GB/T 40135-2021.Detection and identification of Xylophilus ampelinus (Panagopoulos)Willems et  al.
1范围
GB/T 40135规定了葡萄细菌性疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测鉴定方法。
GB/T 40135适用于葡萄及其繁殖材料中葡萄细菌性疫病菌的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2122进出境植物及 植物产品检疫抽样方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4葡萄细菌性疫病菌分类信息
中文名:葡萄细菌性疫病菌、葡萄嗜木质菌
学名:Xylophilus am pelinus (Panagopoulos) Willems et al,1987
异名:Xanthomonas am pelina Panagopoulos, 1969
英文名:canker of grapevine, bacterial blight of grapevine
分类地位:细菌( Bacteria),真细菌( Eubacteria),变形菌门( Proteobacteria),变形菌纲( Betaproteobacteria) ,伯克霍尔德氏菌目( Burkholderiales),丛毛单胞菌科(Comamonadaceae),嗜木质菌属(Xylophilus)
其他信息见附录A。

ICS 65.020.01
CCS B16
中华人民共和国国家标准
GB/T40135—2021
葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Xylophilus ampelinus (Panagopoulos)Willems et al.
2021-05-21发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-12-01实施
中华人民共租国
国家标滩
葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法GB/T401352021
中国标准山版社山版发行
北京市削阳区和平里西街市2号（100029)北京市西城区三里河北街16号（100045）网址：spc.org.cn
服务热线：4001580010
2021年5月第一版
书号：155066：1-67505
版权专有
侵权必究
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GB/T40135—2021
本文件按照GB/T1.12020标准化工作导则」第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草，
请注意本文件的某些内容可能涉及专利：本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271)提出并归口。本文件主要起草单位：长沙海关技术中心、中国检验检疫科学研究院、济南海关技术中心本文件卡要起草人：周慧平、莫瑾、袁小雅、黄迎波、张红梅、工哲、朱金国、粟智平、彭梓、严珺。rrKaeerkAca-
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1范围
葡萄细菌性疫病菌检疫鉴定方法GB/T40135—2021
本文件规定了葡尚细菌性疫病菌的分离培养、免疫学及分子生物学等检测鉴定方法，本文件适用于前萄及其繁殖材料中葡萄细菌性疫病菌的检疫和鉴定。规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款，其中，注日期的引用文件，仅该期对应的版本适用于本文件：不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682
分析实验空用水规格和试验方法SN/T 2122
进出境植物及植物产品检疫抽样方法3术语和定义
不文作没有需要界定的术语和定义4葡萄细菌性疫病菌分类信息
中文名：葡萄细菌性疫病菌、葡萄嗒木质菌学名：Xylophilusanpelinus（Panagopoulos）Willemsetal.,l97异名：XanthononasampelinaPanagopoulos,1969英文名：cankerofgrapevine.bacterialblightofgrapevine分类地位：细菌（Bactcria），真细菌（Euhactcria）.变形菌门（Protcobacteria），变形菌纲（Bctapro-teobacteria），伯克霍尔德氏菌月（Burkholdcriales）·丛毛单胞菌科（Comamonarlaccar），嗜木质菌属(Xvtophitus)
其他信息见附录A。
5方法原理
根据葡萄细菌性疫病菌与抗休之间特异性反应，对待测物进行免疫学检测：根据葡萄细菌性疫病菌的特异性DVA序列逊行分子生物学检测；根据葡菊细菌性疫病菌的培养性状、生物学特性以及危害症状等对病原菌进行分离培养，必要时进行致病性检测6试剂、材料和培养基
6.1试剂和材料
除有说听外，所有试验用试剂均为分析纯或生化试剂1
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GB/T40135—2021
试剂：75%酒精、葡萄糖、琼脂糖、无菌双蒸水、1二烷基硫酸钠（SIDS）、三氯甲烷、异戊醇、苯酚、异丙醇、无水乙醇、蛋白酶K、核酸染料、DNA分了质量标准物、50×TAE电泳缓冲液。试剂及其配制的信息见附录B。
材料：植物基因组提取试剂盒、细菌基因组提取试剂盒、普道PCR反应试剂盒、荧光PCR反应试剂盒等。
6.2培养基
YPGA培养基、营养琼脂培养基（NA).培养基及具制备的信息见附录C。分离培养基推荐用YPGA也可用 NA代替。
7仪器和用具
7.1仪器
生物显微镜（放大倍数400倍以上）、恒温培养箱、电子大平（T分之一）、植物光照培养箱、冰箱、离心机、酶标仪、电泳仪、PCR扩增仪、实时荧光定量PCR仪等。7.2用具
可调移液器（2.5μl.[0l,20ml,100ml1000μl）吸头、离心管等。8检疫鉴定方法
现场取样
参照附录A中的症状描述观紧藤萃（图A.1)和叶片（图A,2)是否有葡菊细菌性疫病菌的典型症状。对现场发现上述类似症状的植株逆行取样。果实和植株取样方法按照SV/T2122。8.2样品处理
实验空用水应满足GB/T6682要求：根据后续试验的需求可选择儿菌水或不同的抽提缓冲液做适当的稀释。
8.2.1有症状植物材料
样品中包括多个植物纽织或多个样品，应选择具有典型症状的梢物红织分别分离病原菌，幼苗和藤茎、叶片的分离如下：
a）幼苗和藤茎：取葡菊幼苗或藤茎，将衣皮或其他腐烂组织去除后,用无菌刀具取病健交界部位的维管束组织0.5cmlcm数段放人3ml5ml无菌水或无菌磷酸盐缓冲液巾静置10min~15 min得到抽提液。
也取长约5cm的幼苗或藤茎用白来水冲洗后迅速浸人75%的酒精约1min，然后用无菌刀具将两端部分及坏死的病变组织移除.再将剩余部分没人75兴的酒精后并使之燃烧（此部分仅适用丁病原菌的分离）。待幼苗上的酒精烧尽后放人儿菌塑料袋中，儿菌塑料袋中按无菌水：植物组织=6：1比例加人无菌蒸馏水，并挂打挤压幼苗：将此抽提液案温下轻轻搅动放置40min60min.或5℃静置16h，1000g离心5min备用。b）叶片：用白来水清洗「净样品，再用5%的酒精表面消毒并迅速用无菌水漂洗：无菌刀具截病健交界部位的叫脉和-伪搞碎片置于无菌水或无菌磷酸缓冲液中，静置10min~~15mir-riKacerKAca-
得到轴提液
GB/T40135—2021
从幼苗和茎、叶片中得到的抽提液应即提即用，长期保存需在抽提液中加入无菌甘油（分析纯）无菌甘油占总体积的20%～30%（休积分数），一20℃保存。8.2.2无症状植物材料
无症状植物材料按照随机抽取的原则，按照8.2.1方法获取抽提液也可将藤茎切成lcm～2cm长的小段置于10ml.～15ml.无菌磷酸缓冲液中.或用50ml.无菌注射器吸取收集藤茎汁液约2 ml.置于无菌磷酸缓冲液中各用。抽提液应即提即用。长期保存需在抽提液中加人无菌甘油（分析纯），无菌甘油占总体积的20%一30%（体积分数），一20℃保存：8.2.3葡萄果实
葡萄果实用白米水冲洗后迅速没入75%的酒精约1min，无菌操作去皮后置于无菌培养而或无菌均质袋中，捣碎或均质后取葡菊江液作为抽提液备用：抽提液应即提即用。长期保存需作抽提液中加人菌甘油（分析纯），无菌甘油占总体积的20%～30%（体积分数），一20℃保存。8.3免疫学检测
采用ELISA方法行检测，按照说明书迹行操作及结果判定分子生物学检测
8.4.1模板制备
从8.2中得到的抽提液，按照附录D中的D.1提取总DNA作为分了生物学检测反应模板。对于分离培养得到的疑似菌株，可直接作为分子生物学检测反应模板：根据实验室条件，可选择下列仆一方法(8.4.2或8.4.3)进行检测
8.4.2普通PCR和巢式PCR
从抽提液或其他分离物中提取的DNA作为模板，进行普通PCR和巢式PCR检测。检测步骤和条件按照D.2进行，
8.4.3实时荧光PCR
从抽提液或其他分离物中提取的INA作为模板·进行实时荧光PCR检测，检测步骤和条件接照D.3进行。
8.5病原菌分离
8.5.1有症状植物材料
取8.2.1中得到的液体直接涂布于YPGA平板，每个样品涂布5个～10个平m。25℃下培养，从第大起每大观察平板上菌落生长情况，典型菌落作培养基上生长慢，光滑不黏稠，有光泽，微凸，淡黄色，圆形，边缘整齐规则，培养7d~12d后大小约2mm：必要时可对菌落迹行一次纯化培养8.5.2无症状植物材料
取8.2.2中得到的液体1.0mL，用无菌水或磷酸缓冲液进行10倍、100倍1000倍稀释各取200L3
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GB/T40135—2021
稀释液用于YPGA平板涂布分离.每个稀释度涂布5个~10个平mL。培养方法同8.5.1。8.6致病性检测
必要时，可进行致病性测定，
致病性实验在盆易感图葡节藤落或新托插幼苗上进行，将在YPGA境养基上新鲜培养的疑似菌收集后用无菌水制成约1×10\CF/ml的菌态液，在幼苗腰茎上用无菌刀其切开2cm~4cm长并白送维管束深的新鲜伤口，将1滴2滴菌悬液接种到伤口上，或叶片新藓伤口上，用无菌水湿的火菌棉覆盖伤口并用锡箔纸包扎5个~10个重复。同法用葡菊细菌性疫病菌标准菌株做阳性对照：用元菌水做阴性对照至少2个重复，接种后的葡菊幼苗置丁20℃～27℃，日照时问为14h-18h、水分肥料充足的环境中培养3周4周。致病性实验也可在试管内已生根的易感菌葡菊藤茎上进行，将在YPGA培养基上新鲜培养的疑似菌收集后用无菌水制成药1入10*CFL/mL的菌悬液，用无菌刀具将葡蒂藤茎的最顶端切除后，将1滴菌忌液接种到伤口「，用无菌水熊湿的灭菌棉覆盖伤口并用锡箔纸包扎，5个~[0个重复。同法用葡萄细菌性疫病菌标准菌株做阳性对照，用无菌水做阴性对照.至少2个重复。接种后的葡萄幼苗置于20～27℃.1照吋间为4h～18h潮混的坏境中培养3周1周。9结果判定
有典型症状的植物组织
对样品抽提液或疑似菌株按照8.3和8.4进行检测，两种方法检测结果均为阳性的川判定为检出葡萄细菌性疫病菌：两种法检测结果哟为阴性的可判定为未检出葡萄细菌性疫病菌；检测结果中只有个结果为阳性的，进行病原菌分离.分离得到典型或疑似菌株，经8.3或8.4任一方法（与初筛检测出阳性结果不同的方法)进行检测，结果为阳性的即判定为检出葡萄细菌性疫病菌，木分离到典型或疑似菌株，或菌株鉴定结果为阴性的判定为未检出葡萄细菌性疫病菌。9.2无典型症状的植物组织
对样品抽提液采用8.3和8.4方法进行检测筛选，筛选结果有二个阳性结果或两个均为阳性结果，进行病原菌分离，分离得到典型或疑似菌落按照8.3和8.1进行检测，必要时结合致病性实验结果.出现2个性结果则可判定检出葡萄细菌性疫病菌；两个均为阴性结果的可判定末检出葡萄细菌性疫病菌；结果有一个即性的，可采用8.1中与检测出即性结果不同的PR方法或结合致病性实验进行进一步鉴定，进一步鉴定结果为阴性的可判定末检出葡萄细菌性疫病菌，按8.3和8.4方法筛选结果均为阴性的可判定木检出葡萄细菌性疫病菌。未分离到典型或疑似菌落的.可判定出木检出葡萄细菌性疫病菌。样品保存
检出葡菊纠菌性疫病菌的样品经登记和经于人签字后爱善保存6个月以上。保存期满后应经高压灭菌后方可处理。
11菌种保存
分离并最终鉴定为葡菊细菌性疫病菌的菌株转接到YPGA培养基试管斜面上，登记和经于人签字后置丁4℃冰箱中保存，30d转接一次。也川将菌株冻十保存iiKaeerkAca-
A.1分布
附录A
（资料性）
葡萄细菌性疫病菌
GB/T40135—2021
该病菌日前分布在：南非、突尼斯、日本、土耳其、奥地利、比利时、保加利业、法国、希腊、意大利、摩尔多瓦、荷兰、葡菊牙、塞尔维亚、斯洛文尼亚、四班牙、瑞土、联合工国（英国）、阿根廷、乌拉圭A.2寄主
白然寄主：葡蒂（VitiswiniferaLinn.)是目前知道的H唯一宿主A.3发病特征
每年春手至6月在葡萄树「就可以观察到症状，12cm～30cm长的赚条1，下方2或3节常先发病，然后逐渐向1扩展，初期出现红褐色的条斑，从滕条的茎部向顶端扩展，并逐渐发展成透镜状的元裂或溃疡.有时深达木髓，藤条最后萎焉、干枯（见图A.1）。在-些幼嫩的枝条上变色较少，整个枝条死，发病枝条较短，使葡简出现矮化现象：落秆横切而上，组织呈祸色：主枝、分枝发病和枝梢产牛的症状一样，在叶上病菌经山叶柄、维管束侵入叶片，叶片常常枯死（见图A.2），另外病菌山气孔占接侵梁叶片，这种侵染类型使叶片上生红褐色的角斑。病菌从气孔侵染时，变成红褐色。温度较高时，病叶「可以看到淡黄色菌依流出。花受到感染后，成熟前变黑和枯死。病原菌也能侵染葡萄的根，无论是嫁接植株还是自身店术上的植株，都会使枝梢牛长减慢。葡尚细菌性疫病因的生活周期至今没有完全阐明，初侵染主要发牛在1～2年牛的枝条上，经过叶片、花和果实侵人植株，病原菌随者植株传播·尤其是在潮湿的有风的大气就史容易传播，然后在初夏季节扩散到其他新芽。病害发生需要温暖、潮湿的条件。
Shootsymptoms
图A.1葡萄细菌性疫病在葡萄嫩苗上的危害状5
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GB/T40135—2021
A.4病菌生物学特性
图A,2葡萄细菌性疫病在葡萄叶片上的危害状菌体杆状极端具1根鞭毛，大小0.4mm0.8mm，革兰民阴性菌：在YPGA培养基上，菌落光滑不黏稠.黄色，圆形，边缘整齐规则：在适当的培养基上25℃条件下培养7d12d菌落最大直径约2mm。
A.5传播方式
病原菌可以很容易地通过修剪工具传播，并主要通过修剪的伤口侵人健康组织。病菌可以作术材中存活，因此，可以道过带病插条在各个温间传播：喷灌则有利于病菌传播。用来防治葡根瘤蚜的灌溉水也可能传播病菌。
病菌主要通过带菌的繁殖材料进行远距离传播，白然的传播仅局限于萄园内及周围区域6
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附录B
（资料性）
B.1磷酸缓冲液(0.01mol/L)(PBS0.01mol/L）剂
GB/T40135—2021
氯化钠8.0g，十二水磷酸氢二钠2.7g：二水磷酸二氢钠0.1g,蒸馅水1000ml.(pH7.2)。加热煮沸后分装：121℃火菌15min备用。B.2TE缓冲液
10 mmol/L. Tris-HCl.pH8.0
1 mmol/I.EDTA,pH8.0
B.3TAE电泳缓冲液（pH8.5)(50×）Tris
Na.EDTA·2H.O
B.410%十二烷基硫酸钠（SIS)
川热至68℃溶解，定容至1000mL-rrKaeerKAca-
冰乙酸
蒸馏水
蒸馏水
GB/T40135—2021
C.1YPGA培养基
附录C
（资料性）
培养基
醇母没出粉5.0g，际蛋白陈5.0g,D(-)葡萄糖[0.0g，琼脂粉15.0g将上述成分加入1000mL蒸水中，加热煮沸至完全溶解，分装后121℃火菌15min备用(plI6.57.0)
NA培养基
牛肉没宫3.0g，蛋白陈5.0g.Nac15.0g.琼脂粉15.0g。将上述成分加入1000mL蒸馏水中，加热点沸至完全溶解，分装后121℃火菌15min备用(p1I7.3±0.1)
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