GB/T 30987-2020
基本信息
标准号： GB/T 30987-2020
中文名称：植物中游离氨基酸的测定
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：3153344
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
标准号：GB/T 30987-2020
标准名称：植物中游离氨基酸的测定
英文名称：Determination of free amino acids in plant
标准格式：PDF
发布时间：2020-03-31
实施时间：2020-03-31
标准大小：3.44M
标准介绍：本标准代替GB/T30987—2014《植物中游离氨基酸的测定》。本标准与GB/T30987-2014相比，主要技术变化如下：
增加了液相色谱串联质谱法(见第6章)；
修改了方法灵敏度的表示方式(见4.5.5.6、5.5.6.4,2014年版的4.10、5.10)。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。
本标准规定了植物中游离氨基酸含量的测定方法，包括全自动氨基酸分析仪法(第一法)、高效液相色谱仪法(第二法)和液相色谱串联质谱法(第三法)三种方法。
本标准适用于茶叶，中药材、烟叶等植物样品中21种游离氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、~氨基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、茶氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸)的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T8303-2013茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定
标准名称：植物中游离氨基酸的测定
英文名称：Determination of free amino acids in plant
标准格式：PDF
发布时间：2020-03-31
实施时间：2020-03-31
标准大小：3.44M
标准介绍：本标准代替GB/T30987—2014《植物中游离氨基酸的测定》。本标准与GB/T30987-2014相比，主要技术变化如下：
增加了液相色谱串联质谱法(见第6章)；
修改了方法灵敏度的表示方式(见4.5.5.6、5.5.6.4,2014年版的4.10、5.10)。
本标准由全国生化检测标准化技术委员会(SAC/TC387)提出并归口。
本标准规定了植物中游离氨基酸含量的测定方法，包括全自动氨基酸分析仪法(第一法)、高效液相色谱仪法(第二法)和液相色谱串联质谱法(第三法)三种方法。
本标准适用于茶叶，中药材、烟叶等植物样品中21种游离氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、~氨基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、茶氨酸、苏氨酸、酪氨酸、缬氨酸)的测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T8303-2013茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定
标准图片预览
标准内容
ICS07.080
iiiKAa~cJouaKAa
中华人民共和国国家标准
GB/T30987-—2020
代替GB/T30987—2014
植物中游离氨基酸的测定
Determination of free amino acids in plant2020-03-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-03-31实施
GB/T30987—2020
规范性引用文件
术语和定义
全自动氨基酸分析仪法（第一法）高效液相色谱法（第二法）
6液相色谱申联质谱法（第三法）目
附录A（资料性附录）氨基酸化合物信息及定量限：次
附录B（资料性附录）21种氨基酸混合标准工作溶液色谱图附录C(资料性附录）
液相色谱-中联质谱参数参考条件iiiKAa~cJouaKAa
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起卓。本标准代替GB/T309872014《植物中游离氨基酸的测定》。本标准与GB/T30987—2014相比，主要技术变化如下：增加了液相色谱-串联质谱法（见第6章）；iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
修改了方法灵敏度的表示方式（见4.5.5.6、5.5.6.4,2014年版的4.10,5.10）。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、中国测试技术研究院、河北省食品检验研究院本标准主要起草人：李怀平、唐祥凯、杨杰斌、邹燕、赵爱平、吴微、张岩。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T30987—2011。
1范围
iikAa~cJouakA:
CB/T30987—2020
植物中游离氨基酸的测定
本标准规定了植物中游离氨基酸含量的测定方法，包括全自动氨基酸分析仪法（第一法）、高效液相色谱仪法（第二法）和液相色谱-串联质谱法（第三法）三种方法。本标准适用于茶叶、中药材、烟叶等植物样品中21种游离氨基酸（丙氨酸、精氢酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、氨基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、鞘氨酸、蛋氨酸、苯内氨酸、脯氨酸、丝氨酸、茶氨酸、苏氨酸、酪氨酸、颈氨酸）的测定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8303-2013茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
游离氨基酸free amino acids
植物中未与其他化学物质结合，以单个分子或离子形式存在，可被水溶液或其他溶剂直接浸提出来的氨基酸，
4全自动氨基酸分析仪法（第一法）4.1原理
样品中游离氨基酸经沸水提取后，经氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换柱分离后，在135C下加热，氨基酸与三酮混合反应，伯胺与三酮生成蓝紫色化合物，仲胺与三酮生成黄色化合物，分别在570nm和440nm波长下通过可见光分光光度检测器检测两种衍生产物，保留时间定性，外标工作曲线法定量。
4.2试剂或材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2.1柠檬酸锂（四水）。
4.2.2氯化锂。
4.2.3柠檬酸。
4.2.4氢氧化锂。
4.2.5翻氢化钠。
GB/T30987—2020
4.2.6无水乙酸钠。
4.2.7节三酮。
4.2.8无水乙醇。wwW.bzxz.Net
硫代双乙醇。
聚氧乙烯月桂酵。
4.2.11辛酸。
苯甲醇。
乙二醇甲醚。
4.2.14冰乙酸，
iiiKAa~cJouaKAs
4.2.15氨基酸标准品：丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg天各酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、胱氨酸（Cys）y-氨基丁酸（GABA）、谷氨酰胺（Cin)、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、蛋氢酸（Met）苯内氨酸（Phe)、脯氨酸Pro）丝氨酸（Ser）、茶氨酸（The）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）
额氨酸（al），化合物信息参见附录A中表A1纯度均98%。4.2.16快速定量消纸。
4.2.170.45um水相减膜
4.2.180.45
有机相滤膜
仪器设
氨基酸自动分析仪：配备双通道亚2分析天平：感量0.000
40自筛乳径0.425
移液器：量程分别男
4.4样品
元棉度分高系统粒三元反应夜输送系统。L~200
及100
1000pl
样品按GB/8303-2018中61租6盒靓定制格库百满，充分减匀，装人活净的盛样容器内，作为试样，标明标识
4.5试验步骤
4.5.1标准溶液配制
混合氨基酸标准储备液配
称取各氨基酸标准品适量（精像到0.01mg），用水溶解，配制成混合溶液。混合标准溶液中的茶氮25umal/mL。储备溶液冷冻保存有效期为酸和其他20种氨基酸的浓度分别为5.0001个月。
4.5,1.2混合氨基酸标准工作液配制准确吸取2mL混合氨基酸标准储备液至5mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混勾，即得到第-份标准济液。将第一份标准溶液用水逐级稀释，制成总共7个不同浓度的系列混合标准工作溶液。7个浓度的混合标准工作溶液中茶氨酸及其他20种氨基酸的浓度分别为：2000.00nmol/mL和500.00nmol/mL,1000.00nmol/mL和250.00nmol/mL，500.00nmol/mL和125.00nmol/mL，250.00nmol/mL和62.50nmol/mL.125.00nmol/mL和31.25nmol/mL,62.50nmol/mL和15.63nmol/mL31.25nmol/mL和7.81nmol/mL，现配现用。2
4.5.2流动相配制
4.5.2.1流动相B,(pH2.8）配制
iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
称取柠檬酸锂（四水）5.73g，氯化锂1.24g柠檬酸19.90g，溶于700mL水中，加入30.0mL无水乙醇，5.0ml硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月性醚，再加0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45m水相滤膜，备用，4.5.2.2流动相B2(pH3.7)配制
称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂6.36g，柠檬酸12.00g，溶于700mL水中，加人30.0mL无水乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。4.5.2.3流动相Bs（pIl3.6）配制称取柠檬酸锂（四水）8.79g，氯化锂26.62g.柠檬酸11.27g溶700mL水中加入100mL无水乙醇，3.0mL苯甲醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.15μ水相滤膜，备用。4.5.2.4流动相B（pH4.1)配制
称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂38.15g，柠檬酸3.30g，溶于700mL水中，加人4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用4.5.2.5流动相B.配制
流动相B，为经0.45u水相滤膜过滤后的水。4.5.2.6流动相B配制
称取氢氧化锂8.40g，溶于700mL水中，加人30.0mL无水乙醇，4.0mlL聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。4.5.3柱后衍生化反应溶液配制
4.5.3.1反应溶液R，配制
称取节三酮39.0g.溶于979mL乙二醇甲醚中，超市解5min，过0.45um有机相滤膜，加入硼氢化钠81.0mg，氮气鼓泡30min，放置过夜使用。注：反应液R制备好后宜尽快使用完毕，不宜长期储存。4.5.3.2反应溶液R配制
称取无水乙酸钠204.0g，加入300mL水，123mL冰乙酸，401mL乙二醇甲醚，超声至溶解，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm有机相滤膜，氮气鼓泡10min，备用。4.5.3.3反应溶液R3配制
准确移取无水乙醇50ml于1000mL容量瓶中，用纯水定容至1000mL，混勾后过0.45μm有机相滤膜过滤，备用。
GB/T30987—2020
试样提取
iiiKAacJouaKAa
准确称取样品（见4.4）约2.0g（精确至0.0001g）于250mL销形瓶中，加人200ml.沸水冲泡，95C水浴加热，每隔5min混匀一次，提取10min后取出，趁热抽滤，滤液冷却至室温后，用水定容至250mL，混句后取适量样品溶液，经0.45um水相滤膜过滤后待测。4.5.5测定
色谱柱
磺酸型阳离子交换柱，3μm，4.6mmX60mm，或同等性能的色谱柱4.5.5.2
仪器分离体系运行参考条件
流动相配制见4.5.2就动相流速为0.35mL/min.流动相及社温梯度参考条件见表1，仪器进样体积为20μL。
表1氨基酸分析仪分离梯度条件程序时间/mi
通动箱
柱温/℃
时间/min
3氨基酸反应检测体系运行参考条件4.5.5.3
表1(续)
流动相
iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
柱温/C
反应液配制见4.5.3，反应柱温度为135C，反应液流速为0.30ml/min，反应液梯度参考条件见表2。检测器检测波长570nm和440nm。表2
时间/min
4.5.5.4绘制标准工作曲线
氨基酸分析仪反应体系条件程序反应落液
启动氨基酸自动分析仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别吸取不同浓度的系列混合氨基酸标准工作溶液，注人氨基酸自动分析仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分别以各氨基酸蜂面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准工作曲线。通过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。在上述条件（见4.5.5.1~4.5.5.3下，混合氨基酸标准工作溶液色谱图参见附录B中图B.1。4.5.5.5样品测定
用氨基酸分析仪测定样品溶液分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代人标准工作曲线计算含量。以水作为空白样品，在相同测定条件下进行测定，计算空白样品中各氮基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得各样品中氨基酸净含量方法定量限
方法定量限参见附录A中表A.1
GB/T30987—2020
试验数据处理
样品中各游离氨基酸含量的计算见式（1)：W/(c-c)×VXM×10
式中，
iikAa~cJoutakA
试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克（mg/100g）；试样溶液中由标准工作曲线计算山的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每亳升（nmol/mL)；空白试样溶液中由标准工作曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）；试样总体积，单位为毫升（mL）氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)：试样质量，单位为克（g）
试样十物率，测定方法见GB/T8303。以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100g。4.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。5高效液相色谱法（第二法）
5.1原理
伴品中游离氨基酸经6-氨基隆琳-N-羟基珑珀酰亚胺基氨基甲酸酯衍生，使之生成具有荧光的律生物，经液相色谱分离，用荧光检测器测定，保留时间定性，外标工作曲线法定量5.2
试剂或材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的一级水。5.2.1无水砂。
无水磷酸氢二钠。
无水磷酸二氢钾。
盐酸三乙胺
磷酸。
乙腈：色谱纯。
6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（CAS号：148758-94-2）纯度>98%。氨基酸标准品，见4.2.15。
快速定量滤纸。
0.45um水相滤膜。
0.45m有机相滤膜。
仪器设备
高效液相色谱仪（HPLC)：配备荧光检测器。分析天平：感量0.0001g和0.01mg。5.3.3
涡旋混匀器
移液器：量程分别为10μ~100μ，20μ~200和100μ~1000μ5.3.4
5.4样品
见4.4。
5.5试验步骤
5.5.1混合氨基酸标准工作溶液配制见4.5.1.2。
5.5.2衍生试剂的配制
5.5.2.16-氨基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯溶液iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
称取6-氨基啉-N-羟基琥珀酰业胺基氨基甲酸酯3.0mg，用1.0mL乙腈溶解，加盖密封涡旋混合10s，置于55C烘箱中加热，直到衔生试剂充分溶解，取出备用。5.5.2.2衍生用缓冲溶液配制
称取无水硼砂10.06g.加水溶解并定容至250mL，用磷酸调节pH至8.8，0.45um水相滤膜过滤后，即得0.20mol/L的硼砂盐缓冲液，备用。5.5.3流动相配制
5.5.3.1800mmol/L磷酸氢二钠储备液配制称取113.568g无水磷酸氢二钠，溶解于800mL水中，加热溶解，冷却至室温后用水定容至1000mL0.45um水相滤膜过滤后备用，溶液pH约为8.90。5.5.3.2800mmol/L磷酸二氢钾储备液配制称取108.872g无水磷酸二氢钾，溶解于800mL水中，加热溶解，冷却至室温后用水定容至1000mL0.45μm水相滤膜过滤后备用，溶液pH约为4.28。5.5.3.31mol/L的盐酸三乙胺水溶液配制取137.650g盐酸三乙胺，用水溶解并定容至1000mL,0.45um水相滤膜过滤后备用，5.5.3.4流动相A（80mmol/L磷酸盐缓冲液）配制准确移取800mmol/L磷酸二氢钾储备液95ml，800mmol/L磷酸氢二钠储备液5mL，lmol/L的盐酸三乙胶水溶液10mL，54mL乙腈，于1000mL容量瓶中，用水定容至1000mL，混匀，超声脱气10min后备用。
5.5.3.5流动相B（80mmol/L磷酸盐缓冲液）配制准确移取800mmol/L磷酸二氢钾储备液100mL到1000mL容量瓶中，加入水250mL，加入乙腈500mL，用水定容至1000mL，混勾，超声脱气10min后备用。5.5.4试样提取
见4.5.4。
GB/T30987--2020
衍生化操作
iiiKAa~cJouaKAa
移取制备好的样品溶液或标准工作溶液10于洁净的玻璃内插管中，加人衍生用缓冲溶液70，然后加入衍生试剂20μL，涡旋混合10，加盖密封于进样瓶中，在室温下静置1min，转移至55℃烘箱中加热10min，取出待测
5.5.6测定
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：C1a5μm，4.6mm×250mm，或同等性能的色谱柱：a)
流动相：具体梯度洗脱程序见表3；b
荧光检测器参数：激发波长250nm，发射波长395nm住温：35℃，
流速：ImL/min
进样体积：5L。
表3高效液相色谱法洗脱程序
时间/min
2绘制标准工作曲线
流动相
启动高效液相色谱仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别吸取不同浓度的系列混合氨基酸标准工作溶液，按照5.5.5规定进行行生化操作。行生化完毕后，注人高效液相色谱仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分别以各氨基酸峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准工作曲线。适过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。在上述色谱条件（见5.5.6.1)下，混合氨基酸标准工作溶液色谱图参见附录 B中图 B,2
样品测定
样品溶液与标准工作溶液在相同条件下进行衍生化和测定操作（衍生完毕的样品建议在48h内完成测定），分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代入标准工作曲线计算含量。以水作为空白样品，在相同测定条件下进行衍生化和测定，计算空白样品中各氨基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得各样品中氨基酸净含量8
5.5.6.4方法定量限
方法定量限参见附录A中表A.1
5.6试验数据处理
伴品中各游离氨基酸含量的计算见式（2）：W,-(c-c)×V×M×10
式中：
iikAa~cJoutakA
GB/T30987-2020
++.0+.++.
W一试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克（mg/100g）。C
试样溶液中中标准工作曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mI）。空白试样溶液中由标准工作曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）。试样总体积，单位为毫升（mL）。氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)。试样质量，单位为克（g）。
试样干物率，测定方法见GB/T8303以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100g。5.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。液相色谱-串联质谱法（第三法）6
6.1原理
样品经沸水没泡提取后过滤，滤液经稀释后进样，液相色谱-串联质谱仪测定，外标工作曲线法量。
6.2试剂或材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的级水。6.2.1甲酸铵。
6.2.2浓盐酸。
6.2.3甲醇：色谱纯。
6.2.4甲酸：色谱纯。
6.2.5乙睛：色谱纯。
氨苯酸标准品，见4.2.15。
快速定量滤纸。
0.45μm水相滤膜
0.45um有机相滤膜。
仪器设备
液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：配电喷雾离子源（ESID。6.3.2
电子天平：感量为0.c001g和0.01mg。9
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代替GB/T30987—2014
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规范性引用文件
术语和定义
全自动氨基酸分析仪法（第一法）高效液相色谱法（第二法）
6液相色谱申联质谱法（第三法）目
附录A（资料性附录）氨基酸化合物信息及定量限：次
附录B（资料性附录）21种氨基酸混合标准工作溶液色谱图附录C(资料性附录）
液相色谱-中联质谱参数参考条件iiiKAa~cJouaKAa
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起卓。本标准代替GB/T309872014《植物中游离氨基酸的测定》。本标准与GB/T30987—2014相比，主要技术变化如下：增加了液相色谱-串联质谱法（见第6章）；iiiKAa~cJouaKAa
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修改了方法灵敏度的表示方式（见4.5.5.6、5.5.6.4,2014年版的4.10,5.10）。本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387）提出并归口。本标准起草单位：中国测试技术研究院生物研究所、中国测试技术研究院、河北省食品检验研究院本标准主要起草人：李怀平、唐祥凯、杨杰斌、邹燕、赵爱平、吴微、张岩。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T30987—2011。
1范围
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CB/T30987—2020
植物中游离氨基酸的测定
本标准规定了植物中游离氨基酸含量的测定方法，包括全自动氨基酸分析仪法（第一法）、高效液相色谱仪法（第二法）和液相色谱-串联质谱法（第三法）三种方法。本标准适用于茶叶、中药材、烟叶等植物样品中21种游离氨基酸（丙氨酸、精氢酸、天冬酰胺、天冬氨酸、胱氨酸、氨基丁酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、鞘氨酸、蛋氨酸、苯内氨酸、脯氨酸、丝氨酸、茶氨酸、苏氨酸、酪氨酸、颈氨酸）的测定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T8303-2013茶磨碎试样的制备及其干物质含量测定3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
游离氨基酸free amino acids
植物中未与其他化学物质结合，以单个分子或离子形式存在，可被水溶液或其他溶剂直接浸提出来的氨基酸，
4全自动氨基酸分析仪法（第一法）4.1原理
样品中游离氨基酸经沸水提取后，经氨基酸分析仪的磺酸型阳离子交换柱分离后，在135C下加热，氨基酸与三酮混合反应，伯胺与三酮生成蓝紫色化合物，仲胺与三酮生成黄色化合物，分别在570nm和440nm波长下通过可见光分光光度检测器检测两种衍生产物，保留时间定性，外标工作曲线法定量。
4.2试剂或材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的一级水。4.2.1柠檬酸锂（四水）。
4.2.2氯化锂。
4.2.3柠檬酸。
4.2.4氢氧化锂。
4.2.5翻氢化钠。
GB/T30987—2020
4.2.6无水乙酸钠。
4.2.7节三酮。
4.2.8无水乙醇。wwW.bzxz.Net
硫代双乙醇。
聚氧乙烯月桂酵。
4.2.11辛酸。
苯甲醇。
乙二醇甲醚。
4.2.14冰乙酸，
iiiKAa~cJouaKAs
4.2.15氨基酸标准品：丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg天各酰胺（Asn）、天冬氨酸（Asp）、胱氨酸（Cys）y-氨基丁酸（GABA）、谷氨酰胺（Cin)、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、赖氨酸（Lys）、蛋氢酸（Met）苯内氨酸（Phe)、脯氨酸Pro）丝氨酸（Ser）、茶氨酸（The）、苏氨酸（Thr）、酪氨酸（Tyr）
额氨酸（al），化合物信息参见附录A中表A1纯度均98%。4.2.16快速定量消纸。
4.2.170.45um水相减膜
4.2.180.45
有机相滤膜
仪器设
氨基酸自动分析仪：配备双通道亚2分析天平：感量0.000
40自筛乳径0.425
移液器：量程分别男
4.4样品
元棉度分高系统粒三元反应夜输送系统。L~200
及100
1000pl
样品按GB/8303-2018中61租6盒靓定制格库百满，充分减匀，装人活净的盛样容器内，作为试样，标明标识
4.5试验步骤
4.5.1标准溶液配制
混合氨基酸标准储备液配
称取各氨基酸标准品适量（精像到0.01mg），用水溶解，配制成混合溶液。混合标准溶液中的茶氮25umal/mL。储备溶液冷冻保存有效期为酸和其他20种氨基酸的浓度分别为5.0001个月。
4.5,1.2混合氨基酸标准工作液配制准确吸取2mL混合氨基酸标准储备液至5mL容量瓶中，用水稀释定容至刻度，混勾，即得到第-份标准济液。将第一份标准溶液用水逐级稀释，制成总共7个不同浓度的系列混合标准工作溶液。7个浓度的混合标准工作溶液中茶氨酸及其他20种氨基酸的浓度分别为：2000.00nmol/mL和500.00nmol/mL,1000.00nmol/mL和250.00nmol/mL，500.00nmol/mL和125.00nmol/mL，250.00nmol/mL和62.50nmol/mL.125.00nmol/mL和31.25nmol/mL,62.50nmol/mL和15.63nmol/mL31.25nmol/mL和7.81nmol/mL，现配现用。2
4.5.2流动相配制
4.5.2.1流动相B,(pH2.8）配制
iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
称取柠檬酸锂（四水）5.73g，氯化锂1.24g柠檬酸19.90g，溶于700mL水中，加入30.0mL无水乙醇，5.0ml硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月性醚，再加0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45m水相滤膜，备用，4.5.2.2流动相B2(pH3.7)配制
称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂6.36g，柠檬酸12.00g，溶于700mL水中，加人30.0mL无水乙醇，5.0mL硫代双乙醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。4.5.2.3流动相Bs（pIl3.6）配制称取柠檬酸锂（四水）8.79g，氯化锂26.62g.柠檬酸11.27g溶700mL水中加入100mL无水乙醇，3.0mL苯甲醇，4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.15μ水相滤膜，备用。4.5.2.4流动相B（pH4.1)配制
称取柠檬酸锂（四水）9.80g，氯化锂38.15g，柠檬酸3.30g，溶于700mL水中，加人4.0mL聚氧乙烯月桂醚，再加人0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用4.5.2.5流动相B.配制
流动相B，为经0.45u水相滤膜过滤后的水。4.5.2.6流动相B配制
称取氢氧化锂8.40g，溶于700mL水中，加人30.0mL无水乙醇，4.0mlL聚氧乙烯月桂醚，再加入0.1mL辛酸，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm水相滤膜，备用。4.5.3柱后衍生化反应溶液配制
4.5.3.1反应溶液R，配制
称取节三酮39.0g.溶于979mL乙二醇甲醚中，超市解5min，过0.45um有机相滤膜，加入硼氢化钠81.0mg，氮气鼓泡30min，放置过夜使用。注：反应液R制备好后宜尽快使用完毕，不宜长期储存。4.5.3.2反应溶液R配制
称取无水乙酸钠204.0g，加入300mL水，123mL冰乙酸，401mL乙二醇甲醚，超声至溶解，转移至1000mL容量瓶中，用水定容，过0.45μm有机相滤膜，氮气鼓泡10min，备用。4.5.3.3反应溶液R3配制
准确移取无水乙醇50ml于1000mL容量瓶中，用纯水定容至1000mL，混勾后过0.45μm有机相滤膜过滤，备用。
GB/T30987—2020
试样提取
iiiKAacJouaKAa
准确称取样品（见4.4）约2.0g（精确至0.0001g）于250mL销形瓶中，加人200ml.沸水冲泡，95C水浴加热，每隔5min混匀一次，提取10min后取出，趁热抽滤，滤液冷却至室温后，用水定容至250mL，混句后取适量样品溶液，经0.45um水相滤膜过滤后待测。4.5.5测定
色谱柱
磺酸型阳离子交换柱，3μm，4.6mmX60mm，或同等性能的色谱柱4.5.5.2
仪器分离体系运行参考条件
流动相配制见4.5.2就动相流速为0.35mL/min.流动相及社温梯度参考条件见表1，仪器进样体积为20μL。
表1氨基酸分析仪分离梯度条件程序时间/mi
通动箱
柱温/℃
时间/min
3氨基酸反应检测体系运行参考条件4.5.5.3
表1(续)
流动相
iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
柱温/C
反应液配制见4.5.3，反应柱温度为135C，反应液流速为0.30ml/min，反应液梯度参考条件见表2。检测器检测波长570nm和440nm。表2
时间/min
4.5.5.4绘制标准工作曲线
氨基酸分析仪反应体系条件程序反应落液
启动氨基酸自动分析仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别吸取不同浓度的系列混合氨基酸标准工作溶液，注人氨基酸自动分析仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分别以各氨基酸蜂面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准工作曲线。通过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。在上述条件（见4.5.5.1~4.5.5.3下，混合氨基酸标准工作溶液色谱图参见附录B中图B.1。4.5.5.5样品测定
用氨基酸分析仪测定样品溶液分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代人标准工作曲线计算含量。以水作为空白样品，在相同测定条件下进行测定，计算空白样品中各氮基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得各样品中氨基酸净含量方法定量限
方法定量限参见附录A中表A.1
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试验数据处理
样品中各游离氨基酸含量的计算见式（1)：W/(c-c)×VXM×10
式中，
iikAa~cJoutakA
试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克（mg/100g）；试样溶液中由标准工作曲线计算山的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每亳升（nmol/mL)；空白试样溶液中由标准工作曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）；试样总体积，单位为毫升（mL）氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)：试样质量，单位为克（g）
试样十物率，测定方法见GB/T8303。以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100g。4.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。5高效液相色谱法（第二法）
5.1原理
伴品中游离氨基酸经6-氨基隆琳-N-羟基珑珀酰亚胺基氨基甲酸酯衍生，使之生成具有荧光的律生物，经液相色谱分离，用荧光检测器测定，保留时间定性，外标工作曲线法定量5.2
试剂或材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的一级水。5.2.1无水砂。
无水磷酸氢二钠。
无水磷酸二氢钾。
盐酸三乙胺
磷酸。
乙腈：色谱纯。
6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯（CAS号：148758-94-2）纯度>98%。氨基酸标准品，见4.2.15。
快速定量滤纸。
0.45um水相滤膜。
0.45m有机相滤膜。
仪器设备
高效液相色谱仪（HPLC)：配备荧光检测器。分析天平：感量0.0001g和0.01mg。5.3.3
涡旋混匀器
移液器：量程分别为10μ~100μ，20μ~200和100μ~1000μ5.3.4
5.4样品
见4.4。
5.5试验步骤
5.5.1混合氨基酸标准工作溶液配制见4.5.1.2。
5.5.2衍生试剂的配制
5.5.2.16-氨基-N-羟基琥珀酰亚胺基氨基甲酸酯溶液iiiKAa~cJouaKAa
GB/T30987—2020
称取6-氨基啉-N-羟基琥珀酰业胺基氨基甲酸酯3.0mg，用1.0mL乙腈溶解，加盖密封涡旋混合10s，置于55C烘箱中加热，直到衔生试剂充分溶解，取出备用。5.5.2.2衍生用缓冲溶液配制
称取无水硼砂10.06g.加水溶解并定容至250mL，用磷酸调节pH至8.8，0.45um水相滤膜过滤后，即得0.20mol/L的硼砂盐缓冲液，备用。5.5.3流动相配制
5.5.3.1800mmol/L磷酸氢二钠储备液配制称取113.568g无水磷酸氢二钠，溶解于800mL水中，加热溶解，冷却至室温后用水定容至1000mL0.45um水相滤膜过滤后备用，溶液pH约为8.90。5.5.3.2800mmol/L磷酸二氢钾储备液配制称取108.872g无水磷酸二氢钾，溶解于800mL水中，加热溶解，冷却至室温后用水定容至1000mL0.45μm水相滤膜过滤后备用，溶液pH约为4.28。5.5.3.31mol/L的盐酸三乙胺水溶液配制取137.650g盐酸三乙胺，用水溶解并定容至1000mL,0.45um水相滤膜过滤后备用，5.5.3.4流动相A（80mmol/L磷酸盐缓冲液）配制准确移取800mmol/L磷酸二氢钾储备液95ml，800mmol/L磷酸氢二钠储备液5mL，lmol/L的盐酸三乙胶水溶液10mL，54mL乙腈，于1000mL容量瓶中，用水定容至1000mL，混匀，超声脱气10min后备用。
5.5.3.5流动相B（80mmol/L磷酸盐缓冲液）配制准确移取800mmol/L磷酸二氢钾储备液100mL到1000mL容量瓶中，加入水250mL，加入乙腈500mL，用水定容至1000mL，混勾，超声脱气10min后备用。5.5.4试样提取
见4.5.4。
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衍生化操作
iiiKAa~cJouaKAa
移取制备好的样品溶液或标准工作溶液10于洁净的玻璃内插管中，加人衍生用缓冲溶液70，然后加入衍生试剂20μL，涡旋混合10，加盖密封于进样瓶中，在室温下静置1min，转移至55℃烘箱中加热10min，取出待测
5.5.6测定
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：C1a5μm，4.6mm×250mm，或同等性能的色谱柱：a)
流动相：具体梯度洗脱程序见表3；b
荧光检测器参数：激发波长250nm，发射波长395nm住温：35℃，
流速：ImL/min
进样体积：5L。
表3高效液相色谱法洗脱程序
时间/min
2绘制标准工作曲线
流动相
启动高效液相色谱仪，设定工作参数，待基线稳定后，分别吸取不同浓度的系列混合氨基酸标准工作溶液，按照5.5.5规定进行行生化操作。行生化完毕后，注人高效液相色谱仪进行测定，分别得到21种氨基酸的峰面积。分别以各氨基酸峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，建立标准工作曲线。适过保留时间识别各氨基酸出峰顺序。在上述色谱条件（见5.5.6.1)下，混合氨基酸标准工作溶液色谱图参见附录 B中图 B,2
样品测定
样品溶液与标准工作溶液在相同条件下进行衍生化和测定操作（衍生完毕的样品建议在48h内完成测定），分别得到样品中各氨基酸色谱峰面积，代入标准工作曲线计算含量。以水作为空白样品，在相同测定条件下进行衍生化和测定，计算空白样品中各氨基酸本底值。样品测定值扣除空白样品中各氨基酸本底值，即得各样品中氨基酸净含量8
5.5.6.4方法定量限
方法定量限参见附录A中表A.1
5.6试验数据处理
伴品中各游离氨基酸含量的计算见式（2）：W,-(c-c)×V×M×10
式中：
iikAa~cJoutakA
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++.0+.++.
W一试样中各氨基酸组分的含量，单位为毫克每100克（mg/100g）。C
试样溶液中中标准工作曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mI）。空白试样溶液中由标准工作曲线计算出的氨基酸浓度，单位为纳摩尔每毫升（nmol/mL）。试样总体积，单位为毫升（mL）。氨基酸的摩尔质量，单位为克每摩尔（g/mol)。试样质量，单位为克（g）。
试样干物率，测定方法见GB/T8303以两次测定的算术平均值作为测定结果，结果精确至0.01mg/100g。5.7精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的12%。液相色谱-串联质谱法（第三法）6
6.1原理
样品经沸水没泡提取后过滤，滤液经稀释后进样，液相色谱-串联质谱仪测定，外标工作曲线法量。
6.2试剂或材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为优级纯。水为符合GB/T6682规定的级水。6.2.1甲酸铵。
6.2.2浓盐酸。
6.2.3甲醇：色谱纯。
6.2.4甲酸：色谱纯。
6.2.5乙睛：色谱纯。
氨苯酸标准品，见4.2.15。
快速定量滤纸。
0.45μm水相滤膜
0.45um有机相滤膜。
仪器设备
液相色谱-串联质谱仪（LC-MS/MS）：配电喷雾离子源（ESID。6.3.2
电子天平：感量为0.c001g和0.01mg。9
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