GB/T 18643-2021.Diagnostic techniques for Marek's disease.
1范围
GB/T 18643规定了鸡马立克氏病临床诊断,以及病毒分离、琼脂免疫扩散试验、PCR检测和荧光定量PCR检测等实验室检测的技术要求和综合判定。
GB/T 18643适用于鸡马立克氏病的检测、诊断、检疫和流行病学调查等。
2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AGID:琼脂免疫扩散试验( Agar gel immunodiffusion)
AL:禽白血病( Avian leukosis)
CEF :鸡胚成纤维细胞(Chicken embryo fibroblast)
CKC :鸡肾细胞(Chicken kidney cells)
DEF :鸭胚成纤维细胞( Duck embryo fibroblast)
CPE:致细胞病变效应(Cytopathieeffect)
DEF :鸭胚成纤维细胞(Duck embryo fibroblast)
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)
EB:溴化乙锭( Ethidium bromide)
FBS:胎牛血清(Fetal bovine serum)
LL:禽淋巴性白血病(Lymphoid leukosis)
M199 :M199培养基(M199 Medium)
MD:鸡马立克氏病(Marek's disease)
MDV :鸡马立克氏病病毒(Marek's disease virus)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)
PBS :磷酸盐缓冲液( Phosphate- buffered saline buffer)
RE:禽网状内皮组织增生病(Reticularendotheliosis)

ICs11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18643—2021
代替13/T18613—2002
鸡马立克氏病诊断技术
Diagnostic techniques for Marek's disease2021-04-30发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-11-01实施
GB/T18643—2021bZxz.net
临床诊断
病毒分离
琼脂免疫扩散试验检测
6PCR检测
7荧光定量 PCR(q PCR)检测
8综合判定
附录A（规范性附录）病毒分离用溶液配制次
附录B（规范性附录）琼脂免疫扩散试验用溶液配制附录（（规范性附录）PCR检测用引物、反应条件及溶液配制附录D（规范性附录）PCR检测用引物、探针和反应条件-rrKaeerKa-
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。GB/T18643—2021
本标准代替GB/T186432002《鸡马立克氏病诊断技术》。本标准与GB/T186432002相比主要技术变化如下：
修改了鉴别诊断部分的描述（见3.4.2002年版的3.4）；增加了病毒分离检测方法（见第1章,附录A)；增加了PCR检测方法（见第6章,附录B)：增加了炎光定量PCR检测方法(见第7章,附录C)。本标准的修订参考了OIE《陆生动物诊断实验和疫苗标准于》（2017版），并结合国内外技术研究新成果，与国际先进技术保持致请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的贡任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准山全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所、中国动物卫生与流行病学中心。本标主要起草人：刘长军、龚振华、张艳萍、路平、土笑梅、李阳、高玉龙、祁小乐、李凯、土志亮。本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T186432002。
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GB/T18643—2021
鸡马立克民病(Marek's diseaseMD))是一种鸡的高度传染性、以淋巴细胞增生为特征的肿瘤性疾病.出鸡疱疹病毒2型（Gallid herpesvirus 2,GaHV-2)即鸡马立克氏病病（Marek’s cisease virusML)V)引起：ML一般发生丁3周龄以上的禽只，多发生丁12周龄～30周龄：MD川引起多种严重的病症.其中淋巴组织增生是最常见也是最重要的种。经典型MD主要侵害神经组织死亡率很少超过10%～15%，可持续数周至数月。急性型MI)可使发病鸡内脏器官产生淋巴痛，发病率一般为10%-30%，暴发流行时发病率可高达70%。死亡率可能在数周内迅速增加，然后死亡停止，也可能在数月内保持稳定的死率，并逐渐下降。目前，最常见的是产生广泛内脏器官淋巴瘤的急性型M)。MLD)在:临床诊断上容易与鸡的其他肿瘤性疾病,禽白血病(Avian leukosis,AL)和禽网状内皮组织增生病（Reticuloendotheliosis,RE）.发生混淆，-股需要通过流行病学和病理组织学进行鉴别诊断M)可通过活疫苗免疫预防，免疫属于非清除性免疫，不能清除病原，也不能阻止坏境中MI)V野毒的感染和感染鸡排毒。由于MD疫苗普遍应用.以及疫苗的白身特点.临床IMD疫苗毒株的接种和野寺株的感染情况复杂，需要实验空诊断技术巡行确诊。从感染鸡组织中分离MDV可用丁该病的检测，通常选用从抗凝血样中分离的淋巴细胞、肾细胞或细胞态液作为分离病毒用的材料，也可以用羽髓组织浆液作为MIDV分离材料：细胞悬液或羽髓组织浆液可接种鸡肾细胞（Chickcnkidncycells.（KC），鸭胚成纤维细胞（Duck cmhryofibrohlast.DEF)或鸡胚成纤维细胞（Chickenembryolibroblast，CEF）进行病毒分离：应用琼脂免疫扩散试验（Agargelimmunocliffusion.AGID)对羽髓MDV抗原迹行血清学检测，可以确定MDV感染，AGID)是检测抗体最常用的方法，然而由丁MD疫苗毒株也川以刺激机体产生相应的抗体，抗体的检测对丁MD的临床诊断仪具有参考价估，PcR（Polymerasechainreaction，PcR）方法可以用于检测MDVPCR法还可以鉴别MDV而清1型野毒株和疫苗毒株，-iiKaeerkAca
1范围
鸡马立克氏病诊断技术
GB/T 18643—2021
不标准规定了鸡马立克民病临床诊断，以及病再分离、琼脂免疫扩散试验，PCR检测和灭光定量PCR检测等实验室检测的技术要求和综合判定本标准适用于鸡马立克氏病的检测、诊断、检疫和流行病学调查等2缩略语
下列缩略语适用丁本文件。
AGID)：琼脂免疫扩散试验（Agargclimmunodiffusion）AL：禽白血病（Avian leukosis)CEF：鸡胚成纤维细胞（Chickcncmhryofibrohlast）CKC:鸡肾细胞(Chicken kidney cells)DEF：鸭胚成纤维细胞（Duckcmhryofihrohlast）CPE：致细胞病变效应（Cytopaihicelect）DEF：鸭胚成纤维细胞（Duckembryofibroblast）DNA：脱氛核糖核酸（Deoxyribonucleicaci）EB：浪化乙锭（Ethidium bronide)FS:胎牛而t清（Fetalbovinescrum）LL：禽淋巴性白血病（Lymphoidleukosis）M199:M199境养基(M199Medium)
MD：鸡马立克氏病(Marek‘s disease)MDV:鸡马立克氏病病毒(Marek’s disease virus)PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreacion)PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphate-bulferedsalinebuller）RE：禽网状内皮组织增生病（Rcticularcndothcliosis）临床诊断
临床症状
在鸡群中，病鸡临床症状衣现为严重消瘦，瘫痪Ⅱ两腿前后仲展呈“劈叉”姿势，皮肤毛粪结节以及服亡症等。一般可以作为MI)的示病症状,可初步推测为 MI)。2剖检变化
3.2.1内脏型
内脏型MD的病理变化为肝、性腺、脾、肾、肺、前胃及心脏出现广泛的漫性淋巴瘤。青年鸡的肝脏一般中度肿人，们成年鸡吓脏严重肿人。1
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3.2.2神经型
神经型MI)的病理变化为外周神经肿胀，呈半透明水肿样，色泽变淡，横纹消失，其肿胀程度一般为止常补经的2倍3产。这此变化多发牛在腰伴补经从、坐骨补经从，臂补经从颈部迷是经从等部位。山丁多为不对称性，通过比较对侧神经将有助丁判定。3.2.3皮肤型
皮肤型MLD)病理变化比较少见。其病理变化特征为：以皮肤的羽毛囊为中心，形成半球形隆起的肿瘤痛.其表面有时可见鳞片状棕色断皮。3.2.4眼型
眼型MI)是由于淋巴细胞浸润虹膜而导致的病埋变化，虹膜呈环状或斑点状褪色，出现淡灰色；腩孔不规则，有时偏间虹膜一侧：3.3病理组织学变化
采集病鸡肿胀的外周神经和内脏的肿瘤组织样品，按常规方法制备石蜡切片、苏木素供红染色，通过通光学显微镜进行病理组织学观繁判定，根据病变组织巾浸润细胞的种类及形态学，外周补经病理组织学变化可分为A、B、C三个型：在同只鸡的不同神经川能会出现不同的病变型，A型病变以淋巴母细胞·大、中、小淋巴细胞及巨噬细胞的增生浸润为主，B型病变衣现神经水肿，神经纤维被水肿液分离，水肿液中以小淋巴细胞、浆细胞和许旺细胞增生为主。C型病变为轻微的水肿和轻度小淋巴细胞增生：内脏和其他组织的肿瘤与A型神经病变相似。通常以出现人小各另的淋巴细胞增生为主。3.4鉴别诊断
3.4.1与禽白血病（Avianleukosis,AL）鉴别诊断AL作病理剖检中容易与缺乏外周神经病变的内脏型MD相混淆：一般需要通过流行病学和病理组织学进行鉴别诊断。常见的AI.包括由A,B亚群白血病病毒引起的禽淋巴性:白血病（Lymphoid lcukosis,l.I.)和由」业群亡血病病毒引起的髓细胞瘤亢血病在流行病学方而.AL股发生于16周龄以上的鸡·多发牛于24周龄～40周龄之间而MD的死广高峰-股发牛在10周龄～20周龄之间。另外，LL的发病率较低：-般不超过5%.而MD的发病率较高。
LL肿瘤病理组织学变化主要衣现为大小均一的淋巴母细胞增生浸润，另外，在LL与MD引起的法氏囊肿瘤中，其肿瘤细胞的没润部位存在着差兄。MD肿瘤细胞要在滤泡间增殖，而LL肿瘤细胞则主要在滤泡内增殖。
「亚群白而病病毒引起的肿痛病要包括髓细胞性、成红细胞性和成髓细胞性白血病，以及肾母细胞瘤、血管肉瘤和组织细胞性肉瘤病，前三者的主要表现是在受影响的组织器官内.可见显著的未成熟髓细胞的增殖。肿瘤细胞大小不·，核浆比高.呈现细胞多形性，细胞核呈椭圆形，个体较大且偏心分布，核膜增厚且不规则：核仁明显，染色质旱细密的点状或较大点状或浓染块状分布·并可见非典型的核分裂像。肿瘤细胞的细胞质中含有少量至多量的球形嗜酸性颗粒。J亚群白血病病毒引起的髓细胞瘤白血病在病理组织学上易与MD区分。3.4.2与禽网状内皮组织增生病（Relicularendotheliosis.RE）鉴别诊断尽管RE在不同的鸡群中感染率差异较大但一般发病率较低。本病作病理组织学方面,RE法民2
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囊肿瘤主要表现为慢性B细胞性淋巴瘤、与淋巴细胞性广血病朴似;非法氏囊肿瘤主要表现为T细胞性淋巴瘤·表现为形态相似的淋巴母细胞增殖，可能混杂有一部分小型淋巴细胞，3.5临床诊断判定
发病鸡符合MD)临床症状和病理变化,判定为MD疑似病例4病毒分离
4.1试剂
4.1.1磷酸盐缓冲液(P13S pH 7.1):配方见A.1。4.1.2细胞培养液与细胞维持液：配方见A.2。4.1.3淋巴细胞分离液。
4.1.4SPGA/EDTA缓冲液：配方见A.34.1.5细胞冻存液：配方见A.4.
4.2器材
倒置显微镜。
超市波仪。
细胞培养箱。
4.2.4微量可调移液器：(10ul~200ul.50ul~300ul)单道移液器，4.2.5于动或电动移液装置.
细胞培养Ⅲ。
3细胞
4.3.1鸡肾细胞。
鸭胚成纤维细胞
4.3.3鸡胚成纤维细胞.
4.4操作方法
4.4.1病料处理
淋巴细胞的分离
无菌采集疑似MD发病鸡的抗凝血.按照常规方法，利用淋巴细胞分离液分离。4.4.1.2羽髓组织处理
无菌采集疑似 MD发病鸡羽髓于离心管中,剪碎,加人 1 InL SPGA/EDTA缓冲液,忌浮，忌浮超卢后用0.45um的滤膜进行过滤。4.4.2制备单层细胞
按常规法制备原代的CKC或DEF或CEF.37C静置培养，形成单层细胞后用于病毒接种，4.4.3接种细胞
将0.2ml.恩浮液用细胞维持液稀释牟1ml.接种到单层细胞中（细胞培养而的直径为60mm）,将接种和未接种的对照细胞放在细胞培养箱中近行培养，羽髓组织悬液在接种细胞前，应倒掉细跑培养3
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液，川入羽髓组织志液经40 min吸附后川人细胞维持液：每2d换-次细胞维持液，若被检样品巾含有MDV，通觉在3d--5d时出现PE，形成由圆形和梭形的折光性细胞和多核细胞红成的蚀斑，人约7d10 d时逃行蚀斑计数
4.4.4病毒继代或收获
每天观察并记录。7d~10d后.视CPE情况.按常规方法继代或冻存细胞毒于液氮巾。4.4.5病毒鉴定
4.4.5.1血清学鉴定
成用标准抗原和阳性血清按5.4.1方法进行，中央孔加血清，检测分离毒抗原.4.4.5.2分子生物学鉴定
按照6.4方法行PCR检测。
5病毒分离检测结果判定
以4.1.5任何-种方法检测为阳性，都可以判定为MIDV阳性，5琼脂免疫扩散试验检测
5.1概述
MDAGID既可用于抗原的检测，也可以用于抗体的检测。在人T感染试验中，病毒抗原-般在MDV感染鸡14～24l后可检测到抗体一般在病感染21d后可检测到。5.2试剂
5.2.1标准抗原：MDV抗原山MDV标准强荐的细胞培养物制备。5.2.2标准阴、阳性血清：标准阴、阳性血清分别由SPF鸡和接种MDV标准强毒的细胞培养物的SPF鸡血清制备
5.2.3溶液配制
5.2.3.1酸盐缓冲液（PBSpII7.4)：配方见A.1.【%硫柳汞溶液：配方见B.1
生理盐水：配方见B.2.
5.2.3.4琼脂平板的制备：配方见13.3，5.3器材
5.3.1 平m。
5.3.2打孔器，
5.3.3针头。
5.4操作方法
5.4.1抗原（病原）检测
5.4.1.1打孔
在已制备的琼脂板，用直径mm或mm直径的打孔器接入角形图案打孔·或用梅化形打孔器4
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打孔：巾心孔与外周孔距离为3mm：将孔市的琼脂用针头挑出，成避免境脂层脱离平Ⅲ底部5.4.1.2封底
用酒精灯火焰轻烤平而底部至琼胎轻微融化为止，过闭扎的底部，5.4.1.3加样
用微量移液器吸取用火菌生理盐水稀释的标准阳性血清（按产品使用说明书的要求稀释），滴人中央孔，标准阳性抗原恩液分别加入外周相对的两孔中，在外周的其余孔中加人被检的羽髓没出液。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头5.4.1.4感作
加样完毕后.静置5min~~10 min，将平血轻轻倒置，放人湿盒内.置37℃温箱中反应，分别准:24k和48h观察结果
5.4.2抗体检测
操作方法同5.1.1.按如下操作加样：标准抗原液用灭菌生理盐水稀释（按产品使用说明的要求稀释），用微量移液器吸取，滴人巾央孔，标准阳性血清分别加人外周杆对的两孔，待检血清按顺序分别加人外周的其余孔中。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个吸头。5.5结果判定
5.5.1MD)琼脂免疫扩散试验结果判定示意图见图1：标准阳性血清
待检血消
（阴性）
待检血清
（弱阳性）
标准阳性血消
待检血消
（阳性）
待检血清
(阴性）
标准阳性抗原
待检抗原
（阳性）
待检抗原
（朗阴性）
标准阳性血消
标准阳性抗原
待检抗踪
（阴性）
待检抗原
（弱阳性）
标准阳性抗原
图1MD琼脂免疫扩散试验结果判定示意图5.5.2将琼脂板置日光灯或侧强光下进行观繁，当标准阳性血清与标准抗原孔间有明显沉淀线，表明阳性对照成立；在阳性对照成立情况下，当待检血清(或抗原)与标准抗原(或标准阳性血清)孔间有明显沉淀线，且此沉淀线与标准抗原和标准血清孔问的沉淀线末端相融合，则待检样品为阳性，5.5.3当标准阳性血清与标准抗原孔的沉淀线的未端在比邻的待检血清孔或待检抗原孔处的未端向中央孔方间弯曲时，待检样品为弱阳性5.5.4当阳性对照成立，而待检血清（或抗原）与标准抗原（或标准阳性血清）孔之间无沉淀线，或标准阳性血清与抗原孔间的沉淀线末端向毗邻的待检血清孔或待检抗原孔直伸或向外侧偏弯曲时，该待检血清为阴性：
5.5.5介于阴、阳性之间为可疑。可疑应重检，二次检测仍为可疑判为阳性，5
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6PCR检测
6.1概述
针对 MDV 血清1 型病毒特有的 neI基因和132碱基重复序列(132 bpr)的PCR检测，可以对MI)V而清「型病毒感染进行检测和鉴定：同吋可以对野毒株和疫苗株感染加以区分。6.2试剂
6.2.1阴性和阳性对照：分别为SPF鸡的组织和MDV强、弱毒细胞株培养物提取的核酸，一20℃保存。
6.2.2组织细胞裂解液：为病毒总DNA提试剂、配方见附录C中的C,1.6.2.3苯酚，氯优·另戊醇，均为分析纯6.2.475%乙醇：用无水乙醇和水配制，20℃预冷：6.3器材
PCR扩增仪
台式低温高速离心机
6.3.3稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。6.3.4凝胶成像仪（或紫外透射仪）。6.3.5
-20冰箱。
微量调移液器（0.5~1054040μ~200和200μ1000μ各1支）6.3.6
PCR扩增管。
6.4操作方法
6.4.1样品准备
方法适用所有的MD病原样品，包括羽髓、肝脏、脾脏、肾脏等器官，以及淋巴细胞与细胞培养物等。在无菌环境中，将采集的动物机体组织研磨.加PBS洗2次，12000g/min离心10min，取沉淀用于提取总DNA。细胞样品不需要研磨处埋.直接用于提取总DNA，6.4.2核酸提取
6.4.2.1酚氯仿法
提取方法见C.2。
6.4.2.2核酸提取等效方法
MDV核酸提取可以采用细胞、血液和组织提取试剂盒，按照使用说明操作。6.4.3PCR扩增
6.4.3.1扩增试剂的准备
在试剂配制区进行。设PCR反应数为，为待检样品数一阳性对照一阴性对照，亢接n十1个反应进行配制，每个样本检测反应体系配制见（.3，将下游引物（见（.1）.a酶，buffer.dVP和去离子水按照使用量加人到一个离心管中，混勾，每个PCR管中分装19μL，记录好待检样品管、阴性对照管、阳性对照管，转移至样本处理区，6
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6.4.3.2加样
GB/T18643—2021
在样本处理区进行,在已分装有PCR反应液的PCR扩增管中分别加人已制备好的DNA溶液l μl.盖紧。
6.4.3.3PCR 反应
将PCR管放人PCR扩增仪中，按照设定扩增条件（见C.5)进行扩增6.4.4琼脂糖凝胶电泳
6.4.4.11%琼脂糖凝胶板的制备：配方见C.6。依据样品数选用适宜的梳子，待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加1XTAE缓冲液（配方见C.7)淹没胶面。6.4.4.2加样：取6L8uLPCR扩增产物和2uL加样缓冲液混勾后加人一个加样孔：每次电泳同时加样标准DNAMarkcr、阴性对照、阳性对照。6.4.4.3电泳：电压80V-00V.或电流40mA~50mA；电泳30min~~40min.6.5PCR检测结果判定
6.5.1试验成立判定
电泳结束后，取出凝胶板置丁紫外透射仪或凝胶成像系统观察。阳性对照样品，neq基因应检测到786bp大小条带，132bpr应检测到317bp大小的条带，且阴性对照无扩增条带，则试验成立：否则，此次试验视为无效。
6.5.2阳性判定
6.5.2.1待检样品扩增结果，meq基因检测为786bp或963bp大小条带：132bpr检测物为317bp或449bp人小单一条带，或名为多带型条带（存在2条以1的条带，一般可出现5条8条，人小为185bp，317bp，119bp.581bp.713bp.845bp.977bp,1109bp）,表明检测样品中MD)V血清1型病毒阳性（示例图见c.8)。
6.5.2.2若待检样品扩增结果，meq基因检测为786bp大小条带，132bpr检测为317bp或449bp大小单一条带·衣明该MLDV为野毒株（小例图见C.8）6.5.2.3若待检样品扩增结果，merl基因检测为963bp大小条带，132bpr检测为多带型条带（存在2条以1的条带，一般可出现5条~8条，人小为185bp，317bp，419bp,581bp，713bp,815bp，977hp，1109bp），表明检测样品中MD)V血清【型病毒阳性，表明该MI)V为疫苗毒（示例图见图（.1、图（.2）。6.5.2.4若待检样品mcq基因检测和132bpr检测出现与6.5.2.2或6.5.2.3不一致情况.则需要序列测定等方法进行综合分析。
6.5.3阴性判定
如待检样品无日的条带扩增，判为阴性：7荧光定量PCR(q-PCR)检测
7.1试剂
见6.2。
7.2器材
7.2.1荧光定量PCR扩增仪。
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GB/T 18643—2021
7.2.2其余器材：见6.3.
7.3操作方法
7.3.1样品准备
见6.4.1.
7.3.2核酸提取
见6.4.2。
7.3.3q-PCR扩增
按如下步骤进行q-PCR扩增：
a）扩增试剂的准备：在试剂配制区进行。设实时荧光定量PCR反应管数为n，n为待检样品数十阳性管数一阴性管数，方接n十1个反应逊行配制。配制反应液在冰盒中近行。每个样本检测反应体系配制见附录D)中的D).1将上下游引物及探（见D.2)，热启动Tacl酶，buller，dVTP和去离子水按照使用量人到个离心管巾，混匀，每个PCR管中分装23L，记录好待检样品管、阴性对照管、阳性对照管，转移至样本处埋区h）加样:在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加入7.3.2制备的核酸2μl,盖「:盖了500r/min-1000r/min离心30s：转移至检测区：c）-PCR反应：把PCR管放在荧光定量PCR仪器上，按照设定扩增条件（见D.3)进行q-PCR扩增：
7.3.4试验成立条件
试验成立条件如下：
a）阳性刘照扩增曲线应成标推的S曲线,且Ct值应小丁25.b）阴性对照扩增曲线成为基线下的水平线。7.4q-PCR检测结果判定
若被检样本检测结果显小曲线成标准的S曲线·ⅡCi值35，报告为MDV核酸阳性；若无S曲线，报告为MI)V核酸阴性35~Ct值40判定为疑，可疑样品重新检测，如重复后仍然35C1值40且扩增西线均为典型的S两线·报告为MLDV核酸阳性：如重复后仍然35Ct估40，且无典型S两线报告为MI)V核酸阴性，
8综合判定
8.1临床检测鸡只或相美细胞培养物，经病毒分离.或AGI试验.或PCR检测.或PCR检测，其巾-种方法检测为阳性，可判定为MI)V感染，8.2临床疑似判定发生MID)的鸡只，经分离出MI)VH.鉴定为野毒株感染，或经琼脂免疫扩散试验检测出抗原阳性，或经PCR检测结果符合野毒株特征，川判定为发生MI)。8.3临床无明显特异症状的鸡只经分离出ML)VⅡ鉴定为野毒株感染.或经PCR检测结果符合野声株特征，判定为存在ML)V野毒株感染8.4临床无明显特异症状的鸡只.分离出MI)V且鉴定为疫苗株感染，或经PCR检测结果符合疫苗株特征，判定为正常的MD疫出免疫。8
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