GB/T 39602-2020.Diagnostic techniques for Lumpy skin disease.
1范围
GB/T 39602规定了牛结节性皮肤病(LSD)的临床诊断、实验室诊断技术和程序。
GB/T 39602适用于牛结节性皮肤病的诊断。病毒分离与鉴定适用于个体动物移动前的无感染证明或临床病例确诊;电镜观察适用于临床病例确诊;实时荧光PCR与普通PCR适用于个体动物移动前的无感染证明、临床病例确诊和监测感染流行率;血清中和试验适用于个体动物移动前的无感染证明、确诊临床病例、监测感染流行率和免疫效果评估。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
NY/T 541兽 医诊断样品采集、保存与运输技术规范
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CPE:细胞病变(Cytopathic effect)
DNA :脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
GMEM:生长营养需要培养基(Glasgow' s Modified Eagle's Medium)
LSD:牛结节性皮肤病(Lumpy skin disease)
LSDV:牛结节性皮肤病病毒(Lumpyskindiseasevirus)
LTc:羔羊睾丸细胞(Lamb testis cell)
ORF :开放阅读框(Open reading frame)
PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate buffered saline)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction)
TCID50 :半数组织培养感染量( Median tissue culture infective dose)
Vero:非洲绿猴肾细胞( African green monkey kidney cell)
VN :病毒中和试验( Virus neutralisation test)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T39602—2020
牛结节性皮肤病诊断技术
Diagnostic techniques for Lumpy skin disease2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
规范性引用文件
缩略语
临床诊断
易感动物
临床症状
病理变化
结果判定
实验室诊断样品采集
样品采集
样品的送检与保存
样品处理
6电镜观察
操作步骤
结果判定
病毒分离与鉴定
细胞与试剂
病毒分离
病毒鉴定
实时荧光聚合酶链式反应（实时荧光PCR）8
引物及探针
标准毒株和细胞
样品的处理
病毒DNA的提取和纯化
实时荧光PCR检测
结果判定
聚合酶链式反应（普通PCR方法）次
GB/T39602—2020
GB/T39602—2020
样本的制备
PCR检测
结果判定
微量中和试验（VN）
器材·
细胞株
标准毒株·
操作步骤
阴阳性对照
结果判定
结果解释
11综合判定
11.2确诊免费标准bzxz.net
附录A（规范性附录）
附录B（资料性附录）
试剂的配制
引物扩增序列
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草GB/T39602—2020
本标准对应于OIE最新公布的《陆生动物诊断试验和疫苗手册》（2018版）的3.4.12牛结节性皮肤病(LSD)有关内容,且与该条标准的一致性程度为非等效本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中华人民共和国重庆海关、中国动物卫生与流行病学中心、中华人民共和国上海海关、重庆澳龙生物制品有限公司。本标准主要起草人：聂福平、李林、李应国、吴晓东、王昱、杨俊、樊晓旭、王国民、李贤良、南文龙史梅梅、张雷、邹艳丽、王志亮、李键、冉智光m
GB/T39602—2020
本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，可能涉及到8.3引物及探针中引物对2和探针2与《牛结节性皮肤病病毒野毒株TaqMan-MGB实时荧光定量PCR检测用引物、试剂盒及检测方法》相关的专利的使用。
本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联系方式获得：
专利持有人姓名：聂福平、王昱、杨俊、李贤良、王国民、李应国。地址：重庆市江北区红黄路8号。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。
1范围
牛结节性皮肤病诊断技术
本标准规定了牛结节性皮肤病（LSD)的临床诊断、实验室诊断技术和程序GB/T39602—2020
本标准适用于牛结节性皮肤病的诊断。病毒分离与鉴定适用于个体动物移动前的无感染证明或临床病例确诊；电镜观察适用于临床病例确诊；实时荧光PCR与普通PCR适用于个体动物移动前的无感染证明、临床病例确诊和监测感染流行率：血清中和试验适用于个体动物移动前的无感染证明、确诊临床病例、监测感染流行率和免疫效果评估2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3缩略语
下列缩略语适用于本文件
CPE：细胞病变（Cytopathiceffect）DNA：脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid)GMEM：生长营养需要培养基（Glasgow'sModifiedEaglesMedium）LSD：牛结节性皮肤病（Lumpyskindisease）LSDV：牛结节性皮肤病病毒（Lumpyskindiseasevirus）LTc：羔羊睾丸细胞（Lambtestiscell)ORF：开放阅读框（Openreadingframe)PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）TCIDso：半数组织培养感染量（Mediantissuecultureinfectivedose）Vero：非洲绿猴肾细胞（Africangreenmonkeykidneycell）VN：病毒中和试验（Virusneutralisationtest）4
临床诊断
易感动物
各种品种的牛，包括黄牛、奶牛、亚洲水牛、瘤牛、耗牛均易感，绵羊、山羊及野生动物长颈鹿、黑斑羚、长角羚羊可人工感染
GB/T39602—2020
4.2临床症状
4.2.1易感动物体温升高达41℃.持续1周2周；鼻炎、结膜炎和睡液过度分泌；厌食，精神委顿，不愿行走，泌乳奶牛产奶量显著减少。4.2.2易感动物全身皮肤、黏膜出现结节，以头、颈、乳房、腿部、背部、胸部、阴囊、外阴、会阴、眼脸、耳梢、口鼻黏膜及尾部为突出，结节天小不等，可聚成不规则的肿块，可波及全身皮肤、皮下组织、肌肉组织。
4.2.3易感动物口腔和消化道黏膜表面形成丘疹；全身体表淋巴结肿大眼、鼻、口、直肠、乳房和生殖器黏膜表面形成结节，并迅速溃烂4.2.4母牛流产与暂时性不孕：公牛罹患睾丸炎和附睾炎，暂时性或终生不育。4.3病理变化
患病动物皮肤表面可见直径0.5cm~5cm、深度1cm~2cm的皮肤结节，累及所有皮肤层、皮4.3.1
下组织以及相邻的肌肉，并伴有充血、出血、水肿、血管炎和坏死；口腔、气管、生殖道和消化道黏膜（特别是皱胃)可能存在结节
4.3.2皮肤、肌肉等结节附近发生炎症反应，结节下、黏膜下、结缔组织或周围组织有浆液性渗出，皮下组织水肿；咽、呼吸道、消化道、包皮、阴道、子宫壁的病变也有此特点，4.3.3咽、舌和会庆以及整个消化道黏膜出现痘样病变。异腔、气管和肺等黏膜出现痘样病变；晕丸和膀胱出现痘样病变。
4.3.4结节切面为乳白色或白色，初期可渗出血清，2周内结节内可能出现锥形中央核或坏死组织/坏死灶。
结果判定
易感动物出现上述临床症状和病理变化，可判为疑似牛结节性皮肤病。4.4.1
4.4.2确诊应采集有临床症状动物的结节、抗凝血进行实验室诊断，或采集未见明显临床症状易感动物的抗凝血、睡液、鼻眼分泌物进行实验室诊断。5实验室诊断样品采集
5.1器材
5.1.1手术剪刀和镊子。
5.1.2灭菌样品保存管（15mL或50mL）。5.1.3离心管（2mL,10mL）。
5.1.410mlL~20mL灭菌注射器
防水标签。
医用防护服。
组织匀浆器。
高速组织匀浆机。
5.2试剂
0.1mol/LPBSpH7.4），按照附录A的A.1配制。5.2.210%甘油-PBS保存液.按照A.2配制。5.2.3青霉素，终浓度为1000IU/mL。2
5.2.4硫酸链霉素，终浓度为1mg/mL。5.2.5制霉菌素，终浓度为100IU/mL。5.2.6两性霉素B.终浓度为2.5ug/mL。5.2.7新霉素，终浓度为200IU/mL。5.2.8GMEM培养基。
5.3样品采集
5.3.1皮肤结节采集
GB/T39602—2020
用0.1mol/LPBS(pH7.4)清洗皮肤结节表面，然后用灭菌手术剪刀剪取结节，2g～5g为宜。采集到的皮肤结节装入样品保存管.加10%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。
5.3.2组织样品采集
除皮肤结节外，在活体检查或死后部检时，可采集淋巴结、病变肺部组织、脾、脏器上的病变结节及病灶周围组织2g～5g，装人样品保存管，加10%甘油-PBS保存液，使保存液液面没过样品，加盖封口，冷冻保存。临床表现健康，但需要做牛结节性皮肤病病原学监测的动物，可在屠宰时采集EDTA抗凝全血、淋巴结。对肉品进行牛结节性皮肤病病原检测时，可采集肌肉组织样品不少于2g，装入样品保存管中，密封、冷冻保存。
5.3.3其他类型样品采集
活体检查，可采集病牛的皮肤结节或结痴周围组织病料，睡液、口腔/鼻腔拭子、牛奶、精液、抗凝血（含EDTA或肝素钠）等。采集动物血液，每头应不少于2mL。用于血清分离的血液样品，每头应不少于5mL。采集的睡液、口腔/鼻腔子应立即装人样品保存管，加入0.5mL的10%甘油-PBS保存液，加盖封口，冷冻保存。
5.4样品的送检与保存
样品的运送与保存应满足NY/T541的相关要求。从抗凝血中分离血浆（即棕黄层）样品需立即置于冰上，尽快处理。样品可在4℃～8C保存2d。用于病毒分离和抗原检测的组织样品需置于4℃～8℃、冰封或一20℃保存。长距离运输样品（无冷链）样品保存液中需含10%甘油，且样品体积需足够大（按每克样品添加10mL10%甘油-PBS保存液），避免运输介质渗透到组织样品中。5.5样品处理
5.5.1生物安全措施
样品制备的生物安全措施应满足GB19489的规定。5.5.2组织病料的处理
用于病毒分离和抗原检测的病灶样品，无菌剪碎后，加人等体积的无菌PBS或含抗生素（含1000IU/mL的青霉素、1mg/mL的硫酸链霉素和100IU/mL的制霉菌素或2.5μg/mL的两性霉素B和200IU/mL的新霉素的无血清GMEM培养基，无菌研磨，制成10%的组织悬液，制成的悬液反复冻融3次后，以800g离心10min。上清液用0.22um的滤器过滤，可用于病毒培养等。5.5.3血液样品的处理
采集的抗凝血，800g离心15min，小心吸取上清液中含病毒的棕黄层血浆，将其转移至5mL预3
GB/T39602—2020
冷去离子水中.30s后，加入5mL预冷的双倍浓度的GMEM培养基，混匀。混合液以800g离心15min，弃去上清，用5mLGMEM培养基悬浮细胞沉淀，再以800g离心15min，最后用5mL新鲜的GMEM培养基悬浮沉淀，用于病毒分离培养。6电镜观察
6.1器材
透射电子显微镜。
台式冷冻离心机。
微型振荡器，
石蜡膜或蜡板，
微量移液器。
2试剂
Tris-EDTA缓冲液（pH7.8）、按照A.3配制6.2.22%磷钨酸溶液（pH7.2），按照A.4配制6.3
操作步骤
取患病动物新鲜的皮肤结节或其他活体组织，制备组织悬液，采用透射电子显微镜观察。取一滴制备的悬液于石蜡膜或蜡板或载玻片上，将约38μm（即400目）碳网膜漂覆于悬滴液上1min.再将碳网膜转移到一滴Tris-EDTA缓冲液（pH7.8）中20s，接着转到一滴2%的磷钨酸溶液（pH7.2)中染色10S。取出碳网膜，用滤纸吸去膜上液体，自然干燥后，置于电子显微镜下观察6.4结果判定
牛结节性皮肤病病毒粒子如砖状，周围覆盖有短管状结构，大小约为290nm×270nm，部分病毒粒子周围有宿主细胞膜包围。
3病毒分离与鉴定
4℃~8℃冰箱。
超低温冰箱
台式冷冻离心机。
生物Ⅱ型安全柜。
二氧化碳培养箱。
倒置显微镜。
微量移液器（5μ~20μ、20μ~200100μ~1000等不同规格）。细胞培养板，或25cm细胞培养瓶。细胞与试剂
山羊或绵羊原代（或次代)LTc。GMEM培养液。
7.2.3胎牛血清
7.2.4苏木精-伊红染色液，按照A.5配制7.3病毒分离
GB/T39602—2020
取5.5.2或5.5.3中处理后的病料上清液或棕黄层液体1mL，接种25cm培养瓶中的单层LTc37℃吸附1h，补加10mL含有2%胎牛血清的GMEM培养液，或用含有LT细胞和爬片的组织培养液。逐日观察CPE情况，持续观察7d～14d。出现细胞膜皱缩至细胞圆缩、核染色体边缘化等CPE，感染初期可见小面积的CPE，4d～6d后波及整个细胞层，14d后如未发现CPE，应将培养物反复冻融3次，取上清液再接种单层LT细胞，进行二次培养。细胞出现CPE或感染爬片出现CPE，则进行病毒特异性鉴定。
7.4病毒鉴定
7.4.1典型细胞病变如7.3所述。若培养液中含有特异性牛结节性皮肤病抗体，CPE可能被阻止或推迟。
7.4.2取7.3中细胞培养物，用丙酮固定，进行苏木精-伊红染色（即H&E染色）观察。当观察到直径相当于细胞核一半、大小不一，且周边有清晰的亮红色嗜酸性细胞浆内包涵体，即可诊断为痘病毒感染7.4.3或取7.3所述细胞培养物提取DNA，采用聚合酶链式反应，扩增、测序分析，可鉴别诊断牛结节性皮肤病病毒；或采用实时荧光聚合酶链式反应进行牛结节性皮肤病病毒核酸检测。8实时荧光聚合酶链式反应（实时荧光PCR）8.1器材
8.1.1微量高速离心机。
8.1.2生物Ⅱ型安全柜。
8.1.3微型震荡器。
8.1.4恒温水浴锅。
8.1.5高压灭菌锅。
8.1.6低温冰箱
8.1.7实时荧光PCR仪。
微量可调移液器（0.5μ~10μ、5μ~20μ、20μ~200μ、100μ000μ）及配套吸头。8.2试剂
以下所用的试剂.除特别注明者外均为分析纯试剂，水应符合GB/T6682中规定的三级水的规格。8.2.1PremixExTaq(ProbeqPCR)荧光PCR缓冲液8.2.2营养液，按照A.7配制。
8.2.3维持液，按照A.8配制。
8.2.4细胞分散液，按照A.9配制。8.2.5商品化微量病毒核酸提取试剂盒或其他商品化试剂盒8.3引物及探针
根据牛结节性皮肤病病毒的标准株Neethling株基因序列（ORF101和ORF126基因，Genbank登录号：AF409137.1），在其保守区域分别设计引物和探针，引物及探针序列见B.1。引物对1（F1和R1）GB/T39602—2020
与探针1用于通用型LSDV核酸检测，引物对2(F2和R2)和探针2用于野生型和疫苗型LSDV核酸的鉴别。具体扩增基因信息见附录B中B.1。引物与探针均用无菌去离子水配制成10μmol/L一20℃保存。
8.4标准毒株和细胞
标准毒株：以LSDV国际标准毒株Neethling株为试验参照毒株。8.4.1
8.4.2细胞：无菌取健康羔羊睾丸，制备原代睾丸细胞。8.4.3阳性对照样品：由指定单位提供或按照下列方法制备，将牛结节性皮肤病病毒国际标准毒株按10%（体积分数）接种原代睾丸细胞，37℃吸附1h后补加人细胞维持液.37℃、5%CO，培养，待CPE达到70%以上，收获病毒悬液；反复冻融3次～4次，12000g离心10min，取上清液备用。8.4.4阴性对照样品：由指定单位提供或按照下列方法制备：将正常的原代睾丸细胞反复冻融3次～4次，12000g离心10min，取上清液备用。8.5样品的处理
取5.3采集的临床样品，包括皮肤、肺、牌脏、淋巴结、肌肉等，取2g5g组织样品切成小块，加入5mL~10mL预冷的PBS缓冲液匀浆2min，制成悬液，反复冻融3次，4℃12000g离心10min，取200uL上清液进行核酸提取
液体样品（包括抗凝血、精液、细胞培养液等）：直接取200L进行核酸提取。5病毒DNA的提取和纯化
核酸提取应在生物安全柜中进行，取阴性、阳性对照和8.5中前处理的样品各200uL，按照传统酚/三氯甲烷（氯仿）抽提法提取核酸，或采用等效的DNA提取试剂盒及其方法进行病毒核酸提取，8.7实时荧光PCR检测
8.7.1实时荧光PCR反应体系
检测牛结节性皮肤病病毒实时荧光PCR体系见表1。以牛结节性皮肤病病毒DNA作为阳性对照，以不含LSDV的牛肉组织、原代睾丸细胞DNA作为阴性对照，以灭菌去离子水作为空白对照。表1实时荧光PCR反应体系
PremixExTaq缓冲液
正向引物
反向引物
MGB探针
模板DNA
灭菌去离子水
反应体系总体积
贮备液浓度
10 μmol/L
10 μmol/L
10μmol/L
体系工作液浓度
0.4μmol/L
0.4μmol/L
0.2μmol/L
实时荧光PCR反应体系可根据实际情况进行相应比例的调整8.7.2实时荧光PCR反应参数
加样体积/μL
实时荧光PCR反应参数：95℃预变性3min.95℃10S、58℃34s，共45个循环，58℃34s收集6
FAM荧光信号。
8.8结果判定
8.8.1结果分析
GB/T39602—2020
读取检测结果，阈值设定原则以阈值线超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准。不同仪器可根据仪器噪声进行调整。
8.8.2质控标准
阴性对照的检测结果应无特异性扩增，阳性对照的Ct值应<28.0。8.8.3结果描述及判定
8.8.3.1阳性
Ct值<40,且出现明显的S扩增曲线，表明样品中存在牛结节性皮肤病病毒核酸。阴性
无特异性扩增曲线或Ct值>45，表明样品中无牛结节性皮肤病病毒核酸。8.8.3.3
有效原则
40.0≤Ct值≤45.0的样本应重做，重做结果无特异性扩增或Ct值>45则为阴性；反之有Ct值且有明显扩增曲线则为阳性，
聚合酶链式反应（普通PCR方法）9.1
9.1.1 PCR仪。
台式低温高速离心机。
生物Ⅱ型安全柜
低温冰箱。
微型震荡器。
恒温水浴锅。
吸头。
高压灭菌锅。
稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。凝胶成像仪（或紫外透射仪)。
微量可调移液器（0.510μ、5～20μ、20μ～200μ、100μ～1000μ）及配套1.5mL离心管。
PCR扩增管。
9.2试剂
以下所用的试剂，除特别注明者外均为分析纯试剂，水应符合GB/T6682中规定的三级水的规格9.2.1PremixExTaqPCR缓冲液
9.2.2商品化微量病毒核酸提取试剂盒或其他商品化试剂盒7
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