GB/T 40251-2021
基本信息
标准号： GB/T 40251-2021
中文名称：牡蛎单孢子虫病诊断规程原位杂交法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 40251-2021.Code of diagnosis for MSX disease of oysters-In situ hybridization method.
1范围
GB/T 40251规定了牡蛎单孢子虫病诊断规程中病原定位方法的要求,针对主要病原尼氏单孢子虫(Haplosporidiumnelsoni),给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40251适用于尼氏单孢子虫在牡蛎中感染程度的评估和确诊;其他贝类也可参照执行。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SC/T 7205.1-2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AP:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)
BCIP:5-溴-4-氣-3-吲哚磷酸甲苯胺盐( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt)
DAFA:戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液(davidson' s alcohol-formalin- acetic acid fixative)
DIG :地高辛(digoxigenin)
1范围
GB/T 40251规定了牡蛎单孢子虫病诊断规程中病原定位方法的要求,针对主要病原尼氏单孢子虫(Haplosporidiumnelsoni),给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40251适用于尼氏单孢子虫在牡蛎中感染程度的评估和确诊;其他贝类也可参照执行。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SC/T 7205.1-2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分:组织印片的细胞学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AP:碱性磷酸酶(alkaline phosphatase)
BCIP:5-溴-4-氣-3-吲哚磷酸甲苯胺盐( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt)
DAFA:戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液(davidson' s alcohol-formalin- acetic acid fixative)
DIG :地高辛(digoxigenin)
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标准内容
ICS 65.020.30
CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T40251—2021
牡蛎单孢子虫病诊断规程
原位杂交法
Code of diagnosis for MSX disease of oysters--In situ hybridization method2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
GB/T 40251—2021
本文件按照GB/T1.1
2020%标准化工作导则
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草：
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件山全国水产标雅化技术委员会（SAC/C156)。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推总站。本文件士要起草人：白吕明、杨冰、工崇明、黄健、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨、余卫忠。I
-rrKaeerkca-
1范围
牡蛎单孢子虫病诊断规程
原位杂交法
GB/T-40251—2021
本文件规定了牡蛎单孢了虫病诊断规程中病原定位方法的要求，针对主要病原尼民单孢子虫（Haplosporidiumnetsoni），给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备，样品、试验步骤和结果判定。
本文件适用于尼氏单孢了出在牡蛎中感染程度的评估和确诊；其他贝类也可参照执行。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中.注日期的引用文件，仅该口期对应的版本适用于本文件：不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修收单)适用于本文件。
SC/T7205.1一2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：纠织印片的圳胞学诊断法3术语和定义
本文件设石需要界定的术语和定义，4缩略语
下列缩略语适用丁本文件：
AP:碱性磷酸酶(alkaline phosphalase)BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatc p-toluidinc salt)DAFA：戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液（davidsonsalcohol-forinalin-acelic acidfixalive）DIG：地高辛(digoxigcnin)
EDTANa:·2H.O：二水合乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetrazicetic acid，clisoclium dlihydrate)
MgCl：·6H，：六水合氛化镁（magncsiumchloridehcxahydrate）NaCl：氯化钠（sodiurmehloride)NaHPO·12H：+水台磷酸氧钠（sodiumphosphatcdibasicdodecahydrate）NaC,Il0，210：二水合柠檬酸钠(socliun citratedihydrate)）NBT：氯化硝基四氮唑蓝（4-Nitro blue ttlrazoliutn c:hloride)KHPO)：磷酸二氢钾（potassiumphosphatemonobasic）KCl：氯化钾（potassium chloride）PBS.磷酸盐缓液（phosphatebuferxalin:buffer）SSc：橡酸钠缓冲液saline sodium citrate buffer）Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris_hydroxymethylaminomethane）1
rKaeerkca-
GB/T 40251—2021
Triton X-1o0:聚乙一醇辛基苯基继(Polyethylenc glycol tcrt-octylphcnyl cther)5试剂或材料
除非另有说明在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馅水或去离了水或机当纯度的水。5.1
Nacl。
Na.C,H,0, 2H,0.
Na:HP0, -12H,0。
Triton X-100.
MgCl, -611.0.
EDTA-Na:· 2H.O。
蛋白酶K。
多聚赖氮酸（相对分了质量25.000)聚乙烯醇（相对分子质量30000～70000），盐酸左旋咪唑。
碑斯友棕Y：
牛血清蛋。
聚燕粘400
聚乙烯吡咯烷酮360。
案聚核酸探计MSX1317,序列:5?-ATG-G7-TGG-TGA-CGC-TAA-CCG-3\,合成时用DIG标记的脱氧核糖核甘尿嘧啶代替脱氧核糖核胸腺嘧啶残基。5.22Www.bzxZ.net
阳性对照：已知受尼氏单抱子虫感染，且原位杂交结果显示阳性的贝类组织样本，阴性对照：已知术受尼氏单孢子虫感染，且原位杂交结果显示阴性的贝类组织样本。石蜡熔点52℃~-54℃）：切片级。甲酰胺：
丹哈特液（Denhardt's）。
鲤精IVA。
硫酸葡聚糖，
山羊血清，
二中基中酰胺。
浓盐酸：
碱性磷酸酶偶联的DIG抗体（AP抗DIG,0.75L/μL.4C)：牛化试剂。二甲苯，
中性树胶：生物染色用。
无水乙醇。
93%乙醇。
中醛（37%）。
冰醋酸，
-rrKaeerkca-
过滤海水：经纱网（200日)过滤的海水DAFA固定液：按附录A的A.1配制。80X乙醇：按A.2配制
70X乙醇：按A.3配制，
50火乙醇：按A.1配制。
500ng/ml.多聚赖氨酸：按A.5配制。2×SSC.按A.7配制，
1×SSC.按A.8配制，
0.5XSSC:按A.9配制。
PBS：按A.10配制
100g/ml.蛋白酶K：按A.12配制，0.4光甲醛：按A.13配制。
交缓冲液：按A,14配制。
缓冲液I:接A.16 配制。
缓冲液Ⅱ：按A.17配制。
缓冲液Ⅲ：按A.19配制。
缓冲液IV：按A.21配制。
显色液：按A.23配制，
0.5光伸斯麦棕Y（HisinarkbrownY）：接A.24配制：6仪器设备
石蜡切片机：满足4m~7um序度的石蜡连续切片要求显微镜：配备高倍镜（40×）和油镜（100×）。微量移液器：量程0.5μl.~10pl、200μL-~1000μl.c普通冰箱。
切片保湿孵育箱。
展片水浴锅。
烘片机。
7样品
采样对象
牡蛎、扇贝和蛤等易感双壳贝类。7.2
采样数量、方法和保存运输
GB/T 40251—2021
采样数量、方法利保存运输应符合SC/T7205.12007录B的要求。海水温度高于10“，且盐度高丁15%时为采样的最佳时期。7.3样品的采集
稚贝（附着后~2mm）和幼贝（2mm~-30mm）取内脏团；成贝（30mm）取胃、肠道、闭壳肌和外套膜。
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GB/T 40251—2021
8试验步骤
8.1组织切片制备
8.1.1 脱水
织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中；流程如下：70头乙醇（1h45min）→80%乙醇(1 h 45min)→80%乙醇(1h45 min)→95%乙醇(45min)→95%乙醇(45min)→无水乙醇(45 min)→无水乙醇（45 min)。
8.1.2透明
脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇：二中苯（1：1)混合液和二中苯溶液的烧杯中，流程如下：无水乙醇：一甲苯(1：1)(25tnin)→—巾苯20 tin)→—甲苯(20 tnin)。8.1.3浸蜡
恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下：透明后的组织块依次浸人两个盛行融化石蜡的烧杯中各80 min，
8.1.4包理
将恒温箱温度调节举高于石蜡熔点进行熔蜡，将熔蜡倒人包理盒与包埋模具·也可用折叠纸盒；用预温的锻子迅速夹取组织块.切面朝下平放在模具底部；轻轻提起模具，置于冰上侦其冷却凝固。8.1.5切片
用蜡铲或刀片将包理块叫固修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2mm~3mm的石蜡。用石切片机切片，厚度5m，对每个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片。8.1.6展片
将划片平放展片水浴锅水面上，待仲展平整后.用涂有多聚赖氨酸的载玻片捞出；置于烘片机上或烘箱内，45℃烘片2h。
8.2原位杂交
8.2.1组织切片（包括阴性对照和阳性对照）依次道过甲苯（2次，5min/次）、无水乙醇（2次，10min/次）95%乙醇（2次，10s/次）、80%乙醇（2次.10s/次）、50%乙醇（1次，10s）.然后用双蒸水冲洗2次（每次3min）
8.2.2切片平放在切片保湿孵箱中.吸取500μl.100μg/ml.蛋[酶K溶液，加到每张组织切片上37C孵育15min。
8.2.3把组织切片上的蛋酶K溶液吸净，然后将其浸人预冷到4℃的U.4关中醛溶液中5mi8.2.4室温下，用2大ssC浸洗组织切片5min8.2.5把组织切片平放在切片保瀛孵育箱，添所500l杂交缓冲液至每张组织切片，42C孵育60 min.
8.2.6添加500μL含2ng/μLDIG标记的京聚核背酸探针杂交混合液至每张组织切片，置丁90~95℃平板烘片机上保温10min
8.2.7、将组织切片置于平整的冰面上率冷1min。4
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8.2.8在切片保湿孵育箱内12℃下食16h~18hGB/T-40251—2021
8.2.9依次用缓冲液 2×SSC(5 min.室温）2XSSC(5 min.室温）1×SSC(5 min，室温）,1X×SSC(5min，空温）、0.5×SSC（10min,42℃）、0.5×SSC(10rmin,42C）浸洗组织切片，然后将组织切片放人缓冲液|(1 min~2min,空温）。
8.2.10加500μL缓冲液Ⅱ封闭组织切片，37℃温浴30min：8.2.11用缓冲液Ⅱ将AP-抗DIG稀释至0.75 U/L(1叫l.0.75U/I.AP-抗DIG加到1mL缓冲液Ⅱ中）添加250μL至每张组织切片，在湿盒中37C温浴3h，8.2.12用缓冲液爪（2次，5min/次，室温）缓冲液m（2次5rmin/次.室温）浸洗组织切片：8.2.13吸500μI.显色液」每张组织切片上,在暗处」室温放置1h~3h,随时观察品色情况，当阳性对照有明显显色或阴性对照开始普遍山现非特兄性显色，立即终止显色。8.2.14把组织切片置于缓冲液I15min终止反应8.2.15组织切片依次在双蒸水（1次.10s）、0.5%伸斯麦棕Y（1次.1min）、95%乙醇（3次.10s/次）、无水乙醇（3次，10s/次）、二甲苯（4次，10s/次）中浸洗：8.2.16空气自然下媒后，滴加2滴中性树胶.封片。8.2.17
显微镜下（400倍），寻找着色明显的蓝黑色杂交信号，并拍照，9结果判定
9.1检测结果成立条件
阳性对照样品组织病灶部位观察到明显的蓝黑色杂交信号，阴性对照样品组织中术观察到任何的蓝黑色杂交信号，实验有效，
检测结果判定
检测样品红织中观察到蓝黑色杂交信号（参见附录B），则原位杂交检测结果为阳性，判定为尼民单饱子出感染：待测样品组织中未观察到蓝黑色杂交信号.则原位杂交检测结果为阴性。牡蛎单孢子出病及其干要病原简介参见附录C
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GB/T 40251—2021
DAFA固定液
95%乙醇
甲醛（37%）
冰醋酸
过滤海水
混匀，室温密封账存。
80%乙醇
95%乙醇
加水定容
混匀，室温必存。
70%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混匀，室温贮存。
50%乙醇
95%乙醇
加水容至
泥匀，室温存。
500μg/mL多聚赖氨酸
多聚赖氨酸（相对分了质量25000）加水定容至
泥匀，4℃存
20×SSC
Na,C.H.O, - 2H,0
加水溶解定容至
调节 pH至
高斥蒸气火菌后，室温贮存。
2×SSC
20xSSC
附录A
（规范性）
试剂配方
1000mL
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B1xSSC
20×SSC
90.5×SSC
20xSSC
Na, HPO+ : 12H.O
加水定容至
10 mg/mL蛋白酶K
蛋白酶K
加水定容至
1950mL
1 000 ml
分装于尤菌离心管中（0.25mL/管），一20℃下保存100μg/ml蛋白酶K
10 mg/ml蛋白酶K
用前临时配制，混勾，4℃存放。0.4%甲醛
中醛（37%）
倒掉前可重复使用4次，用前预冷。杂交缓冲液
20×SSC
100%甲酰胺
20×丹哈特液（Denhardi's）
10tng/ml鲢精DVA
25%硫酸葡聚糖
混匀,1℃存。
10×缓冲液I
加水溶解率
用浓HCI调节pH卒
24.75 ml.
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GB/T 40251—2021
GB/T 40251—2021
加水定容率
高压蒸气灭菌·4～贮存。
缓冲液
10×缓冲液1
混匀.0.454m滤膜过滤除菌，4℃贮存A.17
缓冲液Ⅱ
Triton X-100
山羊血清
缓冲液
1000ml
900 mL
100 mL
在60℃80℃水浴中溶解，不断动，直至颗粒溶解。4℃可存2周。A.18
10×缓冲液Ⅲ
加水溶解至
用浓IICl调节pl至
MgCl,-6H,0
加水定穿率
1000ml
混匀,0.15μm滤膜过滤除菌，1℃贮存,山现沉淀后丢齐。缓冲液亚
10X缓冲液Ⅲ
混勾，0.45m滤膜过滤除菌，4℃贮存，出现沉淀后丢弃。A.20
10×缓冲液V
EDTA-Na·2HO
加水溶解.并定容至
用HCI调pH至8.0.高压火菌，4C贮存A.21缓冲液IV
10/缓冲液IV
混勾,0.45um滤膜过滤除齿。4℃定存。A.2210%聚乙烯醇
聚乙烯醇（相对分子质量3000070000）加水济解至
揽拌溶解后.分装10ml/替，一20“C贮存。12.1g
1000mL
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显色液
缓冲液Ⅲ
盐酸左旋咪唑
10%聚乙烯醇
4℃保存
用前在年1ml.上述混合液中如：NBT
0.5%碑斯麦棕Y
斯麦棕Y
把染料溶于水中,过滤。空温贮存。A.25
NBT贮存液
王基王酰胺
避光，一20℃贮存。
BCIP贮存液
甲基甲酰唤
避光，一20贮存。
20×丹哈特液
牛血清白蛋白
聚蔗糖400
聚乙烯吡咯烷酮360
加水溶解并定容率
0.45μm的滤器过滤，5mL/支分装，一20℃存。25%硫酸葡聚糖
硫酸葡聚糖
加水定容至
低热搅拌片刻使之溶解：20℃保存。10mg/ml鲑精DNA
精TNA
GB/T 40251—2021
将链精DNA钢盐加入水中，用坡瑙棒搅拌直至完全溶解。用6弓针头的注射器反复抽打数次，在100℃.水浴中加热10min，立即放于冰浴中率冷，分装于无菌小试替中，一20保存。使用前在100℃水浴中加热5min.然后淬冷-rrKaeerKAca-
GB/T40251—2021
原位杂交法示例见图B.1，
2012ElsevierInc.
说明：
附录B
（资料性）
尼氏单孢子虫原位杂交检测结果示例蓝黑颗粒为染交信号（等头所示）。20μm
图B.1长牡蛎（Crassostrea gigas）感染尼氏单孢子虫原位杂交检测结果10
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CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T40251—2021
牡蛎单孢子虫病诊断规程
原位杂交法
Code of diagnosis for MSX disease of oysters--In situ hybridization method2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
GB/T 40251—2021
本文件按照GB/T1.1
2020%标准化工作导则
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草：
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件山全国水产标雅化技术委员会（SAC/C156)。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推总站。本文件士要起草人：白吕明、杨冰、工崇明、黄健、李清、万晓媛、辛鲁生、李晨、余卫忠。I
-rrKaeerkca-
1范围
牡蛎单孢子虫病诊断规程
原位杂交法
GB/T-40251—2021
本文件规定了牡蛎单孢了虫病诊断规程中病原定位方法的要求，针对主要病原尼民单孢子虫（Haplosporidiumnetsoni），给出了原位杂交检测法所需试剂或材料、仪器设备，样品、试验步骤和结果判定。
本文件适用于尼氏单孢了出在牡蛎中感染程度的评估和确诊；其他贝类也可参照执行。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中.注日期的引用文件，仅该口期对应的版本适用于本文件：不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修收单)适用于本文件。
SC/T7205.1一2007牡蛎包纳米虫病诊断规程第1部分：纠织印片的圳胞学诊断法3术语和定义
本文件设石需要界定的术语和定义，4缩略语
下列缩略语适用丁本文件：
AP:碱性磷酸酶(alkaline phosphalase)BCIP:5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸-甲苯胺盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphatc p-toluidinc salt)DAFA：戴维森氏乙醇-福尔马林-乙酸固定液（davidsonsalcohol-forinalin-acelic acidfixalive）DIG：地高辛(digoxigcnin)
EDTANa:·2H.O：二水合乙二胺四乙酸二钠（Ethylenediaminetetrazicetic acid，clisoclium dlihydrate)
MgCl：·6H，：六水合氛化镁（magncsiumchloridehcxahydrate）NaCl：氯化钠（sodiurmehloride)NaHPO·12H：+水台磷酸氧钠（sodiumphosphatcdibasicdodecahydrate）NaC,Il0，210：二水合柠檬酸钠(socliun citratedihydrate)）NBT：氯化硝基四氮唑蓝（4-Nitro blue ttlrazoliutn c:hloride)KHPO)：磷酸二氢钾（potassiumphosphatemonobasic）KCl：氯化钾（potassium chloride）PBS.磷酸盐缓液（phosphatebuferxalin:buffer）SSc：橡酸钠缓冲液saline sodium citrate buffer）Tris：三羟甲基氨基甲烷（Tris_hydroxymethylaminomethane）1
rKaeerkca-
GB/T 40251—2021
Triton X-1o0:聚乙一醇辛基苯基继(Polyethylenc glycol tcrt-octylphcnyl cther)5试剂或材料
除非另有说明在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馅水或去离了水或机当纯度的水。5.1
Nacl。
Na.C,H,0, 2H,0.
Na:HP0, -12H,0。
Triton X-100.
MgCl, -611.0.
EDTA-Na:· 2H.O。
蛋白酶K。
多聚赖氮酸（相对分了质量25.000)聚乙烯醇（相对分子质量30000～70000），盐酸左旋咪唑。
碑斯友棕Y：
牛血清蛋。
聚燕粘400
聚乙烯吡咯烷酮360。
案聚核酸探计MSX1317,序列:5?-ATG-G7-TGG-TGA-CGC-TAA-CCG-3\,合成时用DIG标记的脱氧核糖核甘尿嘧啶代替脱氧核糖核胸腺嘧啶残基。5.22Www.bzxZ.net
阳性对照：已知受尼氏单抱子虫感染，且原位杂交结果显示阳性的贝类组织样本，阴性对照：已知术受尼氏单孢子虫感染，且原位杂交结果显示阴性的贝类组织样本。石蜡熔点52℃~-54℃）：切片级。甲酰胺：
丹哈特液（Denhardt's）。
鲤精IVA。
硫酸葡聚糖，
山羊血清，
二中基中酰胺。
浓盐酸：
碱性磷酸酶偶联的DIG抗体（AP抗DIG,0.75L/μL.4C)：牛化试剂。二甲苯，
中性树胶：生物染色用。
无水乙醇。
93%乙醇。
中醛（37%）。
冰醋酸，
-rrKaeerkca-
过滤海水：经纱网（200日)过滤的海水DAFA固定液：按附录A的A.1配制。80X乙醇：按A.2配制
70X乙醇：按A.3配制，
50火乙醇：按A.1配制。
500ng/ml.多聚赖氨酸：按A.5配制。2×SSC.按A.7配制，
1×SSC.按A.8配制，
0.5XSSC:按A.9配制。
PBS：按A.10配制
100g/ml.蛋白酶K：按A.12配制，0.4光甲醛：按A.13配制。
交缓冲液：按A,14配制。
缓冲液I:接A.16 配制。
缓冲液Ⅱ：按A.17配制。
缓冲液Ⅲ：按A.19配制。
缓冲液IV：按A.21配制。
显色液：按A.23配制，
0.5光伸斯麦棕Y（HisinarkbrownY）：接A.24配制：6仪器设备
石蜡切片机：满足4m~7um序度的石蜡连续切片要求显微镜：配备高倍镜（40×）和油镜（100×）。微量移液器：量程0.5μl.~10pl、200μL-~1000μl.c普通冰箱。
切片保湿孵育箱。
展片水浴锅。
烘片机。
7样品
采样对象
牡蛎、扇贝和蛤等易感双壳贝类。7.2
采样数量、方法和保存运输
GB/T 40251—2021
采样数量、方法利保存运输应符合SC/T7205.12007录B的要求。海水温度高于10“，且盐度高丁15%时为采样的最佳时期。7.3样品的采集
稚贝（附着后~2mm）和幼贝（2mm~-30mm）取内脏团；成贝（30mm）取胃、肠道、闭壳肌和外套膜。
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8试验步骤
8.1组织切片制备
8.1.1 脱水
织块依次浸入盛有不同浓度乙醇溶液的烧杯中；流程如下：70头乙醇（1h45min）→80%乙醇(1 h 45min)→80%乙醇(1h45 min)→95%乙醇(45min)→95%乙醇(45min)→无水乙醇(45 min)→无水乙醇（45 min)。
8.1.2透明
脱水后的组织块依次浸人盛有无水乙醇：二中苯（1：1)混合液和二中苯溶液的烧杯中，流程如下：无水乙醇：一甲苯(1：1)(25tnin)→—巾苯20 tin)→—甲苯(20 tnin)。8.1.3浸蜡
恒温箱温度调节至高于石蜡熔点，流程如下：透明后的组织块依次浸人两个盛行融化石蜡的烧杯中各80 min，
8.1.4包理
将恒温箱温度调节举高于石蜡熔点进行熔蜡，将熔蜡倒人包理盒与包埋模具·也可用折叠纸盒；用预温的锻子迅速夹取组织块.切面朝下平放在模具底部；轻轻提起模具，置于冰上侦其冷却凝固。8.1.5切片
用蜡铲或刀片将包理块叫固修平，使上下两面修成平行面，保留组织周围附着宽2mm~3mm的石蜡。用石切片机切片，厚度5m，对每个石蜡包埋块至少切取两张不连续的切片。8.1.6展片
将划片平放展片水浴锅水面上，待仲展平整后.用涂有多聚赖氨酸的载玻片捞出；置于烘片机上或烘箱内，45℃烘片2h。
8.2原位杂交
8.2.1组织切片（包括阴性对照和阳性对照）依次道过甲苯（2次，5min/次）、无水乙醇（2次，10min/次）95%乙醇（2次，10s/次）、80%乙醇（2次.10s/次）、50%乙醇（1次，10s）.然后用双蒸水冲洗2次（每次3min）
8.2.2切片平放在切片保湿孵箱中.吸取500μl.100μg/ml.蛋[酶K溶液，加到每张组织切片上37C孵育15min。
8.2.3把组织切片上的蛋酶K溶液吸净，然后将其浸人预冷到4℃的U.4关中醛溶液中5mi8.2.4室温下，用2大ssC浸洗组织切片5min8.2.5把组织切片平放在切片保瀛孵育箱，添所500l杂交缓冲液至每张组织切片，42C孵育60 min.
8.2.6添加500μL含2ng/μLDIG标记的京聚核背酸探针杂交混合液至每张组织切片，置丁90~95℃平板烘片机上保温10min
8.2.7、将组织切片置于平整的冰面上率冷1min。4
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8.2.8在切片保湿孵育箱内12℃下食16h~18hGB/T-40251—2021
8.2.9依次用缓冲液 2×SSC(5 min.室温）2XSSC(5 min.室温）1×SSC(5 min，室温）,1X×SSC(5min，空温）、0.5×SSC（10min,42℃）、0.5×SSC(10rmin,42C）浸洗组织切片，然后将组织切片放人缓冲液|(1 min~2min,空温）。
8.2.10加500μL缓冲液Ⅱ封闭组织切片，37℃温浴30min：8.2.11用缓冲液Ⅱ将AP-抗DIG稀释至0.75 U/L(1叫l.0.75U/I.AP-抗DIG加到1mL缓冲液Ⅱ中）添加250μL至每张组织切片，在湿盒中37C温浴3h，8.2.12用缓冲液爪（2次，5min/次，室温）缓冲液m（2次5rmin/次.室温）浸洗组织切片：8.2.13吸500μI.显色液」每张组织切片上,在暗处」室温放置1h~3h,随时观察品色情况，当阳性对照有明显显色或阴性对照开始普遍山现非特兄性显色，立即终止显色。8.2.14把组织切片置于缓冲液I15min终止反应8.2.15组织切片依次在双蒸水（1次.10s）、0.5%伸斯麦棕Y（1次.1min）、95%乙醇（3次.10s/次）、无水乙醇（3次，10s/次）、二甲苯（4次，10s/次）中浸洗：8.2.16空气自然下媒后，滴加2滴中性树胶.封片。8.2.17
显微镜下（400倍），寻找着色明显的蓝黑色杂交信号，并拍照，9结果判定
9.1检测结果成立条件
阳性对照样品组织病灶部位观察到明显的蓝黑色杂交信号，阴性对照样品组织中术观察到任何的蓝黑色杂交信号，实验有效，
检测结果判定
检测样品红织中观察到蓝黑色杂交信号（参见附录B），则原位杂交检测结果为阳性，判定为尼民单饱子出感染：待测样品组织中未观察到蓝黑色杂交信号.则原位杂交检测结果为阴性。牡蛎单孢子出病及其干要病原简介参见附录C
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DAFA固定液
95%乙醇
甲醛（37%）
冰醋酸
过滤海水
混匀，室温密封账存。
80%乙醇
95%乙醇
加水定容
混匀，室温必存。
70%乙醇
95%乙醇
加水定容至
混匀，室温贮存。
50%乙醇
95%乙醇
加水容至
泥匀，室温存。
500μg/mL多聚赖氨酸
多聚赖氨酸（相对分了质量25000）加水定容至
泥匀，4℃存
20×SSC
Na,C.H.O, - 2H,0
加水溶解定容至
调节 pH至
高斥蒸气火菌后，室温贮存。
2×SSC
20xSSC
附录A
（规范性）
试剂配方
1000mL
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B1xSSC
20×SSC
90.5×SSC
20xSSC
Na, HPO+ : 12H.O
加水定容至
10 mg/mL蛋白酶K
蛋白酶K
加水定容至
1950mL
1 000 ml
分装于尤菌离心管中（0.25mL/管），一20℃下保存100μg/ml蛋白酶K
10 mg/ml蛋白酶K
用前临时配制，混勾，4℃存放。0.4%甲醛
中醛（37%）
倒掉前可重复使用4次，用前预冷。杂交缓冲液
20×SSC
100%甲酰胺
20×丹哈特液（Denhardi's）
10tng/ml鲢精DVA
25%硫酸葡聚糖
混匀,1℃存。
10×缓冲液I
加水溶解率
用浓HCI调节pH卒
24.75 ml.
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加水定容率
高压蒸气灭菌·4～贮存。
缓冲液
10×缓冲液1
混匀.0.454m滤膜过滤除菌，4℃贮存A.17
缓冲液Ⅱ
Triton X-100
山羊血清
缓冲液
1000ml
900 mL
100 mL
在60℃80℃水浴中溶解，不断动，直至颗粒溶解。4℃可存2周。A.18
10×缓冲液Ⅲ
加水溶解至
用浓IICl调节pl至
MgCl,-6H,0
加水定穿率
1000ml
混匀,0.15μm滤膜过滤除菌，1℃贮存,山现沉淀后丢齐。缓冲液亚
10X缓冲液Ⅲ
混勾，0.45m滤膜过滤除菌，4℃贮存，出现沉淀后丢弃。A.20
10×缓冲液V
EDTA-Na·2HO
加水溶解.并定容至
用HCI调pH至8.0.高压火菌，4C贮存A.21缓冲液IV
10/缓冲液IV
混勾,0.45um滤膜过滤除齿。4℃定存。A.2210%聚乙烯醇
聚乙烯醇（相对分子质量3000070000）加水济解至
揽拌溶解后.分装10ml/替，一20“C贮存。12.1g
1000mL
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显色液
缓冲液Ⅲ
盐酸左旋咪唑
10%聚乙烯醇
4℃保存
用前在年1ml.上述混合液中如：NBT
0.5%碑斯麦棕Y
斯麦棕Y
把染料溶于水中,过滤。空温贮存。A.25
NBT贮存液
王基王酰胺
避光，一20℃贮存。
BCIP贮存液
甲基甲酰唤
避光，一20贮存。
20×丹哈特液
牛血清白蛋白
聚蔗糖400
聚乙烯吡咯烷酮360
加水溶解并定容率
0.45μm的滤器过滤，5mL/支分装，一20℃存。25%硫酸葡聚糖
硫酸葡聚糖
加水定容至
低热搅拌片刻使之溶解：20℃保存。10mg/ml鲑精DNA
精TNA
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将链精DNA钢盐加入水中，用坡瑙棒搅拌直至完全溶解。用6弓针头的注射器反复抽打数次，在100℃.水浴中加热10min，立即放于冰浴中率冷，分装于无菌小试替中，一20保存。使用前在100℃水浴中加热5min.然后淬冷-rrKaeerKAca-
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原位杂交法示例见图B.1，
2012ElsevierInc.
说明：
附录B
（资料性）
尼氏单孢子虫原位杂交检测结果示例蓝黑颗粒为染交信号（等头所示）。20μm
图B.1长牡蛎（Crassostrea gigas）感染尼氏单孢子虫原位杂交检测结果10
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