GB/T 40049-2021.PCR detection method of chicken salmonella enteritis.
1范围
GB/T 40049规定了鸡肠炎沙门氏菌分子分型的PCR检测方法。
GB/T 40049适用于各种日龄的鸡及其产品中携带的肠炎沙门氏菌的PCR方法检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注H期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 4789.4-2016 食品安 全国家标准食 品微生物学检验沙门氏 菌检验
GB/T6682-2008分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 28642-2012饲料中沙门氏菌的快速检测方法聚 合酶链式反应(PCR)法
NY/T 541-2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
持家基因 house-keeping gene
生物体在生理、病理和不同发育阶段的在所有类型的细胞中都表达的一类基因。这类基因高度保守,基因产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)
PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T40049—2021
鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法
PCR detection method of chicken salmonella enteritis2021-04-30发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-11-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草：本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SC/TC181)归口。GB/T40049—2021免费标准下载网bzxz
本标准起草单位：山东农业大学、青岛农业大学，中国动物卫生与流行病学中心、山东省农业科学院家禽研究所、秦皇岛海关、山东派克检测技术有限公司。本标准主要起草人：常维山、孙淑红、十述柏、翟海华、崔言顺、柴同杰、瀚孜敬、赵效南、王涛、黄兵、宋敏训、马秀丽、高月花、郑德云、郭树源、马洪超、孙杰、张富友。I
rrKaeerkAca-
1范围
鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法
本标准规定了鸡肠炎沙门氏菌分子分型的PCR检测方法。GB/T 40049—2021
不标准适用丁各种日龄的鸡及H产品中携带的肠炎沙门民菌的PCR方法检测。2规范性引用文件
下列文件对丁不文件的应用是必不叫少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版不适用丁本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件GB4789.4一2016食品安全国家标准食品微牛物学检验沙门氏菌检验GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T28612—2012饲料中沙门氏菌的快速检测方法：聚合酶链式反应（PCR）法NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件，3.1
持家基因
house-keeping gene
牛物体在牛理、病理和不同发育阶段的在所有类型的细胞中都表达的类基因。这类基因高度保守，基因产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。4缩略语
下列缩略语适用丁本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（dcoxyribonuclcicacid）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）5试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯。实验用水均符合GB/T6682一2008二级水规定。1LB液体培养基（配制方法见附录A中A.1)，5.1
缓冲蛋白陈水（BPW）前增菌液（配制方法见A.2）5.2
亚硒酸盐胱氨酸（SC)增菌液（配制方法见A.3）。5.4四硫磺酸盐煌绿（TTB)增菌液（配制方法见A.4）。5.5
不糖赖氨酸脱氧胆盐（XI.)琼脂D.3（配制方法见A.5）TAE电泳缓冲液（配制方法见A.6)。5.6
阳性、阴性对照：阳性对照为畅炎沙门氏菌标准株（CVCC3377)培养液、鸡白痢沙门氏菌标准株1
-rKaeerkca-
GB/T40049—2021
(CVCC535)培养液：阴性对照为灭菌超纯水。5.8
细菌基因组DNA提取试剂盒：商品化试剂盒：无水乙醇：20℃预冷。
75%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，一20℃预冷。5.11
DNA分子量标记:DNAMarker2000。琼脂糖。
七个持家基因片段的PCR引物序列：参见附录B的B.12×PCRMix.
6仪器
恒温培养箱（温度范围：5℃~50℃，温度均勾度：土1℃）高压火菌锅（火菌温度：105℃～135℃，工作压力：0.35MPa）：电子天平（感量0.001g）。
高速离心机（可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上）二级生物安全柜。
4℃冰箱（温控范用2℃~8℃）；-20℃冰箱6.6
PCR仪
电泳仪(电压90V～120V)。
微量移液器（2uL、20uL、200uL、1000uL）及配套吸头6.10
电泳仪（电压90V120V)。
控温播床（温度范围：5℃50℃，振荡频率：30r/min～300r/min）。凝胶成像仪。
PCR反应管。
1.5ml.带盖离心管。
沙门氏菌分离鉴定
7.1样品采集、储存和运输
组织样品
选择具有典型临床症状的病死鸡，无菌取其肝脏、肿脏等组织样品，放置于无菌容器内，标记好组织名称和采样日期，冷藏运送到实验室进行检测。按照NY/T541一2016中6.2执行。7.1.2
2肠内容物样品
按照NY/T541-2016中6.7.2执行。7.1.3粪便样品
按照NY/T541-2016中6.8.1执行
7.1.4泄殖腔拭子样品
12016中6.8.2执行
按照NY/T541
-rrKaeerKAca-
7.2沙门氏菌分离鉴定
GB/T 40049—2021
按照（GB4789.42016执行，行分离、培养，至生化试验部分，完成似沙门民菌菌株的初步鉴定。
8鸡肠炎沙门氏菌的PCR检测方法8.1细菌基因组DNA提取
将初步鉴定为沙门氏菌的菌株用商品化试剂盒进行基因组DVA提取。提取方法按试剂盒说明书要求进行。
8.2持家基因引物
设计合成七个持家基因的引物。引物DNA序列参见B.1。8.3持家基因PCR扩增
用B.1中所列七对引物对样品基因组DVA的七个持家基因分别进行PCR扩增。具体实验操作符合GB/T28642—2012检测技术要求。50uLPCR反应体系参见B.2.
PCR反应程序.94c5min;94C45s.55C45s，721min.共35个循环；72C7min：4℃保存。
8.4PCR产物电泳
取5pL~10ul.PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（电泳方法参见GB/T28642—2012），电泳结束后,用凝胶成像仪观察结果。
8.5PCR阳性产物测序
将七个持家基因均扩增出特异性条带的PCR产物进行测序。8.6
结果判定
8.6.1试验成立条件
利用B.1规定的七对引物，阳性对照菌株PCR产物电泳后分别出现七条特异性的扩增条带，阴性对照PCR产物无扩增条带，试验结果成立，否则试验不成立。七个持家基因的PCR产物电泳图参见附录 C。
8.6.2肠炎沙门氏菌分子分型判定使用DNA序列分析软件，将-七个持家基因PCR产物DVA序列与附录D所列参考序列分别行一对一比对（部分基因提供了2个～3个参考序列)。8.6.3测序结果判定
七个基因的测序结果与附录1)中所对应的参考序列（或之一）均完全一致（即：所测αro基因序列与D.1.1或T).1.2中序列之完全致、所测dnaN基因序列与D.2.1或D.2.2中序列之完全致、所测hemD基因序列与D.3中序列完全一致、所测hisD基因序列与D.4.1或D.4.2中序列之一完全-riKaeerKAca-
GB/T 400492021
一致，所测purE基因序列与D.5.1或D.5.2中序列之一完全一致、所测sucA基因序列与D.6.1或D.6.2中序列之一完全一致、所测thrA基因序列与D.7.1或D.7.2或D.7.3中序列之一完全一致），则可判定样品为肠炎沙门氏菌阳性。r kaeerkAca
LB液体培养基
胰蛋白陈
酵母提取粉
氯化钠
A.1.2制备
附录A
（规范性附录）
培养基配制
1000mL
将各成分加人水中，搅混均勾.121℃±2℃高压灭菌15min，冷却后备用。BPW前增菌液
蛋白豚
氯化钠
磷酸氢二钠（含12个结晶水）
磷酸二氢钾
1000mL
GB/T40049—2021
将各成分加热溶解于1000ml水中，12l℃=2℃高压灭菌15min，冷却后备用。A.3
SC增菌液
蛋白陈
亚硒酸氢钠
磷酸氧二钠
1-胱氨酸
1000mL
将各成分加热溶解于1000mL蒸留水中，无菌操作分装于火菌三角瓶或试管中备用：当大制备当天使用，无需高压灭菌。
-rrKaeerKAca-
GB/T40049—2021
TTB增菌液
蛋白陈
牛肉粉
氯化钠
碳酸钙
硫代硫酸钠
1050mL
将各成分落解于1050mL蒸增水巾，加热煮沸，临用前川人20%碘液20mL，0.1%煌绿10mL，现配现用。
XLD鉴别培养基
酵母浸粉
1-赖氨酸
柠檬酸铁铵
硫代硫酸钠
氯化钠
苯酚红
pH7.410.2
1000mL
将上述成分川热溶解于1000mL蒸馅水中，冷至50℃左右时，倾入无菌平血，备用A.6
TAE电泳缓冲液
50×TAE电泳缓冲液成分
Tris-乙酸
EDTA(pH 8.0)
40mmol/L
1 mmol/L
-i Kaeerkca
1×TAE电泳缓冲液制备
GB/T 40049—2021
先按A6.1所示成分配制50×TAE电泳缓冲液，将H用蒸馏水50倍稀释即为上作浓度rrKaeerkAca-
GB/T40049—2021
七个持家基因测序引物见表B.1
基因名称
附录B
（资料性附录）
测序引物与反应体系
七个持家基因片段PCR引物序列
引物序列
F 5'-GTCACGGTGATCGATCCGGT-3
R5CACGATATTGATATTAGCCCG-3
F 5'-CCTGGCACCTCGCGCTATAC-3
R 5′- CCACACACGGATCGTGGCG 3'RF 5'-ATGAAATTTACCGTTGAACGTGA-3R5AATTTCTCATTCGAGAGGATTGC3
F 5′-AGCACCGAAGAGAAACGCTG-3R 5-GGTTGTTGATAACGATACGTAC-3F 5° TCGCGTCTGTCGGTCTGTAT 3R5'-GGCGCAGTATAGCCATAGGT-3
F 5′-ATGAGTATTCTGATCACCCG-3R 5-ATCAGCGACCTTAATATCTTGCCA-3F 5'-GACACCTCAAAAGCAGCG3
R 5'-CGAGAACGCAAACTTGCTTC-3
PCR反应体系见表B.2。
2XPCRMix
F上游引物
R下游引物
DNA模板
总体积
PCR扩增反应体系
-KaeerKca-
体积/uL
片段大小
附录C
（资料性附录）
七个持家基因PCR电泳图
肠炎沙门氏菌阳性菌株七个持家基因PCR电泳图见图C.1。2
说明：
4—hemD;
5hisD:
MDNA Marker Trans 2K.
GB/T40049—2021
1 000 bp
500 bp
250 hp
100 hp
阳性对照菌的七个持家基因PCR扩增结果电泳图9
-rKaeerkca-
GB/T40049—2021
D.1aroc 基因
D.1.1 aroC 5/aroC 454
附录D
（资料性附录）
七个持家基因DNA序列
GTTTTTCGTCCGGGACACGCGGATTACACCTATGAGCAGAAATACGGCCTGCGCGATTACCGTGGCGGTGGACGTTCTTCCGCGCGTGAAACCGCGATGCGCGTAGCGGCAGGGGCGATCGCCAAGAAATACCTGGCGGAAAAGTTCGGCATCGAAATCCGCGG(C/T)TGCCTGACCCAGATGGGCGATATTCCGCTGGAGATTAAAGACTGGCGTCAGGTTGAGCTTAATCCGTTCTTTTGTCCCGATGCGGACAAACTTGACGCGCTGGACGAACTGATGCGCGCGCTGAAAAAAGAGGGCGACTCCATCGGCGCGAAAGTGACGGTGATGGCGAGCGGCGTGCCGGCAGGGCTTGGCGAACCGGTTTTTGACCGACTGGATGCGGACATCGCCCATGCGCTGATGAGCATCAATGCGGTGAAAGGCGTGGAGATCGGCGAAGGATTTAACGTGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAATCGCGATGAAATCACGGCGCAGGGTD.1.2 aroC 41
GTTTTTCGTCCGGGACACGCGGATTACACCTATGAGCAGAAATACGGCCTGCGCGATTACCGTGGCGGTGGACGTTCTTCCGCGCGTGAAACCGCGATGCGCGTAGCGGCAGGGGCGATCGCCAAGAAATACCTGGCGGAAAAGTTCGGCATCGAAATCCGCGGCTGCCTGACCCAGATGGGCGACATTCCGCTGGAGATTAAAGACTGGCGTCAGGTTGAGCTTAATCCGTTCTTTTGCCCCGATGCGGACAAACTTCACGCGCTGGACGAACTGATGCGCGCGCTGAAAAAAGAGGGTGACTCCATCGGCGCGAAAGTGACGGTGATGGCGAGCGGCGTGCCGGCAGGGCTTGGCGAACCGGTATTTGACCGACTGGATGCGGACATCGCCCATGCGCTGATGAGCATTAATGCGGTGAAAGGCGTGGAGATCGGCGAAGGATTTAACGTGGTGGCGCTGCGCGGCAGCCAGAATCGCGATGAAATCACGGCGCAGGGTD.2dnaN基因
D.2.1 dnaN2/dnaN494
ATGGAGATGGTCGCGCGCGTTACGCTTTCTCAGCCGCATGAGCCGGGCGCCACTACCGTGCCGGCGCGGAAATTCTTTGATATCTGCCGCGGCCTGCCGGAGGGCGCGGAGATTGCCGTTCAGTTGGAAGGCGATCGGATGCTGGTGCGTTCTGGCCGTAGCCGCTTCTCGCTGTCTACGCTGCCTGCCGCCGATT10
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