本标准规定了用指示植物法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法。 本标准适用于植物激素类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定。

ICS07.080
TrrKAa-oJouaKAa
中华人民共和国国家标准
GB/T38577-—2020
植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法
Determination of the biological activity for plant hormone-related secondarymetabolites-Indicator plantmethod2020-03-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-03-31实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由中国标准化研究院提出并归口。TrrKAa-cJouaKAa
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本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院本标准主要起草人：张雅芬、叶子弘、黄超群、马爱进、俞晓平、申居旭萍、许益鹏、崔海峰、李翼、陈丽、吴娟。
1范围
植物激素类次生代谢产物的生物活性测定指示植物法
本标准规定了用指示植物法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法TrrKAa-oJouaKAa
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本标准适用于植物激素类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语、定义和缩略语
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
植物激素类次生代谢产物
planthormone-relatedsecondarymetabolites来自植物自身合成的以及通过微生物发酵或化学合成获得的调控植物生长、发育与休眠的活性物质。
biologicalactivity
生物活性
等浓度的植物激素类次生代谢产物与其相对应的标准物促进或抑制植物生长、发育与休眠能力的相对值。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
GAa：赤霉酸（gibberellieacid）NAA：茶乙酸（l-naphthylaceticacid）ZT：玉米素（zeatin）
一定浓度范围内·植物激素类活性物质的浓度与其促进相应指示植物的特定组织生长或特定物质合成的能力成正比。以标准物NAA为参照，根据小麦胚芽鞘相对伸长量和NAA浓度对数的线性回归关系得到标准曲线，计算在线性范围内使胚芽鞘的相对伸长程度相当的NAA浓度与试样浓度的比值，表示1mg/mL试样所具有的生长素活性：以标准物ZT为参照，根据尾穗觉子叶中觉红素合成量和ZT-
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浓度对数的线性回归关系得到标准曲线，计算在线性范围内使苋红素合成量相当的ZT浓度与试样浓度的比值，表示1mg/m试样所具有的细胞分裂素活性：以标准物GA，为参照，根据大麦种子糊粉层中α-淀粉酶活性和GA，浓度对数的线性回归关系得到标准曲线，计算在线性范围内使诱导产生的α-淀粉酶活性相当的GA：浓度与试样浓度的比值·表示1mg/mL试样所具有的赤霉素活性5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水，5.1小麦种子
小麦（TriticumaestiumL.）.长麦6135。当年采收，颗粒饱满，发芽率≥90%。5.2
尾穗苋种子
尾穗觉（Amaranthus.caudatusL.），红色品种。当年采收，颗粒饱满，发芽率>9o%5.3
大麦种子
大麦（HordeumvulgareL.），二棱大麦。当年采收，颗粒饱满，发芽率≥90%5.41%次氯酸钠溶液
量取100mL10%次氯酸钠，用水定容至1000ml，临用前配制5.50.1%（W/V）淀粉溶液
称取可溶性淀粉1.00g，加水至50mL.加热至完全溶解后，再加人磷酸二氢钾8.16g.待其溶解后用水定容至1000ml。临用前配制。I-KI溶液
称取碘化钟0.60g.碘0.06g，用0.05mol/L的盐酸溶解并定容至1000mL，临用前配制5.71×10-8mol/L乙酸缓冲液
称取三水合乙酸钠0.136g，用水溶解后定容至1000mL.配制成1×10-3mol/L的乙酸钠溶液：用移液枪吸取57μL乙酸溶液.用水定容至1000ml，配制成1×10-mol/L的乙酸溶液。分别量取590ml1×10-mol/lL的乙酸钠溶液与410ml1×10-3mol/L乙酸溶液，混合后，加人1g链霉素，摇匀。
3含L-酪氨酸的磷酸缓冲液
称取l-酪氨酸0.20g.用5.5ml.0.5mol/l.的盐酸溶解：称取十二水合磷酸氢二钠2.39g.磷酸二氢钾0.91g.用水溶解后定容至100mL，配制成1/15mol/L的磷酸缓冲液（pH7.0）。将两者混匀后定容至500ml4℃保存备用。
9磷酸-柠檬酸缓冲液·pH5.0
称取磷酸氢二钾1.80g，柠檬酸1.02g，煎糖20g，加人900mL水溶解后用pH计测量并调整pH至5.0.用水定容至1000ml..充分混匀后.4℃保存备用2
纯度98%。
纯度≥98%。
纯度≥98%。
1mg/mLNAA标准购备液
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称取10.0mgNAA标准品，用0.5mL无水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混勾后，4℃冰箱冷藏，保存期1个月。
5.141mg/mLGAs标准备液
称取10.0mgGA，标准品，用0.5ml.无水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混匀后，4℃冰箱冷藏·保存期1个月。
1mg/mLZT标准购备液
称取10.0mgZT标准品.用0.5mL无水乙醇溶解，用水定容至10mL.充分混匀后，4℃冰箱冷藏，保存期1个月。
5.16NAA标准工作液
吸取1mL1mg/mlLNAA标准贮备液，加人至9ml，磷酸-柠檬酸缓冲液中，混匀.得1×10-mg/mLNAA溶液。依次10倍稀释得1.00X10mg/ml、1.00×10-mg/mL、1.00×10-mg/ml.NAA标准工作液。吸取316μl.1mg/ml.NAA标准贮备液，684l磷酸-柠檬酸缓冲液，混匀，得3.16×10-mg/mlNAA溶液。依次10倍稀释得3.16×10-mg/ml3.16×10-mg/mlNAA标准工作液。临用前配制。5.17GA标准工作液
吸取1ml1mg/mlGA：标准贮备液，加人至9ml.乙酸缓冲液中，混匀，得1×10-mg/mL溶液。依次10倍稀释得1.00X10-mg/ml、1.00×10-mg/mL，1.00×10-mg/mlGA标准工作液。吸取316μL1mg/ml.GA，标准贮备液，684μL乙酸缓冲液，混匀，得3.16×10-mg/mlGA溶液。依次10倍稀释得3.16×10=mg/mL、3.16×10-mg/mlL.3.16×10-mg/mLGA标准工作液。临用前配制。
ZT标准工作液
吸取1mL,1mg/mLZT标准贮备液，加人至9mL.含L-酪氨酸的磷酸缓冲液中，混匀.得1×10-！mg/mL.ZT溶液。依次10倍稀释得1.00×10-mg/mL、1.00×10*mg/ml1.00×10-mg/mLZT标准工作液。吸取316μlL1mg/ml.ZT标准贮备液，684μl.含[-酪氨酸的磷酸缓冲液，混匀.得3.16×10-1mg/mL.ZT溶液。依次10倍稀释得3.16×10mg/ml、3.16×10-smg/mL.ZT标准工作液。临用前配制。
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6仪器设备
离心机：10000×g。
紫外分光光度计。
pH计：精度0.01。
电子分析天平：精度1g.0.01g.0.0001g。6.4
5生化培养箱：25℃土1℃.遮光处理。6.5
6.6摇床：25℃±1℃，遮光处理6.7
体式显微镜：带图像处理系统
绿光暗室：波长492nm~455nm。
研磨珠：直径1mm~2mm。
恒温水浴锅：30℃士1℃。
高速震荡研磨仪
7样品
7.1样品采集保存
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用电子分析天平称量大于10mg从植物、微生物发酵液中提取纯化或化学合成的待测物质纯品，用10mL乙醇溶解，记录待测物质浓度c（mg/mL）。然后进行分装，4℃低温避光保存.至少分装3份，其中分装后每小份不少于1ml.。用电子分析天平称量约1000mg供试固态产品，用10mL产品说明书规定的试剂溶解，或用量筒量取10mL液态产品，按产品说明书中说明的待测物质的含量计算待测物质浓度，记为c。（mg/ml）。然后进行分装，按产品说明书要求保存，至少分装3份，其中分装后每小份不少于1mL。7.2
试样制备
试验时按不同检测对象选择相应的缓冲液（参见附录A）.在1×10-mg/mL~1×10-mg/ml范围内将样品进行5倍或10倍梯度稀释，稀释后浓度记为c，（mg/mL）。试样至少制备3个浓度梯度，每个浓度样品至少重复测量3次。
8试验步骤
8.1生长素测定
8.1.1小麦胚芽鞘切段获取
小麦种子用现配1%次氯酸钠溶液浸泡杀菌15min，蒸馏水洗净，重复一次。然后在无光照的25c生化培养箱中培养至幼苗长约25mm~35mm时选取长度为25mm~30mm的幼苗株，从基部取下芽鞘.在绿光暗室中切去3mm~5mm顶端，切取接下来的约6mm切段，放人磷酸-柠檬酸缓冲液中，在25℃摇床中摇1.5h（≤80r/min），每0.5h换一次溶液。8.1.2胚芽鞘长度测量
将获取的胚芽鞘切段置于体式显微镜下测量后记录长度（L），一对一做好标记后，分别置于等量的磷酸-柠檬酸缓冲液、不同浓度的NAA标准品工作液以及不同浓度的试样溶液中，生化培养箱25℃4
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培养24h。然后将处理后的胚芽鞘置手体式显微镜下测量并记录长度（L）。计算每个胚芽销实际伸长长度△L，取重复测试结果绝对差值不超过算术平均值的20%的5组数据。以磷酸-柠檬酸缓冲液处理后胚芽鞘实际伸长长度的平均值△L。为对照。8.1.3标准曲线绘制
参照附录A中表A.1进行数据测量记录及计算。以△L/△L。计算标准品工作液处理后胚芽鞘的相对伸长程度，以10为底取标准品工作液浓度的对数值x为自变量，以处理后胚芽鞘切断的相对伸长程度为因变量3·绘制标准曲线。8.1.4测量
参照表A.1测量并计算试样处理后胚芽鞘的相对伸长程度（△L/△L）y.y值在标准曲线线性范围的试验视为有效试验，记录试样浓度e，无效试验所获得的数据舍去。然后依据有效y值从标准曲线中计算2，按式（1）计算试样中牛长素类物质的生物活性，若有多个有效y值，则按式（1）计算后取其平均值。
EAuin=CoX10
式中：
生长素的生物活性，单位为E；
待测试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；标准工作液浓度的对数值；
稀释后试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）。以3次以上独立实验结果的平均值为试样的生长素活性定值，计算结果保留三位有效数字。8.24
细胞分裂素测定
8.2.1尾穗苋幼苗的获取
将2g左右的尾穗苋种子用现配的1%次氯酸钠溶液浸泡杀菌15min，蒸馏水洗净，重复一次。然后置于25℃生化培养箱吸胀5h.然后平铺在培养皿中用9mlL蒸馏水湿润的两层18cm定性滤纸上，覆膜加盖，25℃黑暗培养72h后选取子叶大小均一的黄化幼苗。8.2.2宽红素浓度测量
随机选取30株黄化幼苗作为一个试验单元，分别用等量的含1-酪氨酸的磷酸缓冲液，不同浓度标准品工作液和不同浓度的试样溶液在25℃生化培养箱中诱导培养48h，然后选取大小、颜色相对均一的子叶40个转人盛有1mL.蒸馏水的2mL离心管中，加人适量研磨珠，用高速震荡研磨仪在50Hz频率下震荡研磨5min破碎细胞.用离心机1o000g离心5min后，取0.8mL上清液加人事先加好4.2ml蒸馏水的离心管，以含L-酪氨酸的磷酸缓冲液调零，用紫外分光光度计测量，在波长为534nm和650nm处分别读取光密度值ODs3和ODo，计算相减的差数（ODs34一OD50）记为D，，指示觅红素浓度。计算含L-酪氨酸的磷酸缓冲液处理后的光密度值的平均值作为对照D。。8.2.3标准曲线绘制
参照表A.2进行数据测量记录并计算，以D.一D。指示标准品工作液处理后克红素浓度的增加值。以10为底取标准品工作液浓度的对数值为自变量，以克红素浓度的增加值为因变量y，绘制标准曲线。
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8.2.4测量
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参照表A.2测量并计算试样处理后克红素浓度的增加值·y值在标准曲线线性范围的试验视为有效试验，记录试样浓度c.，无效试验所获得的数据舍去。然后依据有效值从标准曲线中计算，按式（2）计算试样中细胞分裂素类物质的生物活性，若有多个有效y值，则按式（2）计算后取其平均值。EcTK=C×10bzxz.net
式中：
细胞分裂素的生物活性，单位为E：Co
待测试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/ml)；标准工作液浓度的对数值：
稀释后试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）.....2)
以3次以上独立实验结果的平均值为试样的细胞分裂素活性定值，计算结果保留三位有效数字。8.3
赤霉素测定
8.3.1大麦无胚半粒种子的获取
将大麦种子横切两半，选择无胚的一半，用现配的1%次氯酸钠溶液浸泡杀菌15min，蒸馏水洗净，重复1次。然后于湿润消毒滤纸上25℃吸胀48h.然后在乙酸缓冲液中，以50r/min~100r/min摇1.5h，每0.5h换1次水，取出后轻轻吸干备用。8.3.2α-淀粉酶活性测量
将已吸胀的10个麦无胚半粒种子作为一个试验单元。分别用1mL的乙酸缓冲液、不同浓度GAs标准品工作液以及不同浓度的试样溶液诱导处理，在25℃摇床中60r/min~100r/min震荡培养24h。将种子研碎混匀后在离心机中1000r/min离心5min，使种子碎屑沉淀·然后吸取上清液0.4ml至新的10ml.离心管中.加人1.6mL0.1%淀粉溶液.混匀.30℃水浴10min。再加人，-Kl溶液2mL，蒸馏水定容至5mL，充分摇匀至溶液呈蓝色，以乙酸缓冲液调零，用紫外分光光度计测量，读取每管中溶液的OD值指示α-淀粉酶活性。计算乙酸缓冲液处理后的光密度值的平均值D。作为对照。
8.3.3标准曲线绘制
参照表A.3进行数据测量记录并计算，以D，一D。指示标准品工作液处理后α-淀粉酶活性的增加值。以10为底取标准品工作液浓度的对数值为自变量，以α-淀粉酶活性的增加值为因变量y，绘制标准曲线。
8.3.4测量
参照表A.3测量并计算试样处理后α-淀粉酶活性的增加值（D,一D。）y·y值在标准曲线线性范围的试验视为有效试验，记录试样浓度c，·无效试验所获得的数据舍去。然后依据有效y值从标准曲线中计算，按式（3）计算试样中赤素类物质的生物活性，若有多个有效值，则按式（3）计算后取其平均值。
式中：
EGA=CX10*
EGA—赤霉素的生物活性，单位为E；6
稀释后试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；标准工作液浓度的对数值；
待测试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL)。TrrKAa-cJouaKAa
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以3次以上独立实验结果的平均值为试样的赤霉素活性定值，计算结果保留三位有效数字，重复性
在重复性条件下获得的3次独立测定结果的绝对值差值不得超过算术平均值的20%。7
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A.1生长素活性检测数据记录见表A.1。表A.1
测量指标
Lo1/μm
Len/um
Li/μm
AL/μm
标准曲线
对照组
磷酸-柠檬
酸溶液
附录A
（资料性附录）
检测数据记录表
生长素活性检测数据记录表
NAA标准品溶液浓度/（mg/mL）
1.00×10-
3.16×10-
细胞分裂素活性检测数据记录见表A.2。1.00×10-
3.16×10-61
1.00×10-
细胞分裂素活性检测数据记录表对照组
测量指标
ODanel
含L-酪氨酸
的磷酸
缓冲液
ZT标准品溶液浓度/（mg/mL）
3.16×10-
1.00×10-
3.16×10-
1.00×10-
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试样溶液浓度/（mg/mL）
试样溶液浓度/（mg/mL）
并规化标
D-D。
标准性活
含L-酪氨测
的磷测
缓冲液
活A.2（续）
ZT标准品溶液示物/（mg/mL）
1.00×10-5
3.16×10-
1.00×10-
大子归计量中并产生记录见细A.3。活A.3
定照次
并规化标
缓冲液
标准性活
1.00×10-
3.16×10-
类次植物激代素谢产的生活
1.00×10~
GA标准品溶液示物/（mg/mL）
1.00×10-5
3.16×10-
3.16×10-
rrKAa-cJouaKAa
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用长溶液示物/（mg/mL）
100×10-
用长溶液示物，
(mg/mL)
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