GB/T 40255-2021
基本信息
标准号： GB/T 40255-2021
中文名称：对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程PCR检测法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 40255-2021.Code of diagnosis for infection with hepatopancreatic parvovirus of penaeid shrimp一PCR method.
1范围
GB/T 40255规定了对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对肝胰腺细小病毒( Hepatopancreatic parvovirus, HPV),给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40255适用于对虾各生活期样品中HPV带毒情况的定性检测,以进行对虾肝胰腺细小病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 28630.4-2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EB:溴化乙锭(ethidium bromide)
EDTA:乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid)
HCl:盐酸(hydrogen chloride)
1范围
GB/T 40255规定了对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对肝胰腺细小病毒( Hepatopancreatic parvovirus, HPV),给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定。
GB/T 40255适用于对虾各生活期样品中HPV带毒情况的定性检测,以进行对虾肝胰腺细小病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 28630.4-2012白斑综合征(WSD)诊断规程第4部分:组织病理学诊断法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp:碱基对(basepair)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
dNTPs:脱氧核糖核苷三磷酸( deoxy-ribonucleoside triphosphate)
EB:溴化乙锭(ethidium bromide)
EDTA:乙二胺四乙酸( ethylenediaminetetraacetic acid)
HCl:盐酸(hydrogen chloride)
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标准内容
ICS 65.020.30
CCSB41
中华人民共和国国家标准
GB/T40255—2021
对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程PCR 检测法
Code of diagnosis for infection with hepatopancreatic parvovirus ofpenaeid shrimpPCR method
2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
-riKacerKAca-
GB/T 40255—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国农业农村部提出，本文件由全国水产标准化技术委员会（SA/T156）归口本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人：杨冰、万晓媛、黄健、余卫忠、史成银、张锋、宋晓冷、李清、张庆利、许华、李晨、刘莉。
rrKaeerkAca-
-riKacerKAca-
1范围
对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程PCR检测法
GB/T40255—2021
本文件舰定了对虾吓胰腺细小病毒病诊断舰程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对斥胰腺细小病（Hepatopancreaticparvovirus，HPV)，给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定，
本文件活用干对虾各生活期样比巾HPV带毒悟况的定性检测，以进行对虾肝睫腺细小病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其巾，注日期的引用文件，仅该期对应的版本适用于本文件；不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本支件。
GB/T28630.42012白斑综合征（WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义，4缩略语
下列缩咯语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
DNA：脱氧核瓣核酸（deoxyribonucleicacicl)dNTPs：脱氧核糖核磷酸（deoxyribonucleosidletriphosphate）EB：溴化乙锭(ethidiumbromide)EDTA：乙二胺四乙酸（ethylencdiaminctetraaccticacid)HCl:盐酸(hydrogcn chloride)
HPV：肝胰腺细小病毒（hepatopanereaticparvovirus）NaOIHI:氢氧化钠（sodiumhydroxide）PcR：聚合酶链式反成（polymerasechainreaction）Sps：十二烷基硫酸（sodiumdodecylsulfate）Tuq：水生栖热菌（thernusaquuticus）TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTA Tris·HCI)Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethyl aminomethane）1
rKaeerkAca-
GB/T40255—2021
5试剂或材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.1
5.2无水乙醇：分析纯
5.3TE缓冲液：按A.3配制
抽提缓冲液：接A.6配制
蛋白酶K；按A.7配制。
10mol/L乙酸铵：按A.8配制。
Tirs饱和酚（pII7.8)：分析纯
酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：分析纯，氯伤/兄戊醇（24：1）：分析纯。1X电泳缓冲液：接A.10配制。
70%乙醇：按A.11配制。
5.12dVTPs（各2.5mmol/L):生化试剂，含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP2.5mmol/L的混合物20℃保存,用于PCR。
10XPCR缓冲液：生化试剂.无Mg-离了，一20℃保存，5.14MgCl（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。5.15Tuq DNA聚合酶(5 /μL):生化试剂，—20℃保存、5.16 物 IIPV F(10 umol/L):5' GGT GAT GTG GAG GAG AGA 3',-20 C保存.5.17物 IIPV R(10 μmol/L):5'GTA ACT ATC GCC GCC AAC 3'，20 ℃保存，增IIPV 核酸中的 628 bp 片段。
5.18 内参引物 CF(10 μmo1/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3'，—20 ℃保存。5.19内参引物 CR(10 μmo1/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'，一20 ℃保存,扩增「足日牛物DNA中的848bp片段5.20PCR检测阳性对照为已知受IIPV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织：一70C保存。5.21
PCR检测阴性对照为已知末受HPV感染H.PCR结果显示阴性的对虾组织，一70℃保存。5.22
PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。琼脂糖：生化试剂，
5.24DNA分子量标准：牛化试剂：5.256×载样缓冲液：生化试剂，5.26
10mg/ml.EB贮存液：按A.12配制，或其他等效产品。6仪器设备
6.1 PCR仪。
6.2屯泳仪。免费标准下载网bzxz
6.3水平电泳槽。
紫外观察仪或凝胶成像仪。
高速离心机。
水浴锅或金属浴。
普通冰箱，
一80℃超低温冰箱
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6.9电炉或微波炉等其他川热设备：GB/T40255—2021
6.10微量移液器：量程0,5ml~10ml2l20ml20μl200μl100ml】000l.。7样品
7.1菜样对象
中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）等易感对虾。参见附录B7.2采样数量、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.42012附录B的要求。7.3样品的采集
7.3.1对虾仔虾取完整个体；幼虾、成虾和亲虾取吓胰腺；亲虾的非致死性取样可采集粪便7.3.2分了生物学检测时，存虾或达到0.5样品可以合并样本，个体销人的虾可取个休进行检测。所取样品分别置丁1.5mL离心管中，立即迹行DNA提取或暂时保存丁一20℃。8试验步骤
8.1DNA的提取
8.1.1取30mg～50mg组织样品-加人抽提缓冲液500l.,充分研磨，37温浴1h。提取过程同吋设置阳性对照和阴性对照，
8.1.2加入2.5L20mg/mL蛋白酶K，至终浓度100μg/mL，混匀后置丁50℃水浴3h，不时旋动。8.1.3将溶液冷却至空温，川入等体积平衡酚.颠例混合10min.于10000r/min离心3min分离两朴，
8.1.4水相移至新1.5ml.离心管中，加人等体积酚/氯仿/兄戊醇（25：21：[），颠倒混合10min，于10000t/min离心1min分离两相。8.1.5水相移至一新1.5mL离心管中，加人等体积氯仿/异戊醇（24：1）.颠倒混合10min.丁10000r/min离心1min分离两：
8.1.6水朴移至新1.5ml.离心管巾.加人100μl.10mol/1.乙酸铵.混匀后.再川入两倍体积预冷无水乙婷（-20℃）混匀，-20℃放置2h。10000r/min离心10min.弃[清。8.1.7用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min,小心弃掉「清，将沉淀于室温晾干。8.1.8加人100μuL火菌双蒸水溶解DVA：8.1.9若DNA样品需要保存川溶解丁100uLTE缓冲液中并保存丁—20℃8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2PCR扩增
8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求，加人除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂.配制成大体积的预混物，分装保存于一20℃：临用前，加人相应体积的TaaLDNA聚合酶，混勺，按1个反应体系/支分装到0.2mlPCR管巾，分别川入各样品的模板DVA（浓度：50ng/uL100ng/μL)1μl.同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。
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GB/T 40255—2021
1C×PCR缓冲液（无Mg*）
MgClz (25 mmol/L)
dNTPs(各 2.5 mmol/1.)
引物 HPV F(10 μmol/1.)
引物 HPV R(10 μmol/L)
灭菌双蒸水
TaaDNA聚合酶（U/L)
表1HPVPCR反应预混物所需试剂·组成25uL休系
注：25体系模板量1
试剂终浓度
1XPCR缓冲液
200 μmol/1.
1 μmol/l.
8.2.2将上述川有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94C预变性5min：94℃变性1min60℃选火1min72℃延伸1min，40个循环：72℃延伸7min:最后4℃保温8.2.3每份样品均设立十足生物内参对照，扩增十足月生物红织DNA的PCR反应体系接照表2的要求。分别加人各样品的模板DNA（浓度：50ng/μL-100ng/μL)1μL表2扩增十足目生物组织DNA PCR反应体系试剂·组成试剂
10XPCR缓冲液（无Mg+）
MgCL (25 tmmol/L)
dVTPs(各2.5mmol/L)
内参引物CF(loumol/L)
内参引物CR(10μmol/L)
火菌双蒸水
Tag DNA聚合酶( U/μl)
注：25l.体系模量1l.。
25L体系
试剂终浓度
IXPCR缓冲液
1.5mmol/L
20G unol/L
I peol/1
I pemol/L
0.02 U/l.
8.2.4按以下程序迹行扩增：94℃预变性3min94℃变性1min.55℃退火1min、72℃延仲1min35个循环；72℃延仲5min4℃保温8.3琼脂糖凝胶电泳及测序
8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶.加人10mg/mLEB至终浓度0.5μg/mL，摇勾：制备琼脂糖避胶。8.3.2将5LPCR反应物与1μL6X载样缓冲液混勾后加人加样孔中。同时设立DVA分子量标准对照：
8.3.3在1V/cm~5V/cm的电压下电.使DNA由负极向止极移动：当载样缓冲液中溴龄蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖避胶的1/223处时停止电冰，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观繁或拍照。
如果观察到预期大小条带，刘对PCR扩增产物进行测序。-rrKaeerKAca-
9结果判定
检测结果成立条件
GB/T40255—2021
十足目生物组织样品在848bp处有特定条带.阳性对照在628bp处有特定条带，阴性对照作628bp处无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。9.2
检测结果判定
检测样品在628bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录（）进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性；检测样品在628bp处无条带判为PCR结果阴性。r kaeerkAca
GB/T40255—2021
A.11mol/LTris·HCI(pH8.0)
附录A
（规范性）
试剂配方
溶解后加人约42mL浓盐酸调pH接近8.0.冷却至室温，再用2.5mol/LHCl调整pH至8.0。加水定容至
分装后，高压蒸气灭菌，室温贮存。A.2 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)
乙二胺四乙酸二钠(EDTANa·2IO)水
磁力搅拌，用2.5mol/LNaOII调节溶液pII至8.0.完全溶解，定容至100ml：高压蒸气火菌、室温些存
A.3TE缓冲液(pH8.0）
1 mol/L Tris ·HCl(pH8.0)
0.5 mol/L EDTA(pH8.0)
加水定容至
高压蒸气灭菌，4℃贮存。
A.41 mg/mI 胰 RNA酶
胰RNA酶
TE缓冲液(pH8.0）
1000ml
溶解后，丁100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装100uL/管，一20℃烂存A.510%SDS
加热至68℃助溶，入几滴浓盐酸调节溶液pII至7.2.加水定容至100mL。室温些存：若溶液有结品形战，用前加热融解即可，SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平「的SDS，
-rKaeerkca-
A.6抽提缓冲液
1 mol/LTris·HCl(pH8.0)
0.5 mol/L EDTA(pI18.0)
1mg/mL胰RNA酶
10%SDS
加水定容牟
混勾，室温些存。
A.720 mg/mL蛋白酶K
蛋白酶K
溶解后分装丁1.5mL离心管中（0.25mL/管），一20℃下保存810mol/L乙酸铵
乙酸铵
川水定容至100mL，经0.45μm滤膜过滤除茵，4℃贮存。A.950×电泳缓冲液
冰乙酸
0.5mol/LEI)TA(pH8.0)
加水定容至
室温些存。
1×电泳缓冲液
50X电泳缓冲液
加水定容至
室温些存
170%乙醇
无水乙醇
加水30mL.混匀，定容至
分装后，室温贮存，
1000mL
1000mL
-rrKaeerKAca-
GB/T 40255—2021
GB/T40255—2021
210mg/mLEB贮存液
磁力搅拌数小时以确保其完全溶解：室温保存于棕色瓶或用铝铂包裹的瓶巾，8
rrkaeerkAca
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中华人民共和国国家标准
GB/T40255—2021
对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程PCR 检测法
Code of diagnosis for infection with hepatopancreatic parvovirus ofpenaeid shrimpPCR method
2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
-riKacerKAca-
GB/T 40255—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国农业农村部提出，本文件由全国水产标准化技术委员会（SA/T156）归口本文件起草单位：中国水产科学研究院黄海水产研究所、全国水产技术推广总站本文件主要起草人：杨冰、万晓媛、黄健、余卫忠、史成银、张锋、宋晓冷、李清、张庆利、许华、李晨、刘莉。
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1范围
对虾肝胰腺细小病毒病诊断规程PCR检测法
GB/T40255—2021
本文件舰定了对虾吓胰腺细小病毒病诊断舰程中普遍适用的核酸检测技术的要求，针对斥胰腺细小病（Hepatopancreaticparvovirus，HPV)，给出了PCR检测法所需试剂或材料、仪器设备、样品、试验步骤和结果判定，
本文件活用干对虾各生活期样比巾HPV带毒悟况的定性检测，以进行对虾肝睫腺细小病毒病的流行病学调查、诊断、检疫和监测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其巾，注日期的引用文件，仅该期对应的版本适用于本文件；不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本支件。
GB/T28630.42012白斑综合征（WSD)诊断规程第4部分：组织病理学诊断法3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义，4缩略语
下列缩咯语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
DNA：脱氧核瓣核酸（deoxyribonucleicacicl)dNTPs：脱氧核糖核磷酸（deoxyribonucleosidletriphosphate）EB：溴化乙锭(ethidiumbromide)EDTA：乙二胺四乙酸（ethylencdiaminctetraaccticacid)HCl:盐酸(hydrogcn chloride)
HPV：肝胰腺细小病毒（hepatopanereaticparvovirus）NaOIHI:氢氧化钠（sodiumhydroxide）PcR：聚合酶链式反成（polymerasechainreaction）Sps：十二烷基硫酸（sodiumdodecylsulfate）Tuq：水生栖热菌（thernusaquuticus）TE:Tris盐酸和EDTA缓冲液(EDTA Tris·HCI)Tris：三羟甲基氨基甲烷（trishydroxymethyl aminomethane）1
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GB/T40255—2021
5试剂或材料
除非另有说明,在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。5.1
5.2无水乙醇：分析纯
5.3TE缓冲液：按A.3配制
抽提缓冲液：接A.6配制
蛋白酶K；按A.7配制。
10mol/L乙酸铵：按A.8配制。
Tirs饱和酚（pII7.8)：分析纯
酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：分析纯，氯伤/兄戊醇（24：1）：分析纯。1X电泳缓冲液：接A.10配制。
70%乙醇：按A.11配制。
5.12dVTPs（各2.5mmol/L):生化试剂，含 dATP、dTTP、dGTP、dCTP2.5mmol/L的混合物20℃保存,用于PCR。
10XPCR缓冲液：生化试剂.无Mg-离了，一20℃保存，5.14MgCl（25mmol/L）：生化试剂，一20℃保存。5.15Tuq DNA聚合酶(5 /μL):生化试剂，—20℃保存、5.16 物 IIPV F(10 umol/L):5' GGT GAT GTG GAG GAG AGA 3',-20 C保存.5.17物 IIPV R(10 μmol/L):5'GTA ACT ATC GCC GCC AAC 3'，20 ℃保存，增IIPV 核酸中的 628 bp 片段。
5.18 内参引物 CF(10 μmo1/L):5'-TGC-CTT-ATC-AGC-TNT-CGA-TTG-TAG-3'，—20 ℃保存。5.19内参引物 CR(10 μmo1/L):5'-TTC-AGN-TTT-GCA-ACC-ATA-CTT-CCC-3'，一20 ℃保存,扩增「足日牛物DNA中的848bp片段5.20PCR检测阳性对照为已知受IIPV感染且PCR结果显示阳性的对虾组织：一70C保存。5.21
PCR检测阴性对照为已知末受HPV感染H.PCR结果显示阴性的对虾组织，一70℃保存。5.22
PCR检测空白对照以灭菌双蒸水作模板。琼脂糖：生化试剂，
5.24DNA分子量标准：牛化试剂：5.256×载样缓冲液：生化试剂，5.26
10mg/ml.EB贮存液：按A.12配制，或其他等效产品。6仪器设备
6.1 PCR仪。
6.2屯泳仪。免费标准下载网bzxz
6.3水平电泳槽。
紫外观察仪或凝胶成像仪。
高速离心机。
水浴锅或金属浴。
普通冰箱，
一80℃超低温冰箱
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6.9电炉或微波炉等其他川热设备：GB/T40255—2021
6.10微量移液器：量程0,5ml~10ml2l20ml20μl200μl100ml】000l.。7样品
7.1菜样对象
中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）等易感对虾。参见附录B7.2采样数量、方法和保存运输
采样数量、方法和保存运输应符合GB/T28630.42012附录B的要求。7.3样品的采集
7.3.1对虾仔虾取完整个体；幼虾、成虾和亲虾取吓胰腺；亲虾的非致死性取样可采集粪便7.3.2分了生物学检测时，存虾或达到0.5样品可以合并样本，个体销人的虾可取个休进行检测。所取样品分别置丁1.5mL离心管中，立即迹行DNA提取或暂时保存丁一20℃。8试验步骤
8.1DNA的提取
8.1.1取30mg～50mg组织样品-加人抽提缓冲液500l.,充分研磨，37温浴1h。提取过程同吋设置阳性对照和阴性对照，
8.1.2加入2.5L20mg/mL蛋白酶K，至终浓度100μg/mL，混匀后置丁50℃水浴3h，不时旋动。8.1.3将溶液冷却至空温，川入等体积平衡酚.颠例混合10min.于10000r/min离心3min分离两朴，
8.1.4水相移至新1.5ml.离心管中，加人等体积酚/氯仿/兄戊醇（25：21：[），颠倒混合10min，于10000t/min离心1min分离两相。8.1.5水相移至一新1.5mL离心管中，加人等体积氯仿/异戊醇（24：1）.颠倒混合10min.丁10000r/min离心1min分离两：
8.1.6水朴移至新1.5ml.离心管巾.加人100μl.10mol/1.乙酸铵.混匀后.再川入两倍体积预冷无水乙婷（-20℃）混匀，-20℃放置2h。10000r/min离心10min.弃[清。8.1.7用70%乙醇洗涤沉淀2次，每次10000r/min离心5min,小心弃掉「清，将沉淀于室温晾干。8.1.8加人100μuL火菌双蒸水溶解DVA：8.1.9若DNA样品需要保存川溶解丁100uLTE缓冲液中并保存丁—20℃8.1.10可采用同等抽提效果的其他方法或使用商品化DNA提取试剂盒。8.2PCR扩增
8.2.1PCR反应体系：按照表1的要求，加人除TaqDNA聚合酶以外的各项试剂.配制成大体积的预混物，分装保存于一20℃：临用前，加人相应体积的TaaLDNA聚合酶，混勺，按1个反应体系/支分装到0.2mlPCR管巾，分别川入各样品的模板DVA（浓度：50ng/uL100ng/μL)1μl.同时设阳性对照、阴性对照和空白对照。
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GB/T 40255—2021
1C×PCR缓冲液（无Mg*）
MgClz (25 mmol/L)
dNTPs(各 2.5 mmol/1.)
引物 HPV F(10 μmol/1.)
引物 HPV R(10 μmol/L)
灭菌双蒸水
TaaDNA聚合酶（U/L)
表1HPVPCR反应预混物所需试剂·组成25uL休系
注：25体系模板量1
试剂终浓度
1XPCR缓冲液
200 μmol/1.
1 μmol/l.
8.2.2将上述川有DNA模板的PCR管按以下程序进行扩增：94C预变性5min：94℃变性1min60℃选火1min72℃延伸1min，40个循环：72℃延伸7min:最后4℃保温8.2.3每份样品均设立十足生物内参对照，扩增十足月生物红织DNA的PCR反应体系接照表2的要求。分别加人各样品的模板DNA（浓度：50ng/μL-100ng/μL)1μL表2扩增十足目生物组织DNA PCR反应体系试剂·组成试剂
10XPCR缓冲液（无Mg+）
MgCL (25 tmmol/L)
dVTPs(各2.5mmol/L)
内参引物CF(loumol/L)
内参引物CR(10μmol/L)
火菌双蒸水
Tag DNA聚合酶( U/μl)
注：25l.体系模量1l.。
25L体系
试剂终浓度
IXPCR缓冲液
1.5mmol/L
20G unol/L
I peol/1
I pemol/L
0.02 U/l.
8.2.4按以下程序迹行扩增：94℃预变性3min94℃变性1min.55℃退火1min、72℃延仲1min35个循环；72℃延仲5min4℃保温8.3琼脂糖凝胶电泳及测序
8.3.1配制1.5%的琼脂糖凝胶.加人10mg/mLEB至终浓度0.5μg/mL，摇勾：制备琼脂糖避胶。8.3.2将5LPCR反应物与1μL6X载样缓冲液混勾后加人加样孔中。同时设立DVA分子量标准对照：
8.3.3在1V/cm~5V/cm的电压下电.使DNA由负极向止极移动：当载样缓冲液中溴龄蓝指示剂的色带迁移至琼脂糖避胶的1/223处时停止电冰，将凝胶置于紫外观察仪或凝胶成像仪下观繁或拍照。
如果观察到预期大小条带，刘对PCR扩增产物进行测序。-rrKaeerKAca-
9结果判定
检测结果成立条件
GB/T40255—2021
十足目生物组织样品在848bp处有特定条带.阳性对照在628bp处有特定条带，阴性对照作628bp处无条带且空白对照不出现任何条带，实验有效。9.2
检测结果判定
检测样品在628bp处有条带，测序结果同参考序列（参见附录（）进行比对，结果符合的可判为PCR结果阳性；检测样品在628bp处无条带判为PCR结果阴性。r kaeerkAca
GB/T40255—2021
A.11mol/LTris·HCI(pH8.0)
附录A
（规范性）
试剂配方
溶解后加人约42mL浓盐酸调pH接近8.0.冷却至室温，再用2.5mol/LHCl调整pH至8.0。加水定容至
分装后，高压蒸气灭菌，室温贮存。A.2 0.5 mol/L EDTA(pH8.0)
乙二胺四乙酸二钠(EDTANa·2IO)水
磁力搅拌，用2.5mol/LNaOII调节溶液pII至8.0.完全溶解，定容至100ml：高压蒸气火菌、室温些存
A.3TE缓冲液(pH8.0）
1 mol/L Tris ·HCl(pH8.0)
0.5 mol/L EDTA(pH8.0)
加水定容至
高压蒸气灭菌，4℃贮存。
A.41 mg/mI 胰 RNA酶
胰RNA酶
TE缓冲液(pH8.0）
1000ml
溶解后，丁100℃加热15min，缓慢冷却至室温，分装100uL/管，一20℃烂存A.510%SDS
加热至68℃助溶，入几滴浓盐酸调节溶液pII至7.2.加水定容至100mL。室温些存：若溶液有结品形战，用前加热融解即可，SDS微细晶粒易于扩散，称量时要戴面罩，称量完毕后要清除残留在称量工作台区和天平「的SDS，
-rKaeerkca-
A.6抽提缓冲液
1 mol/LTris·HCl(pH8.0)
0.5 mol/L EDTA(pI18.0)
1mg/mL胰RNA酶
10%SDS
加水定容牟
混勾，室温些存。
A.720 mg/mL蛋白酶K
蛋白酶K
溶解后分装丁1.5mL离心管中（0.25mL/管），一20℃下保存810mol/L乙酸铵
乙酸铵
川水定容至100mL，经0.45μm滤膜过滤除茵，4℃贮存。A.950×电泳缓冲液
冰乙酸
0.5mol/LEI)TA(pH8.0)
加水定容至
室温些存。
1×电泳缓冲液
50X电泳缓冲液
加水定容至
室温些存
170%乙醇
无水乙醇
加水30mL.混匀，定容至
分装后，室温贮存，
1000mL
1000mL
-rrKaeerKAca-
GB/T 40255—2021
GB/T40255—2021
210mg/mLEB贮存液
磁力搅拌数小时以确保其完全溶解：室温保存于棕色瓶或用铝铂包裹的瓶巾，8
rrkaeerkAca
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