ICS65.020.01
CCS B16
中华人民共和国国家标准
GB/T40194—2021
大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Barley stripe mosaic virus2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
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GB/T40194—2021
本文件按照GB/T1.12020%标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。本文件起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国福州海关。本文件主要起草人：张水江、沈建国、辛言言。rrKaeerkAca-
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1范围
大麦条纹花叶病毒检疫鉴定方法本文件规定「大麦条纹花叶病毒的血清学和分子生物学检疫鉴定方法，本文件适用于可能带有大友条纹花叶病毒的植物及其产品的检疫鉴定。2规范性引用文件
GB/T 40194—2021
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该期对应的版本适用于本文件：不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
：分析实验空用水规格和试验方法GB/T 6682
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义4大麦条纹花叶病毒基本信息
学名：Barley siripe mnsaic uirus缩T：BSMV
异名：Barley false siripe wirusBarley mild siripemosuicwirus,Burleymild siripewirusBarley mosaic virus,Barley stripe mosaic hordeivirus,Barley rery mild stripe mosaic virus,Oatstripe mosaic virus,Setripe mosaic virus分类地位：马泰利病毒月（Mariellimirales)）植物杆状病毒科（Virgauiridae）人麦病毒属（Hordei-uirus）成员。
人麦条纹花叶病毒的其他信息参见附录A。5方法原理
大麦条纹花叶病毒的血清学特性:和基因组特征是该病毒检疫鉴定的依据，根据13SMV与抗体之间的特另性反应，对植物样品进行双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-EI.ISA)；依据3SMV的基因组特征进行RT-PCR、实时炭光RT-PCR检测；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有BSMV6仪器用具与试剂
6.1仪器设备
6.1.1电了天平（感量0.00lg)。6.1.2高速冷冻离心机。
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6.1.3微型瞬时离心机。
6.1.4普逍冰箱
6.1.5超低温冰箱（-80）。
制冰机，
涡旋振荡器，
磁力揽摔器，
高压灭菌锅，
超净下作台。
实时荧光定量PCR仪。
PCR仪
微波炉，
电泳仪.
电槽，
凝胶成像分析仪。
洗板机。
酶标仪.
酶联板.
可调移液器（2.5μL.10μl20μl,100μ、200μl1000μL)川调移液器头。
Eppendorf管
研体：
微型磨样。
6.2试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水应符合GB/T6682中相关规定，6.2.1DAS-ELISA检测试剂，制备按附录B中B.1执行.6.2.2RT-PCR检测试剂,制备按附录C中 C.1执行。6.2.3实时荧光RT-PCR检测试剂，制备按附录D中D.1执行7检测样品的制备
7.1种子
挑取畸形不成熟种子播于灭菌土巾，待长出34止叶后将表现症状的植株编号：未表现症状的植株分组（10株为1组)并编号，采集的未表现症状的叶片分成2份：用丁酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子接逊行酶联测定和分子生物学检测。7.2植株
对丁有症状（如叶片条纹、花叶、褐色细小斑点等）的植株，每个植株编号并近行单株检测：没有症状的分红并编号后接组进行检测，分组方法和检测方法同7.1。7.3植物产品
植物产品有症状的部分（如条纹、花叶等)单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物品，分2
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组编号，分组方法和检测方法同7.1，8检测鉴定
8.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定GB/T40194—2021
包被抗体后.再把制备的样品上清液加人已包被BSMV抗体的酶联板中，迹行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔巾。健康的植物组织作为阴性对照·感染BSMV的植物组织作为阳性对照，样品提取缓冲液作为空对照；其中阴性对照的植物种类和材料（如叶片)应尽量与检测样品相致。具体操作按13.2的规定执行。
8.2RT-PCR检测
RTPCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1.灭菌双蒸水作为空对照。分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cIDNA后进行PCR检测，具体操作按（.2的规定执行。如采用商品化·步法试剂盒，则按照试剂盒说明进行。
8.3实时荧光RT-PCR检测
实时荧光RTPCR检测的阴性和阳性对照设置同8.1.灭菌双蒸水作为空对照。分别提取样品和对照的总RNA.反转录合成cINA后进行实时荧光PCR检测，具体操作按1.2和D.3的规定执行。如采用商品化一步法诚剂盒.则接照试剂盒说明进行9结果判定
DAS-ELISART-PCR和荧光RT-PCR检测方法按照13.3、C,3、I).1的判定方法进行判定.其中任意两种检测方法的结果为阳性即可判定样品携带13SMV。10样品保存与结果记录
10.1样品保存
经检测确定携带1SMV的样品应保存在适合的条件下以备复核。如种子保存在十燥空温环境巾种苗、叶片等样品保存在超低温冰箱（一80“)中；做好登记和标记工作·保存期限至少【年，10.2结果记录
记录包括样品来源、种类、检测时间、地点、方法和结果、检测人员签字。DAS ELISA检测应有酶联反成数值：RT-PCR检测有电图片：实时荧光RT-PCR检测成有荧光曲线图。3
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A.1寄主范围
附录A
（资料性）
大麦条纹花叶病毒相关资料
寄士范国有限，白然寄主主要为人麦（Hordeum ulgare）、栽培二棱人麦（H.distichon）、小麦（Triticunuestiuun）和野麦（Avenafaluu）A.2危害症状
受侵染的大麦在三叶期时即出现褐色分散的细小斑点，后逐渐增多引起叶片枯死。有的品种沿叶片中脉出现褐色条斑，在」部叫片出现黄绿相间的花叶和斑驳，轻病株能抽穗，们于粒重明显降低小麦感染大条纹花叶病寺，发病轻的，叶片上只有褪绿小斑驳；发病中等的，在叶片上山现较大的褪绿斑驳；发病中等偏重的，则山现黄色花叶或坏死斑块；发病严重的则使整张叶片变成黄白色：病株所结种子不饱满，千粒重不同程度地降低A.3分布地区
中国、以色列、日本、韩国、黎巴嫩、巴基斯坦、叙利亚、突尼斯、上环具、埃及、澳大利亚、新凹兰、丹麦、匈牙利、罗马尼亚、德国、墨四哥、美国、阿根廷、巴四、秘鲁、加拿大、南非、俄罗斯、智利、波兰、保加利业、芬兰、捷克、葡萄牙、摩尔多瓦、瑞士、塞尔维业、黑山、斯洛伐克、斯洛文尼业、乌克兰、希腊、意大利、英国、朝鲜
A.4：传播方式
该病主要通过种子传播.地川通过花粉传播，种传率分别为大麦90%~100%.小麦7%81%野燕麦22%，燕麦0~10%，长穗燕麦草22%.无芒燕麦8%，鸭跖草8%，玉米90%~100头，黑麦草属3%~8%
A.5粒体形态
病毒粒体为棒状，长度在：50nm150nm.大多数为110nm；直径约为20nmA.6基因组
基因组为正单链RNA，由三个组分组成，其中组分RNAα的长度约3.7kb,组分RNA3的长度约3.2kb.组分RNA的长度在不同株系问差别较大，约2.7kb3.1kb。-riKacerKAca-
B.1试剂
B.1.1包被抗体
附录B
（规范性）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定（DAS-FI.ISA）GB/T40194—2021
特只性人麦条纹花叶病毒抗休，建议使用商品化试剂盒抗休；1“保存不超过1年；抗体使用时的稀释比例按说明书要求稀释
酶标抗体
碱性磷酸酯酶标记的大麦条纹花叶病毒抗体底物
对硝基苯磷酸二钠（pNPP）
1×PBST缓冲液(pH7.4)
氯化钠（VaCI)
磷酸二氢钾(KH,PO,）
磷酸氢二钠（Na:HPO）
氯化钾（KCI)
吐温—20(Twccn-20)
加入900mL双蒸水并用磁力搅拌器搅拌，用pH计调节至7.4，并定容至1000mL,4℃诺存。样品抽提缓冲液（pH7.4）
亚硫酸钠(Na,SO。）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP，MW2400040000）1.3g
溶于900 ml的1XP13ST中，并用1×P13ST定容至1000 mL.1C诺存。包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na.CO,）
碳酸氢钠（NaIICO：）
溶于900ml.双蒸水中,并定容至1000ml,1℃储存。B.1.7酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）牛血清白蛋白(BSA）
聚乙烯苯吡咯烷酮（PVP.MW24000-40000）1.59g
溶于900 ml1XPBST中.并用1XPBST定容至1000mL,4℃储存，8底物缓冲液（pH9.8）
三乙醇胺
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氯化镁（MgCl）
溶于800ml.双蒸水中,用浓盐酸(HCI)调pH至9.8.定容至000mL..1C储存。B.2试验步骤
B.2.1包被抗体
按要求的浓度和需要的体积用包被缓冲液稀释包被抗体，每孔加100l。酶联板川盖或用保鲜膜包好，37孵育2h。清空孔中溶液，用「×P13S加满各孔，8min后倒掉孔中溶液，在吸水纸1拍干，再重复2次上述洗板过程。
B.2.2样品制备与加样
待测样品、阴性对照及阳性对照按1：[0(W/V)加人抽提缓冲液，在研钵中研磨；将样品研磨液例人离心管中，5000 r/min离心【0 min，「清液即为制备好的检测样品，阴性对照、阳性对照也可以按试剂盒说明阝进行处理。接100μL/孔分别加人制备好的检测样品、阴性对照和阳性对照：酶联板加盖或用保鲜膜包好，4℃孵育过夜，酶联板用白来水彻底冲洗.再用1×PBST洗涤3次，每次3min;或用洗板机自动清洗3次。
B.2.3加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液，按说明将酶标抗体稀释至工作浓度并加人到酶板中，100uL/孔，酶联板加盖或用保鲜膜包好，37℃孵育4h.酶联板用白来水彻底冲洗.再用1×PBST洗涤3次，每次3min；或用洗板机自动清洗3次
B.2.4加底物
将底物pNPP加入到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用),100μL/孔加入到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.5读数
在不同的时间内如30min、60min.90 min、120min或更长时间，用酶标仪在405nm处读0)值，B.3结果判定
B.3.1质量控制要求
对照孔的（值（缓冲液孔阴性对照及阳性对照孔)应在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的0D值0.15，当阴性对照孔的0D4值0.05时，接0.05计算；阳性对照孔的0D值/阴性对照0D值5：同一样品的重复性基本一致。B.3.2结果判定
在满足B.3.1的质量控制要求后结果原则上可判断如下：样品ODn值/阴性对照ODm值2.判为阳性：样品（D估/阴性对照D估为2时，判为可疑样品.需重新做次，或用其他方法加以验证；样品0D：值/阴性对照0D值2，判为阴性若不满足B.3.1的质量控制要求，则不能进行结果判断。公
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c.1试剂
C.1.1核酸提取试剂
Trizol或合格的RVA提取试剂盒
C.1.2电泳缓冲液TAE(50×）
羟甲基氨基甲烷（Tris）
冰乙酸（CHO）
乙二胺四乙酸二钠(Na,EDTA·2H,O)附录C
（规范性）
RT-PCR检测
双蒸水定容至1000mL，用时稀释至1×TAE.C.2检测步骤
C.2.1核酸提取
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用电子大平称收0.1品样品加液氮研磨成粉末状，迅速将H移入火菌的1.5ImL离心管（用高压火菌锅高压灭菌）巾.川人ml.的Trizol.试剂，用涡旋振荡器刷烈振荡3min：用高速冷冻离心机412000r/min离心10min;将「清液移人一新离心管中，加人0.5ml.三氯中烷.猛烈振荡15s；1C120001/min离心15min：小心吸取1.层无色水相到新离心管中：加人等休积丙醇，混匀；室温静置10min;4℃12000/min离心10min，充上清液：加入1mL75%的冷乙醇洗涤沉淀；4℃100001/min离心10 min.弃乙醇;沉淀于室温下充分十燥后溶于30uLDEPC II,0巾.微型瞬时离心机瞬离，置于普通冰箱一20保存备用注：此处以61样品为例进行核酸提取，实际检测时如样品量有变化，所人的试剂可按比例调整：或者按照商品化RNA提取试剂盒进行操作，
引物序列
上游I物BSMVF:5＇AGGATCAATGGGATACACAAGTT3下游引物BSMVR5'-TTCGAAAGTCTTCCTGGTATACAC-3产物人小：503bp。
C.2.3反转录
反转录总体系为20ul0.2mLPCR管巾加人总RVA1μL.dNTPs(10mmol/L)1μL,DEPC处理水10μL,BSMVR(20μmol/L)2μL,70℃保温5min；冰1（用制冰机制备碎冰)放置5min;再加人5Xbuffer 4 μL. RNasin(40 U/μL)1 μL, M-MLV(200 U/μL)1 μL,42 ℃保温 1 h,得到 cDNA 后用作PCR的模板。设置阳性刘照、阴性对照及空白对照：C.2.4PCR扩增
0.2mLPCR管巾川人10×PCRbuffer(含Mg-）2μL.dVTPs(10mmol/L）0.6μL.BSMVF及BSMVR(均为20μmol/L)各0.5μL,2U/μLTaq酶1μl,cDNA模板2μL和DEPC处理水13.1μL。-rKaeerkca-
GB/T40194—2021
设置阳性对照、阴性对照及空亡对照，试剂全部入后将PCR管放置到PCR仪中进行反应。反应程序：95℃，8min；95.45s：58.45：72℃.1min;40个循环.72℃.10min。注：如采用商品化步法RT-PCR检测试剂盒，可按照说明书进行操作·将少骤（.2.3和（.2.4合并进行，PCR产物琼脂糖凝胶电泳免费标准bzxz.net
用微波炉将琼脂糖融化后制备1头的琼脂凝胶并放入电泳槽.按比例混匀电泳上样缓冲液和PCR扩增产物，用DNAMarker作为分子量标记，用电泳仪迹行电泳。电泳结束后作凝胶成像分析仪中观察是否扩增出预期的特异性DVA条带，并拍摄记录：C.3结果判定
阳性对照在503bp左右处有条带,阴性对照和空白对照允特异性条带，待测样品山现与阳性对照一致的条带，川判定为阳性
阳性对照在503bp左右处有条带.阴性对照、空对照及待测样品无特异性条带，可判定结果为阴性，
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