GB/T 40186-2021.Determination of genetic material damage strength for microbial mutation breeding-Umu method.
1范围
GB/T 40186规定了用生物遗传毒性(umu)测试方法测定微生物诱变育种致遗传物质损伤强度的方法。
GB/T 40186适用于利用umu测试法测定诱变育种致微生物遗传物质损伤强度。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
诱变 mutagenesis
通过人为的措施诱导遗传物质产生突变。
3.2
遗传物质损伤 genetic material damage
化学或物理诱变源对遗传物质分子结构的改变。
3.3
应急反应 SOS response
当细胞发生脱氧核糖核酸(DNA)损伤时,产生的一种应激响应机制。
注:在原核生物中主要受应急反应(SOSresponse)系统调控,调控超过40个基因的表达来应对DNA损伤。
3.4
遗传物质损伤强度 strength of genetic material damage
化学或物理诱变源对遗传物质分子结构改变程度的大小。
注:由于当细胞受到DNA损伤时会发生应急修复(SOS修复),使其以突变为代价继续存活下去,常用soS修复强
弱代表遗传物质损伤强度。
3.5
umu测试法umu test
一种将编码DNA聚合酶V中重要组分的umuC基因与编码β-半乳糖苷酶的lacZ基因融合,导入到鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)中,通过检测β-半乳糖苷酶活性来测定sos的诱导强度的方法。
注:可用于测定遗传物质损伤强度。
本标准规定了用生物遗传毒性（umu)测试方法测定微生物诱变育种致遗传物质损伤强度的方法。 本标准适用于利用umu测试法测定诱变育种致微生物遗传物质损伤强度。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T40186—2021
微生物诱变育种致遗传物质损伤强度测定
Umu 法
Determination of genetic material damage strength for microbial mutationbreedingUmu method
2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T40186—2021
本标准起草单位：清华大学、洛阳华清大木生物科技有限公司、华南理工大学、中国标准化研究院。本标准主要起草人：张独、邢新会、李梅、剪兴金、王立言、郭肖杰、张乐乐、李爽、马爱进-riKaeerkca-
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1范围
微生物诱变育种致遗传物质损伤强度测定
Umu法
GB/T 40186—2021
本标准舰定了用生物遗传毒性（umu)测试方法测定微生物诱变育种致遗传物质损伤强度的方法。本标准适用丁利用utnu测试法测定诱变育种致微生物遗传物质损伤强度。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的成用是必不可少的，凡是注明的引用文件，假注明的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修政单)适用丁本文件GB/T6682分析实验空用水规格和试验方法3术语和定义免费标准bzxz.net
下列术语和定义适用丁文件。
诱变mutagenesis
通过人为的措施诱导遗传物质产生突变，3.2
遗传物质损伤geneticmaterialdamage化学或物理诱变源对遗传物质分子结构的改变：3.3
应急反应Sosresponse
当细胞发生脱氧核糖核酸(DNA)损伤时，产生的一种应激响应机制：注：在原核牛物中主要受应息反应(SOS responae)系统调控，调控超过40个基因的表达来应对IDNA损价3.4
遗传物质损伤强度strengthofgeneticmaterialdamage化学或物理诱变源对遗传物质分了结构改变程度的人小，注：巾于细购受到IDNA损伤时会发生应急修复（SOS修复），使其以突变为代价继续存活下大，常川SOS修复强弱代表遗传物质损伤强度。
umu测试法
umu test
一种将编码DNA聚合酶V中重要组分的umuC基因与编码3半乳糖苗酶的lacz基因融合，导入到鼠伤寒沙门氏茵（Salnonellatvphimurium）中.通过检测3半乳糖酶活性来测定SOS的诱导强度的方法。
注：可用于测定遗传物质损伤强度1
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GB/T40186—2021
4原理
基丁utmIu测试方法，采用荧光素-2-3-D-半乳苷作为3-半乳糖苷酶的荧光底物，利用碘化内啶作为死细胞染料，通过采用流式细胞荧光分选技术（FACS)测定诱变后活细胞的3半乳糖苷酶活性，从而得到活细胞的遗传物质损伤强度。5试剂或材料
除非另有规定，使用分析纯试剂：水为GB/T6682规定的-级水。5.11mol/L盐酸溶液
量取83.3mL的12mol/L浓盐酸用水溶解定容至1L，得到浓度为1mol/L的盐酸溶液。5.21mol/L氢氧化钠溶液
称取40.0名氢氧化钠-用水溶解定容至1L5.3测试微生物培养基(TGA)
称取胰蛋白陈10.0g，氯化钠5.0g.4-羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)11.9g，加人980mL水溶解·pH调整为7.0士0.2.定容到1000mL.121℃.15min高压火菌：溶解2.0g葡菊耕个20mL去离子水中单独灭菌，灭菌后按等比例混合两个溶液，无菌条件下每升冷却的TGA培养基巾川入50.00mg氨下青霉素。该溶液可以在一20℃保存4周，5.4荧光素-2-β-D-吡喃半乳糖苷（Fluoresceindi-β-D-galactopyranoside，FDG)）溶液在10mL含体积分数为1%一甲基亚(DMSO)和1%乙醇的水中溶解13.13mgFLDG,FDG终浓度为2mmol/L，分装后保存在一20℃冰箱巾：使用前在37℃预热15min以上.5.5碘化内啶（Propidiumiodide.Pl）溶液在10mLPBS溶液中溶解6.68mgPI.配成浓度为1mmol/L的PI溶液：用移液枪吸取10uL浓度为1mmol/L的PI储备液，溶于10mLPBS溶液中，配成浓度1mol/L的PI溶液.作为PI工作液于4℃保存，使用前在冰上放置预冷6仪器设备
恒温水浴锅：温度川实现37℃1℃6.2pII计，精度0.1
电了天平，精度0.01mg。
高速离心机。
6.5流式细胞仪。
恒温震荡探床.温度可实现37℃士1℃，转速范周满足125r/min~250r/min。6.7
紫外可见光分光光度计，可检测波长包含600nm士20nm，配备1cm比色Ⅲ：-riKacerKAca-
7样品
7.1测试微生物
GB/T40186—2021
鼠伤寒沙门民菌SatnonellatyphimuriumVM20o9.包含衣达umuC-lucZ基因和氨芋青需素抗性基因的质粒（质粒序列参见附录A）。7.2测试微生物的保存
将150试徽测试微生物培养物置于冻存管中，再加人含有10%（体积分数）二中基亚砜或20%（体积分数）甘油的水溶液350uL，充分混勾后，保存丁一80℃冰箱中。8试验步骤
8.1测试微生物过夜培养物
测试微生物过夜培养物过程如下：a）在：100mL角摇瓶中装人20mLTGA培养基，用透气瓶塞封口，火菌储存：h）室温融化冻存的测试微生物.然后在冻存管中加人1ml.TGA培养基：c）
以40001/min转速离心冻存管巾的测试微生物10min.然后天弃上清液，用1mlTGA培养基重悬测试菌；
cl）用0.5mL测试微生物重悬液接种到含TGA培养基的角瓶中，在37℃工1℃的忙温探床中震荡培养过夜（不超过12h)。
8.2准备测试微生物诱变样品和对照样品用新鲜的TGA培养基将寸夜境养的测试微生物稀释10倍，继续在37C士1C的恒温摇床中震荡培养，并设定检测波长为600nm二20nm，以TGA培养基作为空户对照，用1cm比色Ⅲ检测培养后测试微生物样品成处于对数生长期。通过物理诱变或化学诱变等方法对测试微生物样品逊行诱变处理得到诱变组.通过不逊行诱变处理得到对照红。测试微生物诱变样品的量宜在200l.以I，将诱变处理后的实验红和对照组转移到1.5ml.离心管巾，在37一1C震荡境养箱巾200r/min培养2h8.3IFDG和PI染色
取诱变组和对照组测试样品50L置于1.5mL的离心管中.在37℃预热5mim后，加入37℃预热的FDG溶液50μL.迅速温和混勾后·置于37℃水浴巾2min使FDG渗透进人细胞：再间上述1.5mL离心管中迅速加入500L的PI溶液，将混合液放置于冰上反应1h.在进行流式细胞测定前应一直将其置于冰「。8.4流式细胞仪测定
采用流式细胞仪对染色后样品进行流式分析：设定激发波长为488nm.对于FDG水解产物荧光索的荧光强度测定接收波长为525nm（FIl-1通道）.Pl染色荧光测定接收波长为670nm（Fl-2通道）设定测定细胞总数为5000~100008.5阈值的设定
通过前向角散射光FSC和侧向角散射光SSC圈出目标菌体，以去除多细胞粘连刘结果的影响。3
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GB/T40186—2021
道过单独的PI染色，测定FL1道道和FL2通道的朴对荧光估.在FL1坐标轴上圈出PI染色细胞,圈中细胞的FI-1通道相对荧光值存在一个范围,FL-I相对荧光值不小于这个范固的细胞为PI染色阴性细胞
通过单独的FDG染色，测定FL-1通道和FL-2通道的相对荧光值,在FL-2坐标轴上圈出FDG染色细胞，圈中细胞的FL2通道相对荧光值存在一个范围.FL2相对炭光值在此范用内的纠胞为FDG染色阳性细胞
对于FDG和PI同时染色的样品，选取FIDG染色阳性和PI染色阴性的细胞为月标细胞群，用于后续的数据处理和结果分析。
试验数据处理
SOs诱导系数接式(1)计算：
式中：
SOS诱导系数：
A。——诱变源处理样品的平均FDG水解产物荧光素相对荧光值；Anr
对照样品的平均FDG水解产物荧光素树对荧光侦：以两个平行样品测定结果的算术平均值报告结果，结果保留至小数点后位。
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附录A
（资料性附录）
质粒序列信息
GB/T 40186—2021
凤伤寒沙门民菌SalnonellaiyphimuriumVM2009，包含表达umuC-lucZ基因和氨青得素抗性基因的质精序列信息如下：
ccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcagaccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggalgcccgcgigcaggccaigcigtccaggcaggtagatgacgaccalcagggacagcticaaggatcgelcgcggctcltaccagcclaacttcgatcacggaccgcigalcglcacggcgalltalgccgcclcggcgagcucalggaacgggllggcalggaliglaggcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctccagcagcgcacgcggcgcatctcgggcagcgttgggtcctggccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtltccgtgliicgtaaagiclggaaacgcggaaglcagcgcccigcaccaltalgliccggalcigcalcgcaggalgclgcggclacccigiggaaoacclacalclglaltaacgaagcgclggcaligacccigagigalllltclclggtcccgccgcalcctaccgccagtigltlacccicacaacgllccaglaaccgggcatgticatcatcugtaacccgttcgigagcalcctcicicgtllcalcggtalcattacccccalguacaguaattccccctlacacggaggcatcaagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctctcggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgRRtgttggcgggTgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccataigcggigigaaalaccgcacagaigcgtaaggagauaataccgcaicuggcgcicticcgcttcctcgctcacigacicgcigcgcicggicgltcggclgcggcgagcggtalcagclcaclcaaaggcgglaalacggllatccucagaalcaggggalaacgcaggaaagaacalglggcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacauaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccaclgglaacaggallagcagagcgugglalgtaggcggtgctacagagllcligaagtggiggcclaaclacggclacuclagaaggacugtalliggatctgcgciclgctgaagccagltacctlcgguaaaagagllggtagelctlgalccggcaaacaaaccaccgclgglagcgglggiitlliglitgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacguaaactcacgttaagggattttggtcatgagattatcaaauaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctauagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgtigigcratigcigcaggcalcgigg1gtcacgclcgicgtliggtaiggcllcallcageiccggtlcccaacgatcaaggcgaglacaigalcccccalgltgigctaaaaagcggltagcicclicgglcctccgatcgtiglcgaaglaagliggccgcaglgllalcaclcatggllaiggcagcoctgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagtfgctcttgcccggcgtcaacacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactetcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatattattgaagcatttatcagggttaliglctcalgagcggalacatatiigaatgtaltlagaaaaalaaacaaataggggticcgcgcacaltlccccgaaaagigccaccigacgicKaeerKca-
GB/T40186—2021
aagaaaccattattatcatgacattaacctataaaaataggcgtatcacgaggccctttcgtcttcaagaattcccggggatcccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgctttgcctggtttccggcaccagaagcggtgccggaaagctggctggagtgcgatcttcctgaggccgalacigicgtcgiccccicaaaciggcagcglcgccagaaggccacgigagcacagataagagaacgaaaaalcagcagcclalgcagcgacaaatattgatagcctgaatcagtattgatctgctggcaagaacagactactgtatataaaaacagtataacttcaggcagattattatgcacggttacgatgcgcccatctacaccaacgtaacctatcccattacggtcaatccgccgtttgttcccacggagaatccgacgggttgttactcgctcacatttaatgttgatgaaagctggctacaggaaggccagacgcgaattatttttgatggcgttaactcggcgtttcatctgtggtgcaacgggcgctgggtcggttacggccaggacagtcgtttgccgtctgaatttgacctgagcgcattfttacgcgccggagaaaaccgcctcgcggtgatggtgctgcgttggagtgacggcagtlalclggaagalcuggulaigiggcggalgagcgeculitccggucgtclcglgclgcalaaccgaclaccaalcgcgalllccalgllgccactcgctttaatgatgatttcagccgcgctgtactggaggctgaagttcagatgtgcggcgagttgcgtgactacctacgggtaacagtttctttatggcagggtgaaacgcaggtcgccagcggcaccgcgcctttcggcggtgaaattatcgatgagcgtggtggttatgccgatcgcgtcacactacgtctgaacgtcgaaaacccgaaactgtggagcgccgaaatcccgaatctctatcgtgcggtggttgaactgcacaccgccgacggcacgctgattgaagcagaagcctgcgatgtcggtttccgcgaggtgcggattgaaaatggtctgctgctgctgaacggcaagccgttgctgattcgaggcgttaaccgtcacgagoalcalcclctgcuigglcagglcatggalgagcagcgalggigcaggalatcclgcigatgaagcagaacaictllaacgccglgcgcigitcgcalatccgaaccatccgctgtggtacacgctgtgcgaccgctacggcctgtatgtggtggatgaagccaatattgaaacccacggcatggtgccaatgaatcgtctgaccgatgatccgcgctggctaccggcgatgagcgaacgcgtaacgcgaatggtgcagcgcgatcgtaatcacccgagtgtgatcatctggtcgctggggaatgaatcaggccacggcgctaatcacgacgcgctgtatcgctggatcaaatctgtcgatccttcccgcccggtgcagtatgaaggcggcggagccgacaccacggccaccgatattatttgcccgatgtacgcgcgcgtggatgaagaccagcccttcccggctgtgccgaaatggtccatcaaaaaatggcllicgclacclggagagacgcgcccgeigatccllgcgaalacgcccacgcgalgggtaacaglcliggcgglltcgclaaalaciggcaggcgtttcgtcagtatccccgtttacagggcggcttcgtctgggactgggtggatcagtcgctgattaaatatgatgaaaacggcaacccgtggtcggcttacggcggtgattttggcgatacgccgaacgatcgccagttetgtatgaacggtctggtetttgccgaccgcacgccgcatccagcgctgacggaagcaaaacaccagcagcagtttttccagttccgtttatccgggcaaaccatcgaagtgaccagcgaatacctgttccgtcatagcgataacgagctcctgcactggatggtggcgctggatggtaagccgctggcaagcggtgaagtgcctctggatgtcgctccacaaggtaaacagttgattgaactgcctgaactaccgcagccggagugcgccgggcaactciggcicacagtacgcgtagtgcaaccgaacgcguccgcalggtcagaagccgggcacatcagcgccggcagcagtggcgtctggcgguaaacctcagtgtgacgctccccgccgcgtcccacgccatcccgcatctgaccaccagcgaaatggatttttgcatcgagctgggtaataagcgttggcaatttaaccgccagtcaggctttctttcacagatgtggattggcgataaaaaacaactgctgacgccgctgcgcgatcagttcacccgtgcaccgctggataacgacattggcgtaagtgaagcgacccgcattgaccctaacgcctgggtcgaacgctggaaggcggcgggccattaccaggccgaagcagcgliglgcagigcacggcagalacacligciguigcggigcigallacgaccgclcacgcgiggcagcalcaggggaaaaccllalltatcagccggaauaacctaccggallgutggtagiggicaaatggcgaltuccgtigalgtigaagiggcgugcgatucaccgcatccggcgcggattggcctgaactgccagctggcgcaggtagcagagcgggtaaactggctcggattagggccgcaagaaaactatcccgaccgccttactgccgcctgttttgaccgctgggatctgccattgtcagacatgtataccccgtacgtcttcccgagcgaaaacggtctgcgctgcgggacgcgcgaattgaattatggcccacaccagtggcgcggcgacttccagttcaacatcagccgctacagtcaacagcaactgatggaaaccagccatcgccatctgctgcacgcggaagaaggcacalggcigaalulcgacgglllccataiggggaltggiggcgacgaclcciggagcccgtcagtalcggcggaatlccagcigagcgccggtcgctaccallaccagtiggiciggigtcaaaaalaataataaccgggcaggccalglcigcccgtalltcgcgtaaggautccallatgtaclattaaaaaacacaaacttttggatgttcggtttattctttttcttttacttttttatcatgggagcctacttcccgtttttcccgatttggctacatgacatcaaccatatcagcaaaagtgatacgggtattatttttgccgctatttctctgttctcgctattattccaaccgctgtttggtctgctttetgacaaactcgggctgcgcaaatacctgctgtggattattaccggcatgttagtgatgtttgcgccgttctttatttttatcttcgggccactgttacaatacaacattttagtaggatcgatlgiiggigglalllalclaggctlltgiillaacgccggigcgccagcagtagaggcaltlaligugaaaglcagccgicgcagtaatlicgaalitgglcgcgcgcggaiguiggcigigtiggcigggcgcigtgigccicguligtcggctcatglicuccatcaalaalcagltigulliciggcigggciciggctgtgcactcatcctcgccgtttfactctffttcgccaaaacggatgcgccctcttctgccacggttgccaatgcggtaggtgccaaccattcggcatttagccttaagctggcactggaactgttcagacagccaaaactgtggtttttgtcactgtatgttattggcgtttcctgcacctacgatgtttttgaccaacagtttgctaatttctttacttcgttctttgctaccggtgaacagggtacgcgggtatttggctacgtaacgacaatgggcgaattacttaacgcctcgattatglcttigcgccacigalcattaalcgcacggiggguaaaacgccclgcigciggciggcaclaltaiglcgtacglattaliggcicatcgticgccaccikaeerkca
GB/T 40186—2021
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GB/T 40186-2021
中华人民共利国
国家标准
微生物诱变育种致遗传物质损伤强度测定Umu法
GB/T4C1862021
中国标准出版社出版发行
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2021个年5月第一版
书号：155066：1-63953
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