GB/T 40254-2021
基本信息
标准号： GB/T 40254-2021
中文名称：轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法
标准类别：国家标准(GB)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：2476088
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 40254-2021.Detection and identification of Verticillium Nees using real-time PCR.
1范围
GB/T 40254描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检疫鉴定方法。
GB/T 40254适用于携带轮枝菌属病菌的土壤、植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2589植物病原真菌检测规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4基本信息
中文名:轮枝菌属。
学名:Verticillium Nees.
轮枝菌属隶属于真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota) ,盘菌亚门( Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes)中的小不整球壳科( Plectosphaerellaceae)。
传播途径:轮枝菌属病菌主要由种子传播,也可经病残体、土壤、风、灌溉水和昆虫传播。
5鉴定原理
根据轮枝菌属病菌的DNA序列特征及实时荧光PCR原理,应用所设计引物或探针对轮枝菌属病菌进行检测鉴定。
6仪器设备和器具、试剂和培养基
6.1 仪器设备和器具
高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、微量紫外分光光度计、高
速冷冻离心机、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR仪、微量移液器(0.1μL.~2.5μL、
1 μL~10 μL、10 μL~50 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL)、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片。
1范围
GB/T 40254描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检疫鉴定方法。
GB/T 40254适用于携带轮枝菌属病菌的土壤、植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 2589植物病原真菌检测规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4基本信息
中文名:轮枝菌属。
学名:Verticillium Nees.
轮枝菌属隶属于真菌界(Fungi),子囊菌门(Ascomycota) ,盘菌亚门( Pezizomycotina),粪壳菌纲(Sordariomycetes)中的小不整球壳科( Plectosphaerellaceae)。
传播途径:轮枝菌属病菌主要由种子传播,也可经病残体、土壤、风、灌溉水和昆虫传播。
5鉴定原理
根据轮枝菌属病菌的DNA序列特征及实时荧光PCR原理,应用所设计引物或探针对轮枝菌属病菌进行检测鉴定。
6仪器设备和器具、试剂和培养基
6.1 仪器设备和器具
高压灭菌锅、显微镜、解剖镜、天平、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、微量紫外分光光度计、高
速冷冻离心机、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR仪、微量移液器(0.1μL.~2.5μL、
1 μL~10 μL、10 μL~50 μL、20 μL~200 μL、100 μL~1 000 μL)、锥形瓶、培养皿、载玻片、盖玻片。
标准图片预览
标准内容
ICS65.020.01
CCS B16
中华人民共和国国家标准
GB/T40254—2021
轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法Detection and identification of Verticillium Nees using real-time PCR2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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GB/T 40254—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利：本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、西宁市蔬菜技术服务中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国乌兽木齐海关。木文件主要起草人：段维军、蔡磊、张慧丽、赵鹏、张晓梅、郭立新、刘芳、李雪莲、张永江、张小菊、陈先锋
rrKaeerkAca-
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1范围
轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法GB/T 40254—2021
本文件描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检疫鉴定方法。本文件适用于携带轮枝菌属病菌的十壤、植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注Ⅱ期的引用义件，仅该期对应的版本适用于本文件：不注期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件
SN/T2589植物病原直菌检测规范3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息
中文名轮枝菌属
学名：VerticilliumNees.
轮枝菌属隶属于真菌界（Fungi），了囊菌门（Ascomycola），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌纲(Sordariomycctes)中的小不整球壳科(Plectosphacrcllaccac)。传摇途径：轮枝菌属病菌主要由种子传播，也可经病残体、土壤、风、灌溉水和昆虫传播。5鉴定原理
根据轮枝菌属病菌的I)NA序列特征及实时荧光P('R原埋.成用所设计引物或探针对轮枝菌属病菌进行检测鉴定：
6仪器设备和器具、试剂和培养基仪器设备和器具
高压火菌锅、显微镜，解剖镜、大平、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、微量紫外分光光度计，高速冷冻离心机、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.1L-~2.5L、1μl.10 μl,10μl50μL,20 l200 μL100 μl. 000μl)、锥形瓶、培养m、载玻片盖玻片1
rKaeerkAca-
GB/T40254—2021
6.2试剂
除刃有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂：次氯酸钠、液氮、超纯水、「六烷基=甲基溴化铵（CTAB)提取液（2%CTAB，1.4 mol/LNaC120mmol/1.EDrA.[00mmol/I.1ris·HClpH8.0）、ris饱和酚、三氯中烧、异醇、异丙醇、70%乙醇、核糖核酸（RNA)酶、PCR反应试剂：2XTaqManUniversalPCRMasterMix：6.3培养基
马铃薯葡菊糖琼脂培养基（PDA）：将200g马铃薯去皮，切小块，沸水点20min后过滤，充去滤渣，在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20g加蒸留水定容至11.。配成溶液后[21℃下灭菌20mim，7检疫鉴定
7.1样品的采集与处理
样品的采集、分离、纯化和培养按照SV/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。7.2核酸的制备
采用基固组提取试剂盒制备IDVA，或来用改良的CTAB提收法，CTAB提取法应符合附录A，7.3DNA纯度与浓度的测定
用微量紫外分光光度计测定1NA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度-OD/OD23
DNA浓度-50XODg/mL
用于实时荧光PCR检测的DNA溶液的OI/OD:比值应为1.7~~1.97.4实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测方法应符合附录B。8结果判定
以疑似分离物或样品的实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据，疑似分离物：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性：无典型扩增曲线判定为阴性，
样品检测：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线，1.C值35，判定为阳性；35C1值.40，增川DNA用量2倍10倍再次测试.出现典型扩增曲线，且Ct值35，判定为阳性，其余情况判定为阴性，
9样品保存与复核
9.1样品保存与结果记录
保存植物样品应置于2℃8℃冰箱要善保存，对检出轮枝菌属病菌的样品应至少保存6个月.以iiKaeerkAca-
备复检、谈判和仲裁
分离到的轮枝菌属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PI)A)中妥善保存。GB/T 40254—2021
样品的米源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签宁。实时荧光PCR要有检测阳性结果照片。
2复核
由指定的单位或人员负责·主要考察试验原始数据记录及实时荧光PCR检测结果等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验3
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GB/T40254—2021
附录A
（规范性）
DNA提取方法
A.1收集培养分离得到的菌丝或植物组织样品，放人浸在液氮单的1.5mL离心管，用无菌塑料杆迅速碾碎，
A.2加人600μl.65℃预热的（TAB抽提液，颠倒混勾后于65℃水浴锅0.5h~1hA.3冷却至空温后，12000 r/min离心10min,取上清液至另一离心管中，A.4，加入1/2体积（300uL)的Tris饱和酚及1/2体积(300uL)的-氯甲烷：异戊醇（24：1）.颠倒混勾后静置至其开始分层。
A.512000r/min离心10min,取上清液至另离心警巾。A.6可重复A.1至A.5步骤2次~3次，视两相界处杂质的多少而定。加人等体积氯甲烷：异戊醇（24：1)，轻轻颠倒混勾。A.7免费标准bzxz.net
12000r/min离心10min，取上清液至另一离心管中向上清液中川人等体积异内醇，轻轻颠例混合均匀后于4℃或一20℃冰箱沉淀1h，012000r/min离心10min，弃去1清液，加500l.70%乙醇总浮沉淀，A.10
A.1112000 r/min离心5min.弃[:清液，室温干燥。A.12加50L无菌水或TE缓冲液（10mmol/LTris·HCl，1 mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，20℃冰箱贮存备用。
注：DVA提取办可采用商品化I)NA提取试剂盒。rrKaeerkAca-
B.1引物及探针序列
附录B
（规范性）
实时荧光PCR方法
正向引物 VF:5-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3反向引物VR：5-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3GB/T40254—2021
探针VP:5'FAMTGGCCCGGTGTTGGMGB3'探针5'端含有FAM报牛荧光染料，3端含有不发荧光的滚灭基团并其有MGB分子，B.2扩增体系
PCR扩增反应体系为：2XTaqManCniversalPCRMasterMix12.5μL、引物VF/VR各0.4umol/L、探VP0.2mol/L：反应总体积为25l：将反应体系混合均匀后置丁荧光PCR仪中行反应以轮枝菌属病菌DNA作阳性对照、不含轮枝菌属病菌的DVA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空户对照.每个样品设置3个重复
B.3扩增反应条件
扩增反应条件为：95℃10min，然后94℃15s，60℃608，共40个循环注：IVA模假的取量根据DNA的提取浓度纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整，5
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GB/T40254—2021
参考文献
[1_段维军，郭立新，顾建锋，等．基丁COI基因分析的植物病原性轮枝菌条形码评价L门].植物检疫，2013，27(6):4145.
L2段维军，郭立新，张慧丽，等进境台湾片荣上-株变黑轮枝菌的鉴定LJ」植物检疫，2012，26(4):80-84.
［3］段维军，郭立新，张祥林，等，检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定门.植物病理学报，2013，13(3):274-285.
L4段维军，张慧丽，郭立新，等.ITS片段作为轮枝菌DNA条形码的评价研究J，植物保扩，2013.39(4).72 77.
[5-Barbara D]. Clewes E. Plant pathogcnic Vericillium specics: how many of them arc therc?J].Molccular Plant Pathology.2003,4:297-305.[6- Camele I, Marcone C, Caponero A, el al. First repori of Verticillium duhliae causing ver.ticillium wilt of Solanum aethiopicum in Italy LJ1. Plant Pathology,2006, 55(4): 581 58l.[7T Collins A,Okoli CAN.Morton A.et al.Isolates of Verticillium dahliae pathogcnic to crucifera are of at least thrce distinct moleeular typc: [J_, Phytopathology, 2003, 93: 361-376.[8_ Dechode J, Van Poucke K, Franca S C, ct al. Dctection of multiple Verticillium Species insoil using densiiy flotation and real-time polynerase chain reuction L11.Plant Disease, 2011, 95(12):15711580
IgIndlerbitzin P,Davis RM.Bostock RM,et al. The ascomycete Verticilium longisporumn isa hyhrid and a plant pathogcn with an cxpanded host rangc [Jl, PLoS ONE. 201I, 6(3): 18260.[1o] Giraldo A, Crous PW. Inside PlectosphatrellaceaeJ]. Stuies in Mycology, 2o18, 92:227-286.
LIlI Kirk PM, Cannon PF, Minter DW, et al, Dictionary of the fungi LM]. Wallingford: CABI,2008:724.
[12] Klosterman SJ, Atallah ZK. Vallad GE, ct al. IDiversity, pathogcnicity, and managcncntof Verticillium Species jl. Annual Review of Phytopathology, 2009, 47: 39-62.[13] Nees von E, Gouilried C. Das System der Pilze und Schwamme [M]. Wirtzburg, Germany：StahelschenBuchhandlung+1817.[14Pramateftaki PV.Antoniou PP.Typas MA.The complete DNA sequence of the nuclearrihosomal RNA genc complex of Verticilliun dahliae: intraspccifie heterogencity within theintergenic spacer region [J]. Fungal geneties and biology, 2000, 29(2): 19-27.[15]J Qin QM, Vallad G E, Wu B M. et al. Phylogenetic analyses of phyiopathogenic isolales ofVerticittium spp.LJl.Phytopathology2006.96(6):582592.[16] Zare R, Gams W, Starink Willemse M, Summerbell RC. Gibellulopsis. a suitable genusfor Verticilliun nigrescens, and Musicillium. a ncw gcnus for V, theobromae JI. Nova Hedwigia.2007; 85(3-4):463-489.
[17. Zhang H W, Zhang W, Zhou J, el al. First report of wilt ol Anygdalus communis causedby Verticillium dahliae in China LJl. Plant Pathology, 2008, 57(4): 781 781.-rrKaeerKa-
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中华人民共和
国家标准
轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法GB/T 4G254—2021
中国标准出版社出版发行
北京市朝阳区和平单西街申2号（100029）北京市西城区三里河北街16号（100015）网址：spc.org.cn
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2021年5月第一版
书号：135066·167708
版权专有
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侵权必究
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中华人民共和国国家标准
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轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法Detection and identification of Verticillium Nees using real-time PCR2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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GB/T 40254—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利：本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中华人民共和国宁波海关、中国科学院微生物研究所、西宁市蔬菜技术服务中心、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国乌兽木齐海关。木文件主要起草人：段维军、蔡磊、张慧丽、赵鹏、张晓梅、郭立新、刘芳、李雪莲、张永江、张小菊、陈先锋
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1范围
轮枝菌属实时荧光PCR检疫鉴定方法GB/T 40254—2021
本文件描述了植物病原真菌轮枝菌属实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检疫鉴定方法。本文件适用于携带轮枝菌属病菌的十壤、植物及其产品中轮枝菌属病菌的检测筛查2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注Ⅱ期的引用义件，仅该期对应的版本适用于本文件：不注期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件
SN/T2589植物病原直菌检测规范3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4基本信息
中文名轮枝菌属
学名：VerticilliumNees.
轮枝菌属隶属于真菌界（Fungi），了囊菌门（Ascomycola），盘菌亚门（Pezizomycotina），粪壳菌纲(Sordariomycctes)中的小不整球壳科(Plectosphacrcllaccac)。传摇途径：轮枝菌属病菌主要由种子传播，也可经病残体、土壤、风、灌溉水和昆虫传播。5鉴定原理
根据轮枝菌属病菌的I)NA序列特征及实时荧光P('R原埋.成用所设计引物或探针对轮枝菌属病菌进行检测鉴定：
6仪器设备和器具、试剂和培养基仪器设备和器具
高压火菌锅、显微镜，解剖镜、大平、水浴锅、制冰机、纯水仪、涡旋振荡器、微量紫外分光光度计，高速冷冻离心机、冰箱、超净工作台、生化培养箱、通风橱、实时荧光PCR仪、微量移液器（0.1L-~2.5L、1μl.10 μl,10μl50μL,20 l200 μL100 μl. 000μl)、锥形瓶、培养m、载玻片盖玻片1
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GB/T40254—2021
6.2试剂
除刃有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂：次氯酸钠、液氮、超纯水、「六烷基=甲基溴化铵（CTAB)提取液（2%CTAB，1.4 mol/LNaC120mmol/1.EDrA.[00mmol/I.1ris·HClpH8.0）、ris饱和酚、三氯中烧、异醇、异丙醇、70%乙醇、核糖核酸（RNA)酶、PCR反应试剂：2XTaqManUniversalPCRMasterMix：6.3培养基
马铃薯葡菊糖琼脂培养基（PDA）：将200g马铃薯去皮，切小块，沸水点20min后过滤，充去滤渣，在滤液中加入葡萄糖和琼脂粉各20g加蒸留水定容至11.。配成溶液后[21℃下灭菌20mim，7检疫鉴定
7.1样品的采集与处理
样品的采集、分离、纯化和培养按照SV/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。7.2核酸的制备
采用基固组提取试剂盒制备IDVA，或来用改良的CTAB提收法，CTAB提取法应符合附录A，7.3DNA纯度与浓度的测定
用微量紫外分光光度计测定1NA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度-OD/OD23
DNA浓度-50XODg/mL
用于实时荧光PCR检测的DNA溶液的OI/OD:比值应为1.7~~1.97.4实时荧光PCR检测
实时荧光PCR检测方法应符合附录B。8结果判定
以疑似分离物或样品的实时荧光PCR检测结果作为鉴定依据，疑似分离物：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线判定为阳性：无典型扩增曲线判定为阴性，
样品检测：阳性对照和空白对照正常，出现典型扩增曲线，1.C值35，判定为阳性；35C1值.40，增川DNA用量2倍10倍再次测试.出现典型扩增曲线，且Ct值35，判定为阳性，其余情况判定为阴性，
9样品保存与复核
9.1样品保存与结果记录
保存植物样品应置于2℃8℃冰箱要善保存，对检出轮枝菌属病菌的样品应至少保存6个月.以iiKaeerkAca-
备复检、谈判和仲裁
分离到的轮枝菌属病菌应接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PI)A)中妥善保存。GB/T 40254—2021
样品的米源、种类、采样时间、检测时间、地点、方法、结果等，并有实验人员的签宁。实时荧光PCR要有检测阳性结果照片。
2复核
由指定的单位或人员负责·主要考察试验原始数据记录及实时荧光PCR检测结果等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验3
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附录A
（规范性）
DNA提取方法
A.1收集培养分离得到的菌丝或植物组织样品，放人浸在液氮单的1.5mL离心管，用无菌塑料杆迅速碾碎，
A.2加人600μl.65℃预热的（TAB抽提液，颠倒混勾后于65℃水浴锅0.5h~1hA.3冷却至空温后，12000 r/min离心10min,取上清液至另一离心管中，A.4，加入1/2体积（300uL)的Tris饱和酚及1/2体积(300uL)的-氯甲烷：异戊醇（24：1）.颠倒混勾后静置至其开始分层。
A.512000r/min离心10min,取上清液至另离心警巾。A.6可重复A.1至A.5步骤2次~3次，视两相界处杂质的多少而定。加人等体积氯甲烷：异戊醇（24：1)，轻轻颠倒混勾。A.7免费标准bzxz.net
12000r/min离心10min，取上清液至另一离心管中向上清液中川人等体积异内醇，轻轻颠例混合均匀后于4℃或一20℃冰箱沉淀1h，012000r/min离心10min，弃去1清液，加500l.70%乙醇总浮沉淀，A.10
A.1112000 r/min离心5min.弃[:清液，室温干燥。A.12加50L无菌水或TE缓冲液（10mmol/LTris·HCl，1 mol/LEDTApH8.0)溶解沉淀，20℃冰箱贮存备用。
注：DVA提取办可采用商品化I)NA提取试剂盒。rrKaeerkAca-
B.1引物及探针序列
附录B
（规范性）
实时荧光PCR方法
正向引物 VF:5-CTGTCCGAGCGTCGTTTCA-3反向引物VR：5-CCACTGCTTTTAAGGGCCTACA-3GB/T40254—2021
探针VP:5'FAMTGGCCCGGTGTTGGMGB3'探针5'端含有FAM报牛荧光染料，3端含有不发荧光的滚灭基团并其有MGB分子，B.2扩增体系
PCR扩增反应体系为：2XTaqManCniversalPCRMasterMix12.5μL、引物VF/VR各0.4umol/L、探VP0.2mol/L：反应总体积为25l：将反应体系混合均匀后置丁荧光PCR仪中行反应以轮枝菌属病菌DNA作阳性对照、不含轮枝菌属病菌的DVA作阴性对照、以无菌蒸馏水作空户对照.每个样品设置3个重复
B.3扩增反应条件
扩增反应条件为：95℃10min，然后94℃15s，60℃608，共40个循环注：IVA模假的取量根据DNA的提取浓度纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整，5
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参考文献
[1_段维军，郭立新，顾建锋，等．基丁COI基因分析的植物病原性轮枝菌条形码评价L门].植物检疫，2013，27(6):4145.
L2段维军，郭立新，张慧丽，等进境台湾片荣上-株变黑轮枝菌的鉴定LJ」植物检疫，2012，26(4):80-84.
［3］段维军，郭立新，张祥林，等，检疫性轮枝菌及其近似种的鉴定门.植物病理学报，2013，13(3):274-285.
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2021年5月第一版
书号：135066·167708
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