GB/T 39914-2021.Variety genuineness and purity testing of main crops with SSR markers-Maize.
1范围.
GB/T 39914规定了玉米(Zea mays L.)品种真实性和品种纯度SSR分子标记的检测原则、检测方案、检测程序和结果报告。
GB/T 39914适用于玉米品种真实性验证和真实性身份鉴定,不适用于实质性衍生品种(EDV)和转基因品种的鉴定。
GB/T 39914适用于玉米单交种品种纯度测定,自交系、双交种、三交种品种纯度测定可参照执行。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 3543.1农作物种子检验规程
总则
GB/T 3543.2农作物种子检验规程扦样
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语、定义和缩略语
3.1
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
品种真实性验证 variety verification
与其对应品种名称的标准样品比较,检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实。
3.1.2
品种真实性身份鉴定 variety identification
经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台(3.1.4)筛查比较,确定供检样品的真实品种名称。

ICS 65.020.20
中华人民共和国国家标准
GB/T39914—2021
主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测
Variety genuineness and purity testing of main crops with SsR markers--Maize2021-04-30发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-11-01实施
-riKacerKAca-
2规范性引用义件
3术证、定义和缩略话·
术语和定义
缩略咯语
检测方案
检测平台
检测条件
6仪器设备、试剂和溶液配制·
仪器设备
溶液配制
真实性检测程序
引物合成
DNA提取
PCR扩增
扩增产物分离
数据分析
8品种纯度检测程序
LNA提取
引物筛选和合成
8.3PCR增
8.4扩增产物分离
8.5数据分析
9结果计算与表示
真实性鉴定
纯度测定
结果报告
-rrKaeerkca-
GB/T 39914—2021
GB/T 39914—2021
真实性鉴定
纯度测定
附录A（规范性附录）
溶液配制
附录B（资料性附录）
等位基因扩增片段信息
表1真实性鉴定引物
表2PCR扩增反应体系
表3纯度测定候选引物
已知品种主要等位基因扩增片段信息衣B.1
-rKaeerKa-
本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。GB/T39914—2021
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标滩由中华人民共和国农业农村部提出本标准由全国农作物种子标准化技术委员会（SAC/TC37）归口本标准起草单位：全国农业技术推广服务中心、北京市农林科学院玉米研究中心、北京市种了管现站。
本标滩主要起草人：干凤格、支巨振、易红梅、赵建宗、张力科、田红丽、律宝春。rrKaeerkAca-
-riKacerKAca-
1范围
主要农作物品种真实性和纯度SSR分子标记检测玉米
GB/T 39914—2021
本标准规定了卡米（ZeumG.VsL.)品种真实性和品种纯度SSR分子标记的检测原则、检测方案、检测程序和结果报告。
本标准适用丁卡米品种真实性验证和真实性身份鉴定，不适用丁实质性衍生品种（ELV)和转基因品种的鉴定
本标雅适用丁卡米单交种品种纯度测定，白交系、双交种交种品种纯度测定参照执行2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注Ⅱ期的引用文件，仅注Ⅱ期的版本适用于本文件。凡是不注Ⅱ期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。G[3/T35413.1农作物种了检验规程总则G3/T3543.2农作物种了检验规程扦样G3/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用丁本文件。3.1.1
品种真实性验证
wariety verification
与其对应品种名称的标准样品比较，检测证实供检样品品种名称标注是否名副其实。3.1.2
品种真实性身份鉴定
wariety identification
经SSR分子标记检测并通过审定品种SSR指纹数据比对平台（3.1.4)筛查比较，确定供检样品的真实品种名称。
标准样品
standard sample
国家指定机构保存的经认定代表审定品种特征特性的实物种子样品。3.1.4
SSR指纹数据比对平台
SsRfingerprinihlasiplatform
采用SSR分子标记的标准化方法对品种标准样品等位基因逊行检测，并运用计算机数据库技术和网络信息技术所构建的审定品种分了数据信息的检索比对载体。3.1.5
参照样品
referenceconirol sample
用丁校准检测样品SSR等位基因已定义扩产：物片段大小的样品。1
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GB/T 39914—2021
primer
一条五补结合在模板DNA链「的短单链，能提供3一OH末端作为I)NA合成的起始点.延伸合成模板DNA的五补链。
组合引物
能够组合在一起电泳的，具有不同颜色或相同颜色而扩增产物片段大小不同的荧光标记的一组引物。
等位基因
allele
在一对同源染色体1同一基因座1的一对基因，注1：对于SSR检测.等位基因旁兑以扩增产物片段尺小来表示，注2：对于或光标记引物，折增产物片段大小是指个已定义片段大小的区间范国，本标准将之称为13n，3.2缩略语
下列缩咯语适用于本文件，
hp：hascpair，碱基对。
CTAB：cetyltrimethylammoniumbromide，十入烷基三甲基溴化铵。DNA：deoxyribonucleic acid.脱氧核耕核酸。dNTPs:deoxyribonucleosidetriphosphales.脱氧核磷酸PAGE：polyacrylamidegel electrophoresis，聚内烯酰胺凝胶电冰。PcR：polymerasechainreaction.聚合酶链式反成SDs:sodiumdoclecyl sulfatc「二烷基茶磺酸钠SsR：simplesequcncerepeat，简单序列重复Tuq 酶:Tuq-DNA polymerase.耐热 DNA聚合酶4总则
米的不同晶种，其基因组存在着能够山代稳定遗传的简单序列重复（SSR)的重复次数差异：这种差异可以通过从抽取有代表性的检测样品市提取DNA，用SSR引物进行护增和电漆·从而通过其打增产物片段大小不同而加以区分品种。依据SSR检测原，采用固定数月的SSR引物，通过与标准样品比较或与SSR指纹数据比对平台比对的方式，对品种真实性进行验证或身份鉴定，真实性验证依据规定数月引物的SSR分了标记差兄数日而判定·品种真实性身份鉴定依据SSR分了标记数日没有差兄的原则进行筛否，鉴定而确定采用筛选能够准确识别品种异常个体指纹数据或图谱的适宜引物，通对对一定数量检测样品的异常个体数目或自分率的品种纯度估测，从而对其整体的典型一致程度作出评价：5检测方案www.bzxz.net
5.1总则
对于真实性鉴定和纯度测定，引物、检测平台、样品状况不同，其检测结果准确度、精确度可能有所不同。应依据“适于检测几的\的原则，统筹考患检测规模和检测能力，择定适亢的引物、检测平台、样品状况，制定相应的检测方案。
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GB/T 39914—2021
在严格控制条件下，合成选择的引物，按照确定的检测平台对检测样品按LDNA提取、PCR扩增、电泳、数据分析的程序进行检测：按规定要求填报检测结果，检验报告应注明检测方案所选择的影响检测结果的关键信息。5.2引物
5.2.1真实性鉴定
5.2.1.1检测引物数月越多，结果漏检和误判的概率降低，工作量也随之增加，这需要依据检测月的在可接受结果准确率的前提下迹行兼顾。经刘我国中定通过卡米品种逊行全面试验后，依据高分辨率、染色体均勾分布等筛选原则，本标准避选了40对作为品种直实性鉴定的检测引物，具体见表1，并据此构建『己知品种的SSR指纹数据比对平台，表1可物可分为I、Ⅱ两组，编号PM01PM20为I组，编号PM21~PM40为I组，每组包含20对。5.2.1.2品种真实性验证独调的是对结果的否定，相对而产对引物数量要求不高，检测充许采用序贯方式。先来用1组引物迹行检测，若未检测到或检测到可以判定不符结果的差异位点数的，终止检测。对于采用组引物近行检测，若检测到而未达到可以判定不符结果的差异位点数的，则继续完成Ⅱ组引物的检测
5.2.1.3品种真实性身份鉴定强调的是对结果的肯定，在已其备已知中定品种的SSR指纹数据比对平台的前提下，通过已知检测信总能够筛查确定至具休品种，为尽量降低误判.检测时会对引物数量要求较高，可来用序贯方式，也川占接来用表1的40刘SSR引物迹行检测，点至与SSR指纹数据比对平台比较后能够确定为止：经比较后仍与已知品种存在没有位点差异而无法得出结论的，允许来用其他能够区分的SSR分子标记进行检测。5.2.2纯度测定
5.2.2.1纯度测定要明确所检测的异常个体类型，异常个体的类型不同，所选引物和数目也有所不同；有时还需借助相应交母本的IVA指纹数据。杂交种异常个体主要类型为百交、异交，混杂白交系异常个体为异交、混杂。
5.2.2.2品种纯度测定所选的可物，应通过检测样品预试验.筛选出能够准确识别该样品品种的异常个体。筛选时还需综合考虑引物的杂合度、DNA快速提取和多重组合电泳的潜力。筛选结果表明，样品在个别位点存在遗传不稳定状况的可将其剔除，检测样品存在严重遗传不稳定状况的可终止纯度测定。5.3检测平台
5.3.1电泳是检测的关键环节.对于真实性鉴定.可选择采用变性PA(E电泳、毛细管电泳.但应注意变性PA（E电泳检测数据与SSR指纹数据比对平台比对困维，难以进行真实性身份鉴定：对于纯度测定，可以采用PAGE电泳，毛细管电泳，在选择等位基因扩增片段差异较人的引物前提下也可采用琼脂瓣电泳
5.3.2对于样品量较大的，可将样品粉碎仪、DNA自动提取和移液T作站、高逍量PCR扩增仪、多可物组合的毛细管电泳进行组合，以提高检测的综合效率，5.3.3DVA提取、PCR扩增、电泳的技术条件要求，在适于检测月的和不影响检测质量的前提下，按照检测平台的要求允许对本标准的规定做适亢的局部改进5.4样品
5.4.1真实性鉴定
5.4.1.1送验样品为种了，质量应不低于200g或不少于500粒。在种了生产基地取样，送验样品可为3
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GB/T 39914—2021
果穗，数量成不低于5个（总粒数不少于500粒）：注：在种了牛产基地取样，送验样品可以为幼苗、叶片，苞叶等组织或器官，这时注总其检测比对对象，幼苗、叶片或苞叶的数量至少含有20个个体，采川混合样品检测的先单独提收INA，用收等量DVA混合，5.4.1.2从送验样品中分取有代衣性的试样，来用混合样或单个个体行检测。混合样试样求源应至少含有20个个体单个个体试样质至少含有5个个体。5.4.2纯度测定
5.4.2.1送验样品为种子，对于杂交种质量应不低于200g或不少于500粒；对于自交系质量应不低于100g或不少于【000粒。与真实性鉴定同时开展检测的.可以为同一送检样品。5.4.2.2从送验样品中分取规定数量的试样，试样采用单个个体还行独立检测。送验样品或试样的抽取、分取应有代表性.符合GB/T3543.2的规定。试样的数量，对于杂交种，应至少含有96（适用时可含对照）×2粒种了：对于白交系，应至少含有96（适用时可含对照)×1粒种了。5.5检测条件
直实性鉴定或纯度测定应在有利丁检测正确实施的控制条件下迹行，包括但不限丁下列条件：种子检验员具备熟悉所使用检测技术的知识和技能；所有仪器与使用的技术相适应，并已经过定期维扩、验证和校准；一使用适当等级的试剂和灭菌处理的耗材；使用校准影响检测结果评定的适宜参照样品。6仪器设备、试剂和溶液配制
仪器设备
6.1.1DNA提取
高速冷冻离心机水浴锅或金属浴、紫外分光光度计或核酸浓度测定仪、组织研磨仪6.1.2PCR 扩增
PCR扩增仪。
6.1.3电泳
6.1.3.1毛细管电泳
DVA分析仪。
PAGE电泳
高压电泳仪、垂直电泳槽及制胶附件、水平摇床、胶片观察灯、凝胶成像系统或数码相机，6.1.3.3琼脂糖凝胶电泳
电泳仪、水平电泳槽及制胶附件、凝胶成像系统或紫外透射仪6.1.4其他器具
微量移液器、电了天平、高压灭菌钢、磁力揽拌器、微波炉、冰箱、染色盒，-riKacerKAca-
6.2试剂
6.2.1DNA提取
GB/T 39914—2021
CTAB、氯甲烷、异戊醇异内醇、乙二胺四乙酸二钠(EDTAVa：2IIO）、羟甲基氢基甲烷侧（Trisbase）、盐酸、氢氧化钠、氯化钠，6.2.2PCR扩增
clVTPs、Ta酶、10×缓冲液、矿物油ddH,O.引物和Mg+。6.2.3电泳
6.2.3.1毛细管电泳
DNA分析仪专用的内烯酰胺胶、分子量内标、去离子甲酰胺、电泳缓冲液。6.2.3.2PAGE电泳
去离子甲酰胺（Formamidle）漠酚蓝（rphluc）、二甲苯青FF、甲叉双丙烯酰胺（isacrylamide）内烯酰胺（Acrylatmide）、硼酸（BoricAcicl），尿素，亲和硅烷（BindingSilae）、疏水硅烷（RepelSilane）、DVA分子量标准、无水乙醇、四甲基乙二胺（TEMED）过硫酸铵（APS）、冰醋酸、乙酸铵、硝酸银、甲醛、氢氙化钠，
6.2.3.3琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖、溴酚蓝（BrphBluc）、核酸染色剂（Goldvicw或溴化乙）。6.3溶液配制
DVA提取、卫R扩增、出泳，银染的济液接照附录A现定的要求进行配制·所用试剂均为分析纯试剂配制所用水应符合GB/T6682规定的-级水的要求，其中银染落液配制可以使用衍合三级要求的水。
7真实性检测程序
引物合成
根据真实性验证或身份鉴定的要求，选定表1的引物，选用变性PA（E电泳，只需合成普通引物，采用单引物电泳：选用荧光毛细管电，需在止向引物的5'端标记荧光染料合成引物，采用单引物或组合引物电泳，表1标记荧光栏所列的仅作为示例，只适用于某一检测平台使用表1真实性鉴定引物
引物名称
PM01hnlg439wl
umel335y5
染色体
引物序列（53）
E :AGTTGACATCGCCATCTTGGTGAG
反向：GAACAAGCCCTTAGCGGGTTGTC正向.CCTCGTTACGGTTACGCTGCTG
反向:GATGACCCCGCTTACTTCGTTTATG-rrKaeerkAca-
GB/T39914—2021
引物名称
umc2007y4
hnlg1940k?
umc2105k3
phio53k2
phi072k4
hnlg2291k4
umc1705wl
lnlg2305k4
bnlg161ks
bnlg1702kl
ume1545y2
umel125y3
lhnlg240kl
phio80k15
phi065kg
umc1492y13
ume1432y6
ume1506kl2
umc1147y4
染色体
表1(续）
引物序列（5°—3)
正向：TTACACAACGCAACACGAGGC
皮向:GCTATAGGCCGTAGCTIGGTAGACACF间:CGTTTAAGAACGGTTGATTGCATTCC反间:GCCTTTATTTCTCCCTTGCTTGCC正向:GAAGGGCAATGAATAGAGCCATGAG反向:ATGGACTCTGTGCGACTTGTACCG正向CCCTGCCTCTCAGATTCAGAGATTG反向:TAGGCTGGCTGGAAGTTTGTTGCE:GCTCGTCTCCICCAGGTCAGG
反间:CGTTGCCCATACATCATGCCTC
正向:GCACACCCGTAGTAGCTGAGACTTG反向：CATAACCTTGCCTCCCAAACCC正向:GGAGGTCGTCAGATGGAGTTCG
反向:CACGTACGGCAATGCAGACAAG
F间 :CCCCTCTTCCTCAGCACCTTG
反间CGTCTTGTCTCCGTCCGTGTG
正向:TCTCAGCTCCTGCTTATTGCTTTCG反向:GATGGATGGAGCATGAGCTTGC
正向:GATCCGCATTGTCAAATGACCACZ AGGACACGCCAICGICATCA
EH间 :AATGCCGTTATCATGCGATGC
反间:GCTTGCTGCTTCTTGAATTGCGT正向:GGATGATGGCGAGGATGATGTC
R向：CCACCAACCCATACCCATACCAG正向:GCAGGTGTCGGGGATTTTCTC
Z间:GGAACTGAAGAACAGAAGGCATTGATAC正E:TGAACCACCCGATGCAACTTG
反向：TTGATGGGCACGATCTCGTAGTC正向:CGCCTTCAAGAATATCCTTGTGCCR向:GGACCCAGACCAGGTICCACC
F间:GCGGAAGAGTAGTCGTAGGGCTAGTGTAG间AACCAAGTTCTTCAGACGCTTCAGG
正间:GAGAAATCAAGAGGTGCGAGCATC反向:GGCCATGATACAGCAAGAAATGATAAGC正向GAGGAATGATGTCCGCGAAGAAG
反向：TICAGTCGAGCGCCCAACAC
正间:AAGAACAGGACTACATGAGGTGCGATAC反间:GTTTCCTATGGTACAGTTCTCCCTCGCrrKaeerkAca
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