GB/T 40249-2021
基本信息
标准号： GB/T 40249-2021
中文名称：斑节对虾杆状病毒病诊断规程PCR检测法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 40249-2021.Code of diagnosis for infection with Penaeus monodon -type baculovirus-PCR method.
1范围
GB/T 40249规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求,针对斑节对虾杆状病毒( Penaeus monodon-type baculovirus, MBV),给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40249适用于对虾各生活期样品中MBV带毒情况的定性检测,以进行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 28630.4-2012白斑综合征( WSD)诊断规程第 4部分:组织病理学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy ribonucleoside triphosphate)
EB:溴化乙啶( ethidium bromide)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
HCl:盐酸( hydrogen chloride)
1范围
GB/T 40249规定了斑节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求,针对斑节对虾杆状病毒( Penaeus monodon-type baculovirus, MBV),给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40249适用于对虾各生活期样品中MBV带毒情况的定性检测,以进行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 28630.4-2012白斑综合征( WSD)诊断规程第 4部分:组织病理学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。.
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
DNA:脱氧核糖核酸( deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy ribonucleoside triphosphate)
EB:溴化乙啶( ethidium bromide)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid)
HCl:盐酸( hydrogen chloride)
标准图片预览
标准内容
ICS65.020.30
CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T40249—2021
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
PCR 检测法
Code of diagnosis for infection with Penaeus monodon-type baculovirus-PCR method
2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
GB/T 40249—2021
本文件按照GB/T1.1
2020元标准化工作导则
“第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的贡任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件山全国水产标准化技术委员会（SAC/C156)归口。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人：杨泳、万晓媛、黄、李清、史成银、张锋、宋晓冷、余卫忠、张庆利、李晨、刘莉许华。
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1范围
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
PCR检测法
GB/T-40249—2021
本文件规定「郊节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求.针对郊节对虾杆状病毒（Penaeusmonodom-typebaculovirus，MBV)，给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定，
本义件适用丁对虾各生活期样品中MBV带声情况的定性检测，以迹行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中.注日期的引用文件.仅该口期对应的版本适用于本义件不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/28630.4—2012H斑综合征（WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法3术语和定义
本文件设有需要界定的术语和定义，4缩略语
下列略语适用于本文件：
bp:碱基对（basepair)
DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonucleieacid）dNTPs：J脱氧核糖核背一磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）FB：溴化乙皖（ethidiun hromide:）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylencdiaminctetraaceticacid)HCl:盐酸(hydrogen chloride)
MBV：斑节对虾杆状病毒（Penaeismanodon-typebaculovirus）NaOH：氢氙化钠（sodiumhvdroxide)PCR：聚合酶链式反应（polytnerase chain reartion）SDS：十二烷基硫酸（sodlium dodccyl sulfate）Tag：水牛栖热菌（thermus aqualicus）TE:Ttis盐酸和EDTA缓冲液(EDTAris·HCI)Tris：二羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethanc）1
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GB/T40249—2021
5试剂或材料
除非另有说明.在分析中仪使用确认为分析纯的试剂和蒸褶水或去离子水或相当纯度的水。无水乙醇
TE缓冲液：按附录A中A.3配制
抽提缓冲液：按A.6配制，
蛋K：按A.7配制。
10 mol/L乙酸饺：按A.8配制，
Tirs饱和酚(plI7.8)。
酚/氯/异戊醇（25：24：1）。bzxZ.net
氯仿/异戊醇（24*1)，
1X心泳缓冲液：按A.10配制：
5.1170%乙醇：按A.11配制。
dVTPs(各2.5mmol/L)：生化试剂-含 dATP.dlTP、dGTP,clCTP各2.5mmol/L的混合物5.12
一20 ℃ 保存,用于PCR。
5.1310×PCR缓冲液：生化试剂.无Mg离子，—20℃保存，5.14
MgCl.（25mmol/L）+牛化试剂，一20C保存。Tag D>A聚合酶(5U/tl):生化试剂，—20 ℃保存引物 261F(10 m01/L):5'-AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3°,20 ℃保存引物 261R(10 umol/L):5' CGTCG TG A G AACATC TC 3',-20 ℃保存。内参I物 CF(10 μm01/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3',-20 C保存。内参引物 CR(10 μm01/L):5-T-C-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-C-T-CCC-3'，20 C保存.PCR检测阳性对照：为已知受MRV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织样品，一80C保存。PCR检测阴性对照：为口知未受MBV感染且PCR结果显示阴性的对虾组织样品：一80C保存，PCR检测空H对照：灭菌双蒸水。琼脂糖；生化试剂。
DNA分子量标准：生化试剂。
6×载样缓冲液：牛化试剂。
10mg/ml.EB贴存液：按A.12配制，或其他等效产品：6仪器设备
6.1 PCR 仪.
电泳仪。
6.3水平电泳槽。
6.4紫外观察仪或凝胶成像仪。
高速离心机。
水浴锅或金属浴。
普通冰箱。
80℃超低温冰箱。
电炉或微波炉等其他加热设备
微量移液器：量程0.5ml.~10ml2ml~20ml、20ml.200l.,100μl.~1000μl-rrKaeerKAca-
7样品
7.1采样对象
斑节对虾（Penaeusmonodon）等易感对虾。参见附录B.7.2采样数量、方法和保存运输
采样数量，方法和保存运输应待合GB/28630.4一2012中附录B的要求7.3样品的采集
GB/T-40249—2021
7.3.1对虾仔虾取完整个体；幼虾、成虾和亲虾取川战腺和肠道；亲虾的非致死性取样可采集粪便，7.3.2分子生物学检测时，虾或未达到0.5样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测，所取样品分别置丁1.5mL离心管中，立即逊行DNA提取操作或暂时保存丁一20℃。8试验步骤
8.1I)NA的提取
8.1.1取30mg50mg组织样品.加人仙提缓冲液500ul.充分研磨，37℃温浴1h。提取过程同时设置阳性对照和阴性对照，
8.1.2咖人2.5μl.20mg/tml.蛋凹酶K，至终浓度100ug/ml,混勾后置于50℃水浴3h.不时旋动，8.1.3将溶液冷却至室温，加人等休积平衡酚·颠倒混合10min.于10000r/min离心3min分离两相。
8.1.4水相移至新1.5ml.离心管中，加人等体积附/氯仿/异戊醇（25：24：1)，颠個混合10mim，于l0 000 r/min离心1min分离两
8.1.5水移至新1.5ml.离心管中加入等体积氯伤/异戊醇（24：1)，颠倒混合10min.于10000/min离心1min分离两相。
8.1.6水相移至一新1.5mL离心管中，加入100μL10mol/L乙酸铵，混匀后，内加入两倍休积预冷无水乙婷（—20℃.）混勾，—20℃放置2h。10000r/mim离心10min，弃上洁，8.17用70%乙醇洗涤沉淀2，每欣10000r/min离心5min.小心充掉上清，将沉淀丁室温晾8.1.8加人100L火菌双蒸水溶解DXA8.1.9若TNA样品需要保存.可溶解于100叫l.E缓冲液巾并保存于一20℃，8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DVA提收试剂盒，8.2PCR扩增
8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求.加入除TaqDVA案合酶以外的各项试剂.配制成大体积的预混物·分装保存于一20“C。临用前，加人相应体积的TaI)NA聚合悔，混匀，接1个反应体系/支分装到0.2mLPCR管中，分别加人各样品的模板DVA（质量浓度：50ng/uL10ong/nL)IL，同时设用性对照、阴性对照和空自对照：8.2.2将上述加有TDNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94（预变性5min；94C变性30s60℃退火30s、72℃延仲30s.35个循环；72℃延仲7min；4℃保温，3
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GB/T40249-—2021
10×PCR缓冲液（无Mg-）
MgCl (25 mmol/1.)
dNTPs(各 2.5 mmul/L)
引物261F(10mol/L)
引物261R(10mol/L)
灭菌双蒸水
Tug INA聚合酶（U/L)
注：25体系的慎板量为1l
MBVPCR反应预混物所需试剂·组成25 L.体系
25mL体系
0.73 ped.
T6.4 μt.
试剂悠浓度
1×PCR缓冲液
试剂终浓度
1.5 ntrml/L.
2eo μmol/L
0.3mmol/L
0.3 mmol/1.
0.02 U/uL
8.2.3每份样品均设立「足日生物内参对照·扩增「足日生物组织I)NA伪PCR反应体系接照表2的要求。分别加人各样品的模板DNA（质量浓度：50ng/l~100ng/L)1uL表2扩增十足目生物组织DNAPCR反应体系试剂·组成试剂
10×PCR缓冲凝（无Mg）
MgCl.(25 tmmol/1.)
dNTPs(各 2.5 mmol/L)
内参引物（F(10pmol/1.）
内参引物CR(umal/1)
灭菌双蒸水
Taq DNA聚台酶(5 U/μL)
注：25μl.体系的模板量为1
25mL体系
试剂终浓度
IXPCR缓冲液
1.5mnol/L
200μmol/L
I μrmol/l.
Iuniol/T.
8.2.4将上述加有DVA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94℃预变性3min;94℃变性1min、5℃退火1rrin.72C延伸1min，35个循环：72延伸5tin:4℃保温。8.3琼脂糖凝胶电泳及测序
8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶，血人10mg/ml.FB至终浓度0,5g/ml,探匀。制备琼脂糖凝胶。8.3.2将5uLPCR反应产物与1μL6×载样缓冲液混勾后加人到加样孔中：同时设立DNA分于量标准对照。
8.3.3在1V/cm~5V/cm的电压下电泳.使DNA由负极向正极移动。当载样缓液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2~~2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照：
8.3.4如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。4
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9结果判定
检测结果成立条件
GB/T-40249—2021
十是月生物组织样品在848bp处有特定条带，性对照在261bp处有特定条带，阴性对照在261bp处尤条带且空户对照不出现任何条带，试验有效，9.2
检测结果判定
检测样品在261bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录C)进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性；检测样品在261bp处无条带可判为PCR结果阴性：-riKaeerkca-
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A.1 1 mol/L Tris · HCI(pH8.0)Tris
附录A
（规范性）
试剂配方
溶解后加人约42mL浓盐酸调pH接近8.0,冷却至室温.再用2.5mol/LHCl调整pH至8.0。加水定容至
分装后-高压蒸气灭菌，室温贮存。20.5mol/LEDTA(pH8.0)
Z二胺四乙酸二钠(EDANa·2H.O)水
1000 ml
磁力搅拌.用2.5mol/LNa01l调节溶液pll值至8.0.完全溶解，定容至100mL。高压蒸气灭菌，空温贮存，
3TE缓冲液（pH8.0）
1 mol/L Tris ·HC(pH8.0)
0.5 mol/L EI)TA(pH8.0)
加水定容至
高压蒸气灭菌·4些存。
1mg/mI.胰RNA酶
胰RNA酶
TE缓冲液(pH8.0)
1000ml
济解后，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装100ul/管，一20C存10%S1)S
加热至68溶加人儿滴浓盐较调节溶液的DH值至7.2·加水定容至100m室温贮存。若溶液有结品形成-用前加热融解即可，SIJS微细晶粒易于扩散·称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和人平上的SDS,
5抽提缓冲液
I mol/L Iris ·HICl(pH18.0)
0.5 tnol/I. FDTA(pH8.0)
1 mg/mL胰RNA酶
10% SDS
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加水定容至
混匀，室溢哒存。
A.720mg/mL蛋白酶K
溶解后分装丁1.5mL离心管中（0.25mL/管），—20%下保存，810mol/L乙酸铵
乙酸铵
加水定容至100mL，经0.15um滤膜过滤除菌.1℃贮存A.9
50×电泳缓冲液
冰乙酸
0.3mol/L.EDTA(pH8.0)
加水定容至
温购存。
1×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定至
案温购存。
70%乙醇
无水乙醇
加水30mL.混匀.定容至
分装后，室温此存。
10 mg/mL.EB购存液
57.1 rml.
1000mL
1 000 mL
磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，室温保存于棕色瓶或用铝钻包裹的瓶中-rrKaeerKAca-
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附录B
（资料性）
斑节对虾杆状病毒病简介
斑节对虾杆状病毒病（InfcctionwithPenaezynonodon-lypebaculovirus）由斑节对虾杆状病毒（MBV)感架引起。国际病毒分类委员会（ICTV）将该病声名称暂定为斑节对虾单核多角体病（PemoNPV),但在多数情况下该病原被称为MBV,为核多角体病毒属成员。核酸类型为双链TDVA该病毒可感染对虾属（Penaeus）、明对虾属（Fenneropenarus）、囊刘虾属（Metapenaeus）和沟对虾属（Melicertus）等多种对虾。除卵和尤节幼体，其余各牛长阶段均易感染.H通带存在持续性感架，严重感染MBV的野生雌性斑节对虾产卵时，会排出含MBV的粪便，从而污染虾卵，将病毒传给下一-代MBV在东亚、东南亚、印度次大陆、中东、澳大利亚、印度尼西亚、新喀里多尼亚、东非和马达加斯加均有分布，但在斑节对虾自然地理分布范围以外的野生对虾群体中未发现，MBV经肠道感染肝胰腺小管和中肠前段黏膜上皮细胞，受感染病虾在肝胰腺和中肠腺上皮细胞内.出现大量的核型多角体型包涵体或在粪使中有游离的多角体型包涵体。严重感染MBV的蚤状幼体、糠虾幼体和早期仔虾的中肠发白(这是由于在粪便中出现包渐体和细胞碎片)：稚虾、成虾及轻度感染的幼虾不出现病症，
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附录C
(资料性）
斑节对虾杆状病毒 PCR产物序列GB/T-40249—2021
AAICCTAGGC GAICTTACCA AATACAT-TC ATACCATAAC ACGTACCATG AACAACTTAT261F
CAAAAAAGA
GGATTACTA
TCTATCCAGATGCTTTATCATGACATCATATAAATAC
GCTCATGAG TCAACACTIC CGACTA IAA AGGAICAATC AATAIGAACT CIATTGAATC
TATGCTATTACATGCGCTGA TTGAAATGAT GGTTAGTATTAAACAATGAAGCTGGAAA
GGAGAIGTTC AICAACGAAC G
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CCS B 41
中华人民共和国国家标准
GB/T40249—2021
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
PCR 检测法
Code of diagnosis for infection with Penaeus monodon-type baculovirus-PCR method
2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
GB/T 40249—2021
本文件按照GB/T1.1
2020元标准化工作导则
“第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的贡任。本文件由中华人民共和国农业农村部提出本文件山全国水产标准化技术委员会（SAC/C156)归口。本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人：杨泳、万晓媛、黄、李清、史成银、张锋、宋晓冷、余卫忠、张庆利、李晨、刘莉许华。
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1范围
斑节对虾杆状病毒病诊断规程
PCR检测法
GB/T-40249—2021
本文件规定「郊节对虾杆状病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求.针对郊节对虾杆状病毒（Penaeusmonodom-typebaculovirus，MBV)，给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定，
本义件适用丁对虾各生活期样品中MBV带声情况的定性检测，以迹行斑节对虾杆状病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中.注日期的引用文件.仅该口期对应的版本适用于本义件不注口期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/28630.4—2012H斑综合征（WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法3术语和定义
本文件设有需要界定的术语和定义，4缩略语
下列略语适用于本文件：
bp:碱基对（basepair)
DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonucleieacid）dNTPs：J脱氧核糖核背一磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）FB：溴化乙皖（ethidiun hromide:）EDTA：乙二胺四乙酸(ethylencdiaminctetraaceticacid)HCl:盐酸(hydrogen chloride)
MBV：斑节对虾杆状病毒（Penaeismanodon-typebaculovirus）NaOH：氢氙化钠（sodiumhvdroxide)PCR：聚合酶链式反应（polytnerase chain reartion）SDS：十二烷基硫酸（sodlium dodccyl sulfate）Tag：水牛栖热菌（thermus aqualicus）TE:Ttis盐酸和EDTA缓冲液(EDTAris·HCI)Tris：二羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethanc）1
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GB/T40249—2021
5试剂或材料
除非另有说明.在分析中仪使用确认为分析纯的试剂和蒸褶水或去离子水或相当纯度的水。无水乙醇
TE缓冲液：按附录A中A.3配制
抽提缓冲液：按A.6配制，
蛋K：按A.7配制。
10 mol/L乙酸饺：按A.8配制，
Tirs饱和酚(plI7.8)。
酚/氯/异戊醇（25：24：1）。bzxZ.net
氯仿/异戊醇（24*1)，
1X心泳缓冲液：按A.10配制：
5.1170%乙醇：按A.11配制。
dVTPs(各2.5mmol/L)：生化试剂-含 dATP.dlTP、dGTP,clCTP各2.5mmol/L的混合物5.12
一20 ℃ 保存,用于PCR。
5.1310×PCR缓冲液：生化试剂.无Mg离子，—20℃保存，5.14
MgCl.（25mmol/L）+牛化试剂，一20C保存。Tag D>A聚合酶(5U/tl):生化试剂，—20 ℃保存引物 261F(10 m01/L):5'-AAT-CCT-AGG-CGA-TCT-TAC-CA-3°,20 ℃保存引物 261R(10 umol/L):5' CGTCG TG A G AACATC TC 3',-20 ℃保存。内参I物 CF(10 μm01/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3',-20 C保存。内参引物 CR(10 μm01/L):5-T-C-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-C-T-CCC-3'，20 C保存.PCR检测阳性对照：为已知受MRV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织样品，一80C保存。PCR检测阴性对照：为口知未受MBV感染且PCR结果显示阴性的对虾组织样品：一80C保存，PCR检测空H对照：灭菌双蒸水。琼脂糖；生化试剂。
DNA分子量标准：生化试剂。
6×载样缓冲液：牛化试剂。
10mg/ml.EB贴存液：按A.12配制，或其他等效产品：6仪器设备
6.1 PCR 仪.
电泳仪。
6.3水平电泳槽。
6.4紫外观察仪或凝胶成像仪。
高速离心机。
水浴锅或金属浴。
普通冰箱。
80℃超低温冰箱。
电炉或微波炉等其他加热设备
微量移液器：量程0.5ml.~10ml2ml~20ml、20ml.200l.,100μl.~1000μl-rrKaeerKAca-
7样品
7.1采样对象
斑节对虾（Penaeusmonodon）等易感对虾。参见附录B.7.2采样数量、方法和保存运输
采样数量，方法和保存运输应待合GB/28630.4一2012中附录B的要求7.3样品的采集
GB/T-40249—2021
7.3.1对虾仔虾取完整个体；幼虾、成虾和亲虾取川战腺和肠道；亲虾的非致死性取样可采集粪便，7.3.2分子生物学检测时，虾或未达到0.5样品可以合并样本，个体稍大的虾可取个体进行检测，所取样品分别置丁1.5mL离心管中，立即逊行DNA提取操作或暂时保存丁一20℃。8试验步骤
8.1I)NA的提取
8.1.1取30mg50mg组织样品.加人仙提缓冲液500ul.充分研磨，37℃温浴1h。提取过程同时设置阳性对照和阴性对照，
8.1.2咖人2.5μl.20mg/tml.蛋凹酶K，至终浓度100ug/ml,混勾后置于50℃水浴3h.不时旋动，8.1.3将溶液冷却至室温，加人等休积平衡酚·颠倒混合10min.于10000r/min离心3min分离两相。
8.1.4水相移至新1.5ml.离心管中，加人等体积附/氯仿/异戊醇（25：24：1)，颠個混合10mim，于l0 000 r/min离心1min分离两
8.1.5水移至新1.5ml.离心管中加入等体积氯伤/异戊醇（24：1)，颠倒混合10min.于10000/min离心1min分离两相。
8.1.6水相移至一新1.5mL离心管中，加入100μL10mol/L乙酸铵，混匀后，内加入两倍休积预冷无水乙婷（—20℃.）混勾，—20℃放置2h。10000r/mim离心10min，弃上洁，8.17用70%乙醇洗涤沉淀2，每欣10000r/min离心5min.小心充掉上清，将沉淀丁室温晾8.1.8加人100L火菌双蒸水溶解DXA8.1.9若TNA样品需要保存.可溶解于100叫l.E缓冲液巾并保存于一20℃，8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DVA提收试剂盒，8.2PCR扩增
8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求.加入除TaqDVA案合酶以外的各项试剂.配制成大体积的预混物·分装保存于一20“C。临用前，加人相应体积的TaI)NA聚合悔，混匀，接1个反应体系/支分装到0.2mLPCR管中，分别加人各样品的模板DVA（质量浓度：50ng/uL10ong/nL)IL，同时设用性对照、阴性对照和空自对照：8.2.2将上述加有TDNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94（预变性5min；94C变性30s60℃退火30s、72℃延仲30s.35个循环；72℃延仲7min；4℃保温，3
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GB/T40249-—2021
10×PCR缓冲液（无Mg-）
MgCl (25 mmol/1.)
dNTPs(各 2.5 mmul/L)
引物261F(10mol/L)
引物261R(10mol/L)
灭菌双蒸水
Tug INA聚合酶（U/L)
注：25体系的慎板量为1l
MBVPCR反应预混物所需试剂·组成25 L.体系
25mL体系
0.73 ped.
T6.4 μt.
试剂悠浓度
1×PCR缓冲液
试剂终浓度
1.5 ntrml/L.
2eo μmol/L
0.3mmol/L
0.3 mmol/1.
0.02 U/uL
8.2.3每份样品均设立「足日生物内参对照·扩增「足日生物组织I)NA伪PCR反应体系接照表2的要求。分别加人各样品的模板DNA（质量浓度：50ng/l~100ng/L)1uL表2扩增十足目生物组织DNAPCR反应体系试剂·组成试剂
10×PCR缓冲凝（无Mg）
MgCl.(25 tmmol/1.)
dNTPs(各 2.5 mmol/L)
内参引物（F(10pmol/1.）
内参引物CR(umal/1)
灭菌双蒸水
Taq DNA聚台酶(5 U/μL)
注：25μl.体系的模板量为1
25mL体系
试剂终浓度
IXPCR缓冲液
1.5mnol/L
200μmol/L
I μrmol/l.
Iuniol/T.
8.2.4将上述加有DVA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94℃预变性3min;94℃变性1min、5℃退火1rrin.72C延伸1min，35个循环：72延伸5tin:4℃保温。8.3琼脂糖凝胶电泳及测序
8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶，血人10mg/ml.FB至终浓度0,5g/ml,探匀。制备琼脂糖凝胶。8.3.2将5uLPCR反应产物与1μL6×载样缓冲液混勾后加人到加样孔中：同时设立DNA分于量标准对照。
8.3.3在1V/cm~5V/cm的电压下电泳.使DNA由负极向正极移动。当载样缓液中的溴酚蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖凝胶的1/2~~2/3处时停止电泳，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观察或拍照：
8.3.4如果观察到预期大小条带，对PCR扩增产物进行测序。4
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9结果判定
检测结果成立条件
GB/T-40249—2021
十是月生物组织样品在848bp处有特定条带，性对照在261bp处有特定条带，阴性对照在261bp处尤条带且空户对照不出现任何条带，试验有效，9.2
检测结果判定
检测样品在261bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录C)进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性；检测样品在261bp处无条带可判为PCR结果阴性：-riKaeerkca-
GB/T40249—2021
A.1 1 mol/L Tris · HCI(pH8.0)Tris
附录A
（规范性）
试剂配方
溶解后加人约42mL浓盐酸调pH接近8.0,冷却至室温.再用2.5mol/LHCl调整pH至8.0。加水定容至
分装后-高压蒸气灭菌，室温贮存。20.5mol/LEDTA(pH8.0)
Z二胺四乙酸二钠(EDANa·2H.O)水
1000 ml
磁力搅拌.用2.5mol/LNa01l调节溶液pll值至8.0.完全溶解，定容至100mL。高压蒸气灭菌，空温贮存，
3TE缓冲液（pH8.0）
1 mol/L Tris ·HC(pH8.0)
0.5 mol/L EI)TA(pH8.0)
加水定容至
高压蒸气灭菌·4些存。
1mg/mI.胰RNA酶
胰RNA酶
TE缓冲液(pH8.0)
1000ml
济解后，于100加热15min，缓慢冷却至室温，分装100ul/管，一20C存10%S1)S
加热至68溶加人儿滴浓盐较调节溶液的DH值至7.2·加水定容至100m室温贮存。若溶液有结品形成-用前加热融解即可，SIJS微细晶粒易于扩散·称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和人平上的SDS,
5抽提缓冲液
I mol/L Iris ·HICl(pH18.0)
0.5 tnol/I. FDTA(pH8.0)
1 mg/mL胰RNA酶
10% SDS
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加水定容至
混匀，室溢哒存。
A.720mg/mL蛋白酶K
溶解后分装丁1.5mL离心管中（0.25mL/管），—20%下保存，810mol/L乙酸铵
乙酸铵
加水定容至100mL，经0.15um滤膜过滤除菌.1℃贮存A.9
50×电泳缓冲液
冰乙酸
0.3mol/L.EDTA(pH8.0)
加水定容至
温购存。
1×电泳缓冲液
50×电泳缓冲液
加水定至
案温购存。
70%乙醇
无水乙醇
加水30mL.混匀.定容至
分装后，室温此存。
10 mg/mL.EB购存液
57.1 rml.
1000mL
1 000 mL
磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，室温保存于棕色瓶或用铝钻包裹的瓶中-rrKaeerKAca-
GB/T-40249—2021
GB/T40249—2021
附录B
（资料性）
斑节对虾杆状病毒病简介
斑节对虾杆状病毒病（InfcctionwithPenaezynonodon-lypebaculovirus）由斑节对虾杆状病毒（MBV)感架引起。国际病毒分类委员会（ICTV）将该病声名称暂定为斑节对虾单核多角体病（PemoNPV),但在多数情况下该病原被称为MBV,为核多角体病毒属成员。核酸类型为双链TDVA该病毒可感染对虾属（Penaeus）、明对虾属（Fenneropenarus）、囊刘虾属（Metapenaeus）和沟对虾属（Melicertus）等多种对虾。除卵和尤节幼体，其余各牛长阶段均易感染.H通带存在持续性感架，严重感染MBV的野生雌性斑节对虾产卵时，会排出含MBV的粪便，从而污染虾卵，将病毒传给下一-代MBV在东亚、东南亚、印度次大陆、中东、澳大利亚、印度尼西亚、新喀里多尼亚、东非和马达加斯加均有分布，但在斑节对虾自然地理分布范围以外的野生对虾群体中未发现，MBV经肠道感染肝胰腺小管和中肠前段黏膜上皮细胞，受感染病虾在肝胰腺和中肠腺上皮细胞内.出现大量的核型多角体型包涵体或在粪使中有游离的多角体型包涵体。严重感染MBV的蚤状幼体、糠虾幼体和早期仔虾的中肠发白(这是由于在粪便中出现包渐体和细胞碎片)：稚虾、成虾及轻度感染的幼虾不出现病症，
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附录C
(资料性）
斑节对虾杆状病毒 PCR产物序列GB/T-40249—2021
AAICCTAGGC GAICTTACCA AATACAT-TC ATACCATAAC ACGTACCATG AACAACTTAT261F
CAAAAAAGA
GGATTACTA
TCTATCCAGATGCTTTATCATGACATCATATAAATAC
GCTCATGAG TCAACACTIC CGACTA IAA AGGAICAATC AATAIGAACT CIATTGAATC
TATGCTATTACATGCGCTGA TTGAAATGAT GGTTAGTATTAAACAATGAAGCTGGAAA
GGAGAIGTTC AICAACGAAC G
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