GB/T 18642-2021.Diagnostic techniques for Trichinella spp.
1范围
GB/T 18642规定了家畜(猪、马和犬属动物)和野生动物旋毛虫病原学诊断、酶联免疫吸附试验(ELISA)、荧光免疫层析试纸卡多重聚合酶链式反应(多重PCR)检测方法的技术要求和操作规范。
GB/T 18642适用于猪产地检疫、屠宰加工、流行病学调查和进出口检验检疫,以及其他动物及其肉类的旋毛虫诊断。所列方法包括病原学、血清学及分子生物学诊断,其中:
压片镜检法及集样消化法适用于猪及其他动物胴体的旋毛虫诊断;
ELISA及荧光免疫层析试纸卡方法适用于猪及其他动物活体及胴体的旋毛虫筛查;
多重PCR方法适用于旋毛虫分离株种属及基因型的鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
集样消化 pooled digestion
混合多个动物肌肉样本,在一定温度和pH值条件下,用一定浓度的胃蛋白酶溶液,溶解其肌细胞。
3.2
排泄分泌物 excretory-secretory products
旋毛虫通过表皮分泌或通过消化道排出的各种分子产物。
3.3
包囊 cysts
旋毛虫侵人宿主肌细胞后,在虫体周围形成的由胶原纤维构成的、逃避宿主免疫攻击的囊壁。
3.4.
肌幼虫 muscle larvae
寄生于宿主肌细胞时期的旋毛虫幼虫。

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18642—2021
代替GB/T18642—2002
旋毛虫诊断技术
Diagnostic techniques for Trichinella spp.2021-04-30发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-11-01实施
规范性引用文件
术语和定义
4缩咯语
压片镜检法
集样消化法
酶联免疫吸附试验法（ELISA法）荧光免疫层析试纸卡法
多重聚合酶链式反应法（多重PCR法）10综合判定
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（资料性附录）
附录D（规范性附录）
附录E（规范性附录）
附录F（资料性附录)
附录G（规范性附录）
参考文献
压片镜检法溶液配制及定示意图消化液配制.
旋毛虫集样消化法流程图
酶联免疫吸附试验用溶液配制
荧光免疫层析试纸卡试验用溶液配制荧光免疫层析试纸卡结构及判定示意图多重PCR法用溶液配制
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GB/T18642-—2021
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草：GB/T18642-—2021
本标准代替GB/T186422002《猪旋毛虫病诊断技术》，与GB/T186422002朴比，除编辑性修
改外主要技术变化如下：
增川了规范性引用文件（见第2章）；增加了术语和定义（见第3章)；增加了缩略语（见第4章）；
增加了酶联免疫吸附试验(ELISA)诊断方法、酶联免疫吸附试验用溶液的配制（见第7章、附录D)；
增加了荧光免疫层析试纸卡诊断方法、荧光免疫层析试纸卡试验用溶液配制、荧光免疫层析试纸卡结构及判定示意图（见第8章、附录E和附录F）：增加了用丁旋毛虫虫种鉴定的多重聚合酶链式反应（多重PCR)诊断方法、多重PCR法用溶液配制（见第9章、附录G)：
增加了综合判定（见第10章）；增加了压片镜检法溶液配制及判定示意图（见附录A）增加了消化液的配制(见附录B)；增加了旋毛虫集样消化法流程图（见附录C）请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口本标准起节单位：吉林大学、中国动物卫牛与流行病学中心、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所。
本标准要起草人：刘明远、刘晓雷、工媛媛、吴秀萍、董雅琴、白雪、工学林、唐斌、杨男、丁静本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18642—2002
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GB/T18642—2021
旋毛虫（Trichinellaspp.）由英国学者JamesPanesPagel于1835年苔次在伦敦人尸体内发现，同年RichardOwen把该病原定名为Trichinellasbiralis。口前，旋毛虫经种属鉴定已发现9个种及3个尚未明确的基因型。旋毛虫是一种危害严重的人兽共患寄生虫病，可感染人和150多种动物，主要通过生食或半生食寄生有活旋毛虫的肉类（如猪肉、马肉、犬肉及野生动物肉等）而引发。人旋毛虫病（HumanTrichincllosis）的潜伏期长达2周4周，死广率2%~～30%。该病被世界动物卫生组织（WorldOrganizationforAnimalHealth，OIE)列为居宰动物（儿其是猪、马）强制性必检病种，是目前世界范围内投人控制费用最高的人兽共患病。我国《一、二、三类动物疫病病种名录》将其列为二类动物疫病。
本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断试验和疫苗标准于川》2017版（ManualofDiagnosticTcstsandVaccinesforTcrrcstrialAnimals，20l7），国际旋毛虫病委员会（lnternationalCommissiononTrichincllosis，IcT)《血清学试验检测动物和人体旋毛虫感染的建议》2018版（Recommcndationsonthc use of serological tests for the detection of Trichinella infection in animals and humans,2ol8)和《旋毛虫肌幼虫基因分型建议》2o18版（RecommcndationsforgcnotypingTrichinellamusclcstagclarvac.2018)相关国际标准。血清学诊断增加了酶联免疫吸附试验（EILISA）和荧光免疫层析试纸卡两种技术，而清学诊断技术判定为旋毛虫感染闻性或凝似阳性的样本可进一步通过消化法确证：分了生物学诊断增加了多重聚合酶链反应（多重PCR)技术-iiKacerkAca
1范围
旋毛虫诊断技术
GB/T18642-—2021
本标准规定了家畜（猪、马和犬属动物）和野牛动物旋毛虫病原学诊断、酶联免疫吸附试验（ELISA），荧光免疫层析试纸卡、多重聚合酶链式反应（多重PCR）检测方法的技术要求和操作舰范本标准适用于猪产地检疫、屠宰加工、流行病学调查和进出口检验检疫，以及其他动物及其肉类的旋毛虫诊断。所列方法包括病原学、血清学及分子生物学诊断，其中：压片镜检法及集样消化法适用于猪及其他动物体的旋毛虫诊断：ELISA及荧光免疫层析试纸卡方法适用丁猪及H他动物活体及响体的旋毛虫筛查；多重PCR方法适用丁旋毛虫分离株种属及基因型的鉴定，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
集样消化pooleddigestion
混合多个动物肌肉样本，在定温度和pH估条件下，用定浓度的胃蛋广酶溶液，溶解其肌细胞。3.2
排泄分泌物excretory-secretoryproducts旋毛虫通过表皮分泌或通过消化道排出的各种分了产物。3.3
包囊cysts
旋毛虫侵人宿主肌细胞后，在虫体周围形成的由胶原纤维构成的、逃避宿主免疫攻击的囊壁：3.4
肌幼虫
musclelarvae
寄牛子宿王肌细胞时期的旋毛虫幼虫。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DMEM：杜氏改良仆格尔培养基（Dulbecco'smodifiedEaglemedium）EDC：1-（3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺1-（3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodimide」ELISA：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay）1
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GB/T18642—2021
HEPES：4-羟乙基哌嗪乙磺酸[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacidIL-ESP：肠道期幼虫排泄分泌物（intestinallarvac-cxcrctory/sccretoryproducts）MES：2-吗咻乙磺酸（2-morpholinocthancsulfonicacid）Ml-EsP：肌幼虫排泄分泌物（muscle:larvac-cxcrctory/sccrctoryproducts）NHS：N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide）PBS：磷酸盐缓冲液（phosphatebulleredsalinebuffer)）SD：标准差（standard deviation）5压片镜检法
5.1器材
5.1.1正置生物显微镜。
5.1.2手术剪、子。
5.1.3夹压玻璃板。
5.1.4微量可调移液器（200L）。5.2试剂
盐酸溶液，见附录A的A.1。
5.2.2本标准所有试验用水均应符合GB/T6682中一级水标准。5.3操作方法
样本采集
从完整响体两侧的横隔膜肌脚部各采样一块，比为一份肉样，其质量不少手50，编享与服体享码相同。不完整躺体，可从肋间肌、腰肌、咬肌、舌肌采样。5.3.2
2样本处理
剥刹离脂肪和结缔组织，用剪刀顺肌纤维方向，按随机采样的要求，从样本上至少剪取28粒熊麦粒（2mm×10mm）大小的肉样，将肉样均勾地放置在夹压玻璃板上，排成一排，每个夹压玻璃板可放置16粒
5.3.3压片
将另一夹压玻璃板重叠在放有肉样的玻璃板上，并旋动螺丝，加压使肉粒压成半透明薄片。5.3.4镜检
将制好的压片放在低倍显镜下（放大倍数4×10），从压片一端边沿开始观察：直到另一端为止，不清晰处，可在10×10的放大倍数下进一步观察5.4结果判定
5.4.1肌细胞内有圆形或椭圆形包囊，且包囊中央有蜷曲的虫体，判定为形成包囊的旋毛虫。旋毛虫包囊镜下判定示意图见图A.1。
5.4.2肌细胞内有旱直杆状或略蟋曲状态虫体，判定为无包囊的旋毛虫。无包囊旋毛虫镜下判定示意图见图A.2。
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GB/T18642-—2021
发现数量不等、浓淡不均的黑色钙化物，可开启夹压玻片，加入少许10%的盐酸溶液，静置1mim~2min后，再行观察，结果判定同5.4.1和5.4.2。5.4.4
发现形成包的旋毛虫和无包囊的旋毛虫均判定为旋毛虫感染。集样消化法
手术剪。
不锈钢筛网（筛孔直径180μm）潇斗。
分液漏斗。
烧杯（1L和3L)
离心管（50mL）
电动刀式绞肉机或碎肉机（孔径3mm）。温度计。
磁力搅拌器和转子。
恒温培养箱。
倒置显微镜。
培养血(带标尺)
盐酸水溶液，见附录B的B.1。
消化液，见B.2.
操作流程
操作流程见附录（的图（C.1。
操作方法
样本采集
采集部位
猪主要采集隔肌脚和否肌，其他动物采集部位见衣「，表1
宿主种类
海洋哺乳动物
（海豹、海象）
其他野牛肉食动物
不同被检宿主可选择的肌肉样本主要选择的肌肉
膈肌、舌肌
咬肌、舌肌
脂肌、咬肌、占肌
弱肌、排肠肌、舌肌
隔肌、咬肌、舌肌
隔肌、否肌、鳍肌
咬肌、助间肌
舌肌、排肠肌
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检测质量/g
GB/T18642—2021
6.4.1.2样本数量
每只动物可来集100g肌肉组织样本，或将数只动物肌肉样本混合为100g（混合动物数量30个），生食或半生食肉类习俗以及旋毛出病高发地区.混合动物数量20个，6.4.2样本处理
刺离脂肪和结缔组织，与100g肉样同等体积的盐酸水溶液（13.1)混合，用刀式电动绞肉机短时问（55~~10s）绞碎10次～20次或用碎肉机搅碎，至样本无可见细碎块为止6.4.3样本消化
6.4.3.1将搅碎样本取出，放人3L烧杯中，用预热的45℃士2℃消化液冲洗绞肉机或碎肉机中残留样本，并用预热的消化液补足至2L（即每克样本加入20mL消化液）。6.4.3.2用锡箔纸覆盖烧杯防止落液飞溅，置于川热磁力搅拌器上（烧杯内放人磁力搅拌转子），或置于普通搅拌器并将搅拌器放入45℃2℃恒温培养箱中，持续加热搅拌30min~60min（可根据实际情况适当延长或缩减时间），至消化液中无肉眼可见碎肉为止：6.4.4样本过滤
6.4.4.1取不锈钢筛网（筛孔古径180m），放置于漏斗上方，漏斗下方接一分液漏斗，消化完成后5min内将样本混悬液倒人筛网。6.4.4.2过滤后的烧杯和筛网用至少100mL的温水（37℃）冲洗，以确保筛网上没有虫体残留（充许有留少量不易消化的脂肪和结缔组织)。6.4.4.3若筛网上有碎肉残渣.则需将碎肉残渣重新消化。6.4.5样本沉淀及漂洗
6.4.5.1将滤液在分离漏斗中沉淀30min，使旋毛虫沉到底部，此时完全开启漏斗开关，将底部混悬液（约40mL）移人50mL的离心管中。6.4.5.2将离心管中的混悬液静置10min，弃去部分上清液，保留10mL底部混芯液6.4.5.3如底部混悬液仍较为混浊，则向底部混悬液中加人30ml温水（37℃），重复6.3.5.2，直至底部混悬液清。
6.4.6镜检
将滤清的沉淀物倒人有标尺的培养Ⅲ中，在倒置显微镜（放大倍数4×10或10×10）下观察有无虫体和钙化包粪。
6.5结果判定
结果判定如下：
一显微镜下发现旋毛虫或钙化包接，可确诊为旋毛虫感染，一混合样本为阳性时·需对每个样本进行单独消化镜检，以最终确定感染动物个体，7酶联免疫吸附试验法（ELISA法）7.1器材
7.1.1于术剪：
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不锈钢筛网（筛孔直径180m）。7.1.3
漏斗。
分液漏斗。
烧杯（1L和5)。
离心管（15mL和50mL)。
注射器（10mL）。
电动刀式绞肉机或碎肉机（孔径3mm）。温度计。
磁力搅拌器和转子。
恒温培养箱。
显微镜。
次性针头滤器（0.22m）
细胞培养箱：
超滤管或透析袋（截留分子质量5000Da），酶标板（48孔或96孔）。
微量可调移液器（2.5u、10μ、100u、200μ、1000μ等不同规格）。培养Ⅲ（带筛网，网孔古径180um）：7.2试剂
培养液，见附录D的D.1
青素、链霉素。下载标准就来标准下载网
0.01mol/1.磷酸盐缓冲液（PBS），见D.2。包被缓冲液：超纯水。
洗涤缓冲液，见D.3。
过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白-酶结合物，见D.4。显色液，见D.5。
终止液，见D.6。
实验动物
Wistar大鼠，体重200g土20g。
7.4操作方法
7.4.1旋毛虫收集
GB/T18642-—2021
将人工感染旋毛虫的Wistar大鼠去除皮肤、内脏、脂肪和结缔组织后，按照6.4.2~6.4.5所列方法，收集旋毛虫肌幼虫。
7.4.2旋毛虫抗原制备
7.4.2.1旋毛虫肌幼虫排泄分泌物（ML-ESP)抗原制备7.4.2.1.1将收集的旋毛虫肌幼虫用含有青霉素（500U/mL）和链霉索（500U/mL）的培养液洗涤三次（每次静晋20min）
7.4.2.1.2将其放人含青霉素（250U/mL）和链霉素（250U/mL）的培养液中（密度为5000条/mL），37℃，10%二氧化碳，培养18h，收集上清液。5
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GB/T18642—2021
7.4.2.1.3用一次性针头过滤器滤掉残留的肌幼虫及碎片后，用PB3S通过超滤管或透析袋透析，去除分子质量小于3000Da的蛋白，将回收得到的旋毛虫ML-ESP抗原（终浓度为1000ug/mL，吸光度280/260>0.1)保存于70℃备用。
7.4.2.1.4培养过程中应保证培养基术被细菌、真菌等污染：7.4.2.1.5具体可参见ICT《旋毛虫血清学诊断方法》（2018版）。7.4.2.2旋毛虫肠道期幼虫排泄分泌物（IL-ESP)抗原制备7.4.2.2.1将收集的旋毛虫肌幼虫经感染Wistar大鼠（8000条/只），6h后将大鼠处死，并立即取出小肠。用装有磷酸盐缓冲液(PBS)的注射器清洗小肠，纵向剖开，并切割成1cm2cm的碎片.置于筛网上，将筛网浸人含有培养液的培养血市，37C孵育h。7.4.2.2.2将培养Ⅲ底部的虫体收集到15mL离心管中，用含有青等系（500U/mL）和链等素（500U/mL）的培养液洗涤3次，每次洗涤后2000g离心10min。将收集到的虫体按照7.4.2.1.2~7.4.2.1.4所列方法·制备IL-ESP抗原。
7.4.3抗原包被
用包被缓冲液分别将旋毛虫ML-ESP及II-ESP抗原稀释至浓度为10uμg/mL,将两种抗原按1：1比例充分混合（工作浓度均为5uμg/mL)后，每孔加人100叫L，封板膜密封后置入37℃恒温箱孵育60min或名4℃恒温箱过夜
7.4.4洗涤
揭掉封板膜，充去孔内包被液，在吸水纸上拍十或吹风筒吹十。每孔加满洗涤缓冲液，静置30s后弃长洗涤液，重复洗涤三次，拍干或吹干。7.4.5加样
7.4.5.1分别设空户对照孔、阳性对照孔、阴性对照孔和待测样本孔，每份样本各设3孔：7.4.5.2用洗涤缓冲液将待测血清稀释至工作浓度（1：50），加人待测样本孔中，每孔100ul；阳性而清和阴性血清按照同样比例稀释至工作浓度并分别加人阳性和阴性对照孔，加样量均为100μL；空白对照孔加100pL洗涤液。
7.4.5.3用封板膜密均后放置究温孵介30min。阴性对照血消和阳性对照血清来源见D.7。7.4.6加过氧化物酶标记的抗免疫球蛋白-酶结合物7.4.6.1弃去液体，重复洗涤三次，方法同7.4.4。检测猪、马、犬、熊等动物血清样本应使用相应动物种类的过氨化物酶标记的抗免疫球蛋白酶结合物。7.4.6.2用洗涤缓冲液将抗免疫球蛋白-酶结合物稀释至T作浓度（1：5000~1：10000或按照试剂的操作说明），每孔加人100uL，放置室温孵育30min。7.4.7、显色
弃去液体，重复洗涤二次，方法同7.4.4，最后用蒸馅水再洗涤一次。每孔加人100ml显色液，室温避光孵育5min15min后，加人100μL终止液，终止反应。7.4.8读数
加人终止液后10min内，道过酶标仪检测各孔在波长450nm处的光吸收值（OD值）。6
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计算方法
GB/T 18642-—2021
计算出每份待测样本的平均OD告满值（P)和同板阴性参考血清的平均（OD性值（N），用OD)测除以OD性，计算山每份待测样本的P/N值。5试验成立条件
若空白对照孔OD值小丁0.1,阳性参考血清OD值在1.02SD范围，ⅡP/V值大于4,则试验成立，结果有效。
7.7结果判定
待测样本的P/N估4，判定该样本为旋毛虫感染阳性血清：若3P/N值~4，则判定该样本为疑似旋毛虫感染血清。
8荧光免疫层析试纸卡法
8.1器材
温箱。
电了天平
台式冷冻离心机。
pH计。
试纸喷膜仪。
试纸条切割机。
超声波细胞粉碎机。
水平摇床。
手持紫外灯。
微量可调移液器（2.5μ10μL、100μ2001000等不同规格）。试剂
时间分辨荧光微球（1%避光）。山羊抗猪 IgG。
兔抗山羊IgG。
硝酸纤维素索膜。
PVC荧光专用底板。
玻璃纤维素膜。
吸水纸。
0.05mol/L.PBS缓冲液，见附录E的E.1。0.01mol/LPBS缓冲液，见D.2。
0.05mol/L2-吗演酸（MES)溶液，见E.2N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)
1-（3-二中氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺（EDC）
0.1mol/1.甘氨酸溶液，见E.3。偶联储存液，见E.4
样本稀释液，见E.5。
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GB/T18642—2021
8.3荧光免疫层析试纸卡组装
8.3.1旋毛虫抗原制备
方法同7.4.2.用0.01mol/1.PBS缓冲液分别将旋毛虫MI-ESP及IL-ESP抗原稀释至2mg/mL，将两种抗原按1：1比例充分混合（工作浓度均为「mg/mL）。8.3.2时间分辨荧光微球偶联山羊抗猪1gG8.3.2.1100L时间分辨荧光微球，加入500LMES溶液。8.3.2.2加入3mg的EDC和NHS，混勾，室温孵育1h。加入40μL的5mg/mL山羊抗猪Ig(G0.01lmol/LPBS缓冲液稀释），室温孵育1h。8.3.2.3
加入100μl.的0.1mol/1.甘氨酸溶液，室温孵育30min。8.3.2.4
8.3.2.54℃.8100g离心15min，弃上清液。8.3.2.6加入8000L偶联储存液重悬。8.3.2.74℃超卢分散1min，4℃条件下避光保存。8.3.3荧光免疫层析试纸条的组装8.3.3.1结合垫的制备
将含有偶联抗体的荧光微球用试纸喷膜仪喷涂至300mm×5mm玻璃纤维素膜上，喷涂量为50μL/cm.4℃真空抽干，于4c干燥保存备用。8.3.3.2检测线和对照线的制备
8.3.3.2.1用浓度为1mg/mL旋毛虫ES混合抗原和0.625mg/ml兔抗山羊IgG(0.01mol/lPBS缓冲液稀释）分别作为检测线和对照线试剂8.3.3.2.2用试纸喷膜仪将两种试剂分别点在俏酸纤维素膜上，点样量为1μL/cm。37℃干燥2h，4℃密封保存备用。
8.3.3.3试纸卡的组装
按附录F的图F.1示意图所示，将底板、样本垫、结合垫、吸水垫、硝酸纤维素膜粘在一起，并用试纸条切割机将其切成3.5mm宽的试纸条，将试纸条放入试纸卡中，将试纸卡放入含有干燥剂的密封袋内，密封后于4℃保存备用。
8.4样本检测
8.4.1分别用样本稀释液将阳性血清、阴性血清和待检血清样本稀释20倍，即向95uL稀释液中加入5uL血清.用移液器混匀，
8.4.2将试纸卡平放于操作台间.加样孔朝上向加样孔中加入100L稀释后的而清样本，室温静5min～10min。用紫外灯照射试纸卡观察结果，8.5试验成立条件
结果判定应在加样后20min内进行。试验成立条件如下：若阳性血清样本的对照线和检测线均显色，阴性血清仅对照线显色而检测线不显色，则试验成：
一若对照线不显色，则检测无效，应更换试纸卡重新检测。8
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