图参见附录A。9.3.3如果样品中的质量浓度超过了标准曲线的最高点，进一步对样品进行稀释。9.3.4每个测试溶液至少2张电泳图。9.3.5在进行3个~5个样品检测后，应在仪器进出口换上新的硼酸-谢砂缓冲溶液。10结果计算
致敏性蛋白含量按式(2)计算：
式中：
p=euxv
—致敏性蛋白的含量，单位为毫克每克（mg/g）：p
p样品液中致敏性蛋白含量，单位为微克每毫升（μ8/mL)；样品液体积，单位为毫升（mL)：样品质量，单位为克（g)；
x蛋白提取率，%。
TiKAa-cJouaKA
GB/T38578—2020
计算结果以平行测定值的算术平均值表示，保留两位有效数字。10.2
GB/T38578—2020
附录A
（资料性附录）
标准溶液毛细管电泳图
A.1原肌球蛋白毛细管电泳图见图A.1。0.05-
0,00卡
2精氨酸激酶毛细管电泳图见图A.2。A.2
A.3小清蛋白毛细管电泳图见图A.3。D.040
王移时间/min
原肌球蛋白毛细管电泳图
迁移时间/min
精氨酸激酶毛细管电泳图
迁移时间/min
小清蛋白毛细管电泳图
TTiKAa-cJouakA
TKAa~cJouaKA
GB/T38578-2020
KAa~cJouaKA
中华人民共
国家标准
水产源致敏性蛋白快速检测
毛细管电泳法
GB/T385782020
中国标准出版社出版发行
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