GB/T 18645-2020.Diagnostic techniques for animal tuberculosis.
1范围
GB/T 18645规定了动物结核病的临床诊断、细菌学检查、皮内变态反应、PCR和r-千扰索(IFN-r)体外检测的技术方法、操作程序和判定标准。
GB/T 18645适用于动物结核病的诊断,其中流行特点、临床症状、病理变化以及皮内变态反应适用于动物结核病的临床诊断;细菌学检查中染色镜检适用于动物结核病病原学初步诊断,细菌学检查中分离培养和生化鉴定、病原分离和PCR试验适用于动物结核病病原学确诊;r-千扰素(IFN-r)体外检测法适用于牛结核病的辅助诊断。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 18088出入境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
OIE:世界动物卫生组织( W orld Organization for Animal Health)
PPD:提纯蛋白衍生物( Purified Protein Derivative)
IU:国际单位(International Unit)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme-linked Immuno-sorbent Assay)
TCH:噻吩-2-羧酸肼培养基( Thiophen-2-carboxylic Acid Hydrazide)
IFN-r:伽马干扰素(Gamma Interferon)
PNB:对硝基苯甲酸(P-nitrobenzoic Acid)
DNA:脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18645—2020
代替GB/T18645—2002
动物结核病诊断技术
Diagnostic techniques for animal tuberculosis2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
规范性引用文件
缩略语
临床诊断
流行特点
临床症状
病理变化
细菌学检查
病料的采集、运送与处理
染色镜检
分离培养和生化鉴定
结核菌素皮内变态反应试验
牛分枝杆菌PPD皮内变态反应
禽分枝杆菌PPD皮内变态反应…
其他动物结核皮内变态反应
PCR检测
采样及样品处理
PCR扩增反应
电泳检测PCR扩增产物
结果分析及判定
PCR检测结果的确证
-干扰素（IFN-Y)体外检测法（体外IFN-Y释放试验检测法）8
操作方法
诊断结果判定
GB/T18645—2020
GB/T18645—2020
附录A（资料性附录）
附录B（资料性附录）
附录C（规范性附录）
附录D（资料性附录）
附录E（资料性附录）
附录F（规范性附录）
试剂的配方
标本消化浓缩法
采样及样品处理（PCR检测用）.DNA提取液
常规PCR扩增产物核酸序列
样品采集、包装和运输的要求
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草GB/T18645—2020
本标准代替GB/T18645一2002《动物结核病诊断技术》。与GB/T186452002相比，主要技术内容变化如下：
一增加了引言；
—增加了规范性引用文件（见第2章）；增加了缩略语（见第3章）；
增加了临床诊断方法，包括流行特点、临床症状和病理变化（见4.1、4.2和4.3）；增加了警示内容，对于剖检、采样及实验室开展相关病原检测部分及实验室接触有毒物质部分给以警示（见4.3)；
增加了其他动物皮内变态反应（见6.5）；增加了PCR检测（见第7章）；
增加了-干扰素（IFN-Y)体外检测法（见第8章）；增加了诊断结果判定（见第9章）；-删除了动物接种试验的内容（见2002年版的2.3.1)；增加了常规PCR扩增产物核酸序列（见附录E）；增加了样品采集、包装和运输要求（见附录F）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国兽医药品监察所、中国动物卫生与流行病学研究中心。本标准主要起草人朱良全、丁家波、沈青春、孙明军、毛开荣、魏荣、许冠龙、冯宇。本标准所代替标准的历次发布版本情况为：-GB/T18645—2002。
GB/T18645—2020
动物结核病是由分枝杆菌属的细菌引起的一种慢性、人兽共患性传染病，在全世界范围内严重威胁人类健康并影响畜牧业发展。分枝杆菌属主要由结核分枝杆菌复合群、麻风分枝杆菌以及非结核分枝杆菌所组成。而牛分枝杆菌、结核分枝杆菌是结核分枝杆菌复合群的成员，禽分枝杆菌属于非结核分枝杆菌成员。牛结核病是国家二类动物疫病，也是《国家中长期动物疫病防治规划（2012一2020年）》中16种优先防治的国内动物疫病之一，其病原主要为牛分枝杆菌。牛分枝杆菌的宿主谱广，儿乎包括所有的温血脊椎动物。除牛最易感外，还可感染鹿、猪等多种动物；结核分枝杆菌主要导致人结核病，但也可感染牛；禽分枝杆菌禽亚种主要引起禽结核病动物结核病主要通过呼吸道和消化道感染，可侵害多种动物，家畜中奶牛最易感，其次为黄牛、耗牛、水牛、猪和家禽，野生动物中以鹿较为常见。该病临床上主要特征是病程缓慢、渐进性消瘦、咳嗽、衰竭，并在多种组织器官（如肺、肝、脾和肠道等)形成肉芽肿和干酪样钙化结节近年来国内外对动物结核病防控十分重视，如发病率高、危害较为严重的牛结核病被世界动物卫生组织（OIE)列为必须通报疫病，也是国际贸易必检对象。随着国际贸易的蓬勃发展，动物结核病可在人及多种动物间传播，对畜牧业及公共卫生安全危害严重。目前我国采用的动物结核病的诊断技术国家标准为GB/T18645一2002《动物结核病诊断技术》，其受当时知识和技术条件所限，内容已不能满足当前动物结核病诊断、检疫检测需求。主要存在以下突出问题：1)对于人兽共患性动物结核病诊断的国家标准，缺少必要的生物安全要求，以及流行病学、临床症状和病理变化等临床诊断的相关内容。2）诊断方法涉及动物接种实验内容，因确诊时间长（至少1个月）和动物福利的因素，国际上现已很少使用3）诊断方法缺少新的通用成熟技术（如PCR、体外检测Y干扰素法等）。4）需要对标准中涉及的烟酸试验或硝基苯甲酸试验的生化方法进行规范统如GB/T18645一2002《动物结核病诊断技术》与SN/T1310一2011《动物结核病检验检疫技术规范》中涉及生化试验方法不统一。前者采用烟酸试验毒性较天，而后者采用对硝基苯甲酸试验相对安全。5）需要增加适用范围，以满足出入境检验检疫工作发展的需要。因此，修订完善适用于我国动物结核病诊断的国家标准，对于临床兽医、检验检疫等科研工作者及时、准确做好诊断，从而对疫病防控和疫情处置采取快速、合理有效的应对措施，意义重大2
1范围
动物结核病诊断技术
GB/T18645—2020
本标准规定了动物结核病的临床诊断、细菌学检查、皮内变态反应、PCR和Y-干扰素（IFN-Y）体外检测的技术方法、操作程序和判定标准。本标准适用于动物结核病的诊断，其中流行特点、临床症状、病理变化以及皮内变态反应适用于动物结核病的临床诊断；细菌学检查中染色镜检适用于动物结核病病原学初步诊断.细菌学检查中分离培养和生化鉴定、病原分离和PCR试验适用于动物结核病病原学确诊；Y-干扰素（IFN-Y)体外检测法适用于牛结核病的辅助诊断
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出入境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求3缩略语
下列缩略语适用于本文件
OIE：世界动物卫生组织（WorldOrganizationforAnimalHealth）PPD：提纯蛋白衍生物（PurifiedProteinDerivative）IU：国际单位（InternationalUnit)PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedImmuno-sorbentAssay）TCH：噻盼-2-羧酸培养基（Thiophen-2-carboxylicAcidHydrazide）IFN-：伽马干扰素（GammaInterferon）PNB：对硝基苯甲酸（P-nitrobenzoicAcid）DNA：脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid）dNTPs：脱氧核苷三磷酸（Deoxy-RibonucleosideTriphosphate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）4临床诊断
流行特点
多种动物对牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、禽分枝杆菌等易感，动物中奶牛最易感，其次为黄牛、耗牛、水牛、猪和家禽，野生动物中以鹿较为常见。结核分枝杆菌主要侵害人，少见于牛、猪；牛分枝杆菌主要侵害牛，亦可感染人、绵羊、山羊、猪及犬；禽分枝杆菌主要侵害家禽和水禽，其中鸡和鸽最易感染，鹅和鸭次之，牛、猪和人也可感染。实验动物中，豚鼠对牛分枝杆菌和结核分枝杆菌敏感，对禽分枝杆菌有抵抗力，通常只能形成局部病灶；家兔对禽分枝杆菌高度敏感，对牛分枝杆菌敏感，结核分枝杆菌虽可使家1
GB/T18645—2020
兔肺部形成少量病灶，但可趋于痊愈而不致死本病主要通过呼吸道和消化道感染，也可通过交配感染。污染的饲草饲料通过消化道感染也是一个重要的途径。该病可发生在动物的任何年龄，雌性动物感染率高于雄性。4.2临床症状
感染通常呈慢性经过，病初症状不明显，当病程逐渐延长，则症状逐渐显露。由于患病器官不同，症状亦不一致：
a）牛结核病常表现为肺结核、乳房结核、淋巴结核，有时可见肠结核、生殖器结核、脑结核、浆膜结核及全身性结核。
禽结核病常表现贫血、消瘦，鸡冠萎缩以及产蛋停止等。病禽可因衰竭或肝变性破裂而突然死亡。
鹿结核病症状与牛结核病基本相同。d）
猪结核病多表现为淋巴结核，最常发病部位为颌下、咽、颈及肠系膜淋巴结：肺、肝、肠、胃等结核时主要表现消瘦、咳嗽、气喘等症状。肠道有病灶时则可能发生下病。e）
绵羊及山羊结核病常不表现明显的临床症状，往往在宰后才被发现，体内淋巴结可见结核病灶。
病理变化
警示一一对本病剖检采样过程中应防止病原微生物扩散和感染。相关操作应符合GB/T18088和GB19489的规定。
根据结核病引起动物机体病理变化的差异，可将其分为增生性和渗出性结核两种，有时两种病灶同时存在。当机体抵抗力强时，对结核菌的反应常以细胞增生为主，形成增生性结核结节，即由类上皮细胞和巨细胞集结在结核菌周围形成特异性的肉芽肿，外周是一层密集的淋巴细胞和成纤维细胞从而形成非特异性肉芽组织。当机体抵抗力低时，则以渗出性炎症为主，即在组织中有纤维蛋白和淋巴细胞的弥漫性沉积，随后发生干酪样坏死、化脓或钙化，这种变化主要见于肺和淋巴结。5细菌学检查
5.1器材
Ⅱ级生物安全柜、恒温培养箱、冰箱（2℃～8℃，一15℃以下）、离心机（离心力可达2000g）、显微镜。
5.2试剂
除特别规定外，所用化学试剂均为分析纯。溶液与培养基：4%硫酸、3%或4%氢氧化钠溶液、5%~10%盐酸溶液、氢氧化钠消化液、0.1mol/L柠檬酸钠溶液、安替福民（antiformin）溶液、甘油蛋白、姜-尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色液，对硝基苯甲酸(PNB）培养基、PBS（1/15mol/L）缓冲液、改良罗氏（Lowenstein-Jensen，L-J)培养基、吐温-80（Tween80)水解试验溶液、硝酸盐还原试验溶液、0.12%尿素溶液、0.1%酚红指示剂、噻吩-2-羧酸肼（TCH)培养基。配制方法参见附录A。
5.3病料的采集、运送与处理
5.3.1病料的采集
病料的采集，包括以下内容：
GB/T18645—2020
一对于病、死动物，应采集其淋巴结及病变组织器官（如：肺、肝、脾等）作为细菌学检查材料一对于怀疑有呼吸道结核、乳房结核、泌尿生殖道结核、肠结核的活畜，应相应采集其痰、乳、精液、子宫分泌物、尿和粪便作为细菌学检查材料。对于皮内变态反应试验阳性，但户检无病理学变化的动物，应采集其下颌、咽后、支气管、肺（特别是肺门淋巴结）、纵隔及一些肠系膜的淋巴结作为细菌学检查材料。5.3.2病料的运送
样品应封装在无菌的洁净容器或样品袋内冷藏运送。如当天无法送达实验室的，应予冷冻后运送。当无法提供冷冻条件时，可在病料中加入硼酸，使其终浓度为0.5%，但样品处理保存时间不超过1周。样品采集、包装和运输详细要求应按附录F的规定执行。5.3.3病料的处理
5.3.3.1硫酸消化法bzxz.net
此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。处理前，病变组织先按常规方法研磨或匀浆制成乳剂，将痰、尿、粪或病变组织等按1：5（样品：溶液，质量浓度）加人4%硫酸溶液充分混合，然后置37℃作用1h～2h，经1000g离心30min，弃上清液，取沉淀物涂片镜检、培养；也可用硫酸处理后，在沉淀物中滴加3%氢氧化钠溶液中和，然后涂片镜检或培养。硫酸消化法具体操作参见附录B的B.2。5.3.3.2氢氧化钠消化法
此法适用于痰、尿、粪和病变组织等的处理。消化处理前，病变组织先按常规方法制成乳剂。将被检的痰、尿、粪便或病变组织按1：5（样品：溶液，质量浓度）的比例加入氢氧化钠消化液中，混匀后37℃作用2h～3h，然后无菌滴加5%盐酸溶液（参见A.3）进行中和，将样本的pH值调到6.8左右（此时显淡黄绿色），以1000g，离心15min～20min，弃上清液，取沉淀物涂片镜检或培养。对痰液的消化浓缩还可采用以下处理方法：取4%氢氧化钠溶液50mL、0.1mol/L柠檬酸钠50mL、N-乙酰-L-半胱氨酸0.5g混合。将上述混合液与痰液按1：2的比例加人.作用24h~48h，以1000g离心15min，取沉淀物涂片镜检或培养。氢氧化钠消化法具体操作参见B.3。5.3.3.3安替福民（antiformin）沉淀浓缩法此法适用于痰、乳、精液和子宫分泌液等处理。将被检样品置于试管中，加人3倍～4倍量的15%～20%安替福民溶液，充分摇匀后37℃作用1h，加1倍~2倍量的灭菌蒸馏水，摇匀，1000g离心20min30min，弃上清液.沉淀物加蒸馏水恢复量后再离心一次，取沉淀物涂片镜检、培养。安替福民（antiformin）沉淀浓缩法具体操作参见B.4。5.4染色镜检
5.4.1涂片
先在玻片上涂布一层薄甘油蛋白，然后吸取处理好的样品滴加其上，涂布均勾。如被检样品为乳汁等含脂肪较多的材料，在涂片制成后，滴加二甲苯或乙醚，使其覆盖整个涂片，摇动1min～2min脱脂后倾去，再滴加95%酒精，以除去二甲苯，待酒精挥发后即可染色。甘油蛋白的配制方法参见A.45.4.2菱-尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色涂片经火焰固定后，滴加苯酚复红染色液，使其覆盖整个涂片。之后，将玻片置于火焰上加热至出现蒸汽但不产生气泡，保持热染色5min。如热染过程出现染色液干调，应及时添加，适量补充。充分水洗后滴加3%盐酸酒精脱色液，脱色30s~60s，至无色素脱下为止。充分水洗，以骆氏美蓝染色液复GB/T18645—2020
染1min。水洗，吹干，镜检。妻-尼氏（Ziehl-Neelsen）抗酸染色配制方法参见A.5。5.4.3结果判定
在显微镜下，可见细长平直或微弯曲的红色杆菌，长1.5um～5μm，宽0.2μm～0.5μm，即为阳性。在陈旧培养基或干酪性淋巴结内，偶尔可见长达10μm或更长菌体。否则判为阴性。5.5分离培养和生化鉴定
5.5.1分离培养
将经过处理的病料接种到配氏培养基（参见A.6）或改良L-J培养基（参见A.7）上，每份样品同时接种2管4管，在37℃培养1d后，以熔化的石蜡封口，继续培养至少8周（一般10周～12周）。结核分枝杆菌在固体培养基上生长，菌落干燥、粗糙，呈白色、黄色或橙色。牛分枝杆菌在固体培养基上菌落湿润、略显粗糙，加人1%的丙酮酸钠可促进其生长。禽分枝杆菌在固体培养基上形成湿润、弥漫状、光滑菌落。结核分枝杆菌和牛分枝杆菌在42℃不生长，禽分枝杆菌可在42℃生长，5.5.2生化鉴定
5.5.2.1对硝基苯甲酸（PNB)试验准备PNB培养基（参见A.8)1支，改良L-J培养基1支，每支培养基接种1μg细菌；37℃孵育4周，每周观察一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况。牛分枝杆菌、结核分枝杆菌在PNB培养基上不生长·禽分枝杆菌可在PNB培养基上生长；三种菌均可在改良L-J培养基生长。5.5.2.2噻吩-2-羧酸肼（TCH)抗性试验将细菌接种TCH培养基（参见A.9）和改良L-J培养基，37℃培养8周，1周后开始观察，每周观察一次结果并记录两种培养基上菌落的生长情况。禽分枝杆菌、结核分枝杆菌可在TCH培养基上生长牛分枝杆菌在TCH培养基上不生长；三种菌均可在改良L-J培养基生长。5.5.2.3尿素酶试验
准备两支试管，试管A加人3mLPBS(pH6.7，1/15mol/L)（参见A.10）和1滴0.1%酚红指示剂（参见A.11)：试管B加人用PBS（pH6.7.1/15mol/L)配制的0.12%尿素溶液（参见A.12）和1滴0.1%酚红指示剂。挑取细菌药5mg移置于试管B中。两支试管均置37C培养3d后观察结果。A管（空白对照)不变色，B管菌液生长使培养基变成红色判为阳性，培养基不变色者判为阴性。5.5.2.4硝酸盐还原试验
取细菌约5mg，置于装有2mL硝酸盐还原试验溶液（参见A.13）的试管中，充分混匀，置37℃水浴2h，滴加1滴2倍稀释的盐酸，2滴0.2%氨基苯磺胺（参见A.14），2滴0.1%N-甲基盐酸二氨基乙烯（参见A.15），混匀后观察结果，1min内呈红色判为阳性，颜色无变化判为阴性。5.5.2.5耐热接触酶试验
用生理盐水配制含菌量为10mg/mL的菌液，分装试管，每管0.5mL，分别置于68℃水浴20min，冷却后缓缓加人0.5mL过氧化氢（HzO2）和吐温-80混合液（10%吐温-80加等量30%H2O2），观察结果。如有小气泡持续从管底升起判为阳性，否则为阴性。5.5.2.6吐温-80水解试验
向吐温-80水解试验培养基（参见A.16）试管中加入含菌量为10mg/mL的菌液0.5mL。3d~5d4
GB/T18645—2020
后观察结果。如试管内溶液由原来的琥珀色变为桃红色或红色判为阳性，无颜色变化判为阴性。5.5.2.7生化鉴定
动物结核病涉及的分枝杆菌生化试验的判定结果见表1。表1分枝杆菌生化鉴定判定结果
生化试剂类型
牛分枝杆菌
禽分枝杆菌
结核分枝杆菌
对硝基苯甲酸
TCH抗性
尿素酶试验
硝酸盐还原
耐热接触酵
注：“十\表示阳性反应；“一\表示阴性反应：“士”表示多数菌株阳性反应，少数菌株阴性反应、5结核菌素皮内变态反应试验
6.1器材
吐温-80水解
剪毛剪或剃毛器、游标卡尺、一次性无菌注射器（0.5mm×10mm）或其他适用的商品化注射器6.2试剂
6.2.1牛型PPD
根据使用说明将原液用灭菌生理盐水或稀释用水稀释至使用浓度（20000IU/mL）。PPD冻干粉稀释：在无菌状态下吸取一定量的灭菌生理盐水或稀释用水，注入冻干粉玻璃瓶中，充分摇匀后使用，应现配现用）。
6.2.2禽型PPD
配制方法同6.2.1.使用浓度（25000IU/mL）。6.3牛分枝杆菌PPD皮内变态反应6.3.1操作方法
出生后20d的牛即可用本试验，可单独采用牛型PPD(PPD-B)，也可同时采用牛型PPD和禽型PPD(PPD-A)进行试验。皮内变态反应具体操作和观察步骤为：a）注射部位及术前处理：将牛只进行编号·采用颈侧中部上1/3处或尾根部进行皮内注射.3个月以内的特牛也可在肩脚部进行。对注射部位剪毛，直径约10cm，用卡尺测量术部中央皮皱厚度，做好记录。注意，注射部位应无明显的病变注射方法及剂量：牛型和禽型PPD的注射部位应间隔开，在颈部同侧、肩胛部同侧应间隔约b)
12cm～15cm，或在不同侧进行。尾根部采用不同侧（左侧或右侧）无毛的褶皱部进行注射，用75%酒精消毒注射部位，在皮内注入牛型PPD或禽型PPD0.1mL，牛型PPD不低于2000IU/0.1mL，禽型PPD不低于2500IU/0.1mL，或按试剂说明书配制的剂量。注射次数和观察反应：皮内注射后经72h判定，仔细观察局部有无热痛、肿胀等炎性反应，并c）
以卡尺测量皮皱厚度，做好详细记录。对疑似反应牛应立即在另一侧以同一批PPD同一剂量进行第二回皮内注射，再经72h观察反应结果。对阴性牛和疑似反应牛，于注射后96h和GB/T18645—2020
120h再分别观察一次，以防个别牛出现较晚的迟发型变态反应。6.3.2结果判定
牛型PPD单皮内变态反应及牛型PPD和禽型PPD比较皮内变态反应具体结果判定如下：a）牛型PPD单皮内变态反应
牛型PPD单皮内变态反应包括颈部注射和尾根部注射：颈部注射：注射部位前后出现明显的炎性反应，皮皱厚差值天于或等于4mm，判为阳性；无明显炎性反应，且皮皱厚差值为2mm~4mm，判为可疑；无明显炎性反应，皮皱厚值小于或等于2mm，判为阴性。对于已确认感染的牛群皮试出现任何可触摸或可见的肿胀反应均判为阳性。
尾根部注射：出现可触摸或可见的炎性反应（当出现两侧褶皱部时，注射一侧的褶皱部与对侧的褶皱部厚度差达4mm及以上；当仅出现一侧皱部时，其尾褶厚度达8mm及以上）判为阳性，未出现可触摸或可见的炎性反应判为阴性。b）牛型PPD和禽型PPD比较皮内变态反应注射牛型PPD部位的皮皱厚差大于注射禽型PPD部位的皮皱厚差值大于4mm，判为阳性；注射牛型PPD部位的皮皱厚差大于注射禽型PPD部位的皮皱厚差值在4mm以下，判为可疑；注射牛型PPD部位的皮皱厚值等于或小于注射禽型PPD部位的皮皱厚，判为阴性。6.3.3复检
判为可疑反应的，于42d后进行复检。结果仍为可疑或阳性的，判为阳性。6.4禽分枝杆菌PPD皮内变态反应6.4.1操作方法
家禽可在肉毒皮内注射禽型PPD.剂量为每羽0.1mL，约2500IU或按试剂说明书配制的剂量。6.4.2结果判定
注射后24h观察判定结果。注射部位肿胀，出现硬结，扩展至对侧肉幕和颈部的广泛性水肿等炎性反应，判为阳性；注射部位无肿胀等炎性反应，判为阴性。6.5其他动物结核皮内变态反应
鹿、猪、羊等其他中大动物的皮内变态反应试验参照牛的皮内变态反应试验进行判定。其中鹿的注射部位为颈侧中部；猪、绵羊在耳根外侧注射；山羊在肩肿部注射7PCR检测
7.1器材
PCR仪、PCR反应管、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统或紫外透射仪、恒温水浴箱、烘箱、台式冷冻离心机（离心力可达15000g）、旋涡混匀器、冰箱（2℃～8℃，一20℃，一80℃）、微量可调移液器（10L，100μL，1000μL）及配套带滤芯吸嘴。7.2试剂
7.2.12XPCR反应液：含TaqPolymerase0.1U/μL，dATP、dTTP、dCTP和dGTP各500μmol/L，20mmol/LTris-HCL（pH8.3），1o0mmol/L氯化钾，3mmol/L氯化镁。也可采用等效商品化试剂6
GB/T18645—2020
7.2.2PCR扩增引物序列：动物结核病中涉及的分枝杆菌PCR扩增引物及序列信息见表2。表2：
分枝杆菌引物名称及序列
目标菌名称
牛分枝杆菌
结核分枝杆菌
禽分枝杆菌
7.2.3灭菌双蒸水。
引物名称
IS1245-1
IS1245-2
IS901-1
ZCIS901-2
引物序列
上游引物：5-ACGCGACGACCTCATATTCC-3下游引物：5-CACCCAGAAGGCGAACAGAT-3上游引物：5\-TTCCGAATCCCTTGTGA-3下游引物：5\-AGTCGCCGTGGCTTCTCTTTTA-3上游引物：51-GACTTCTACAAGGAGCTGGG-3下游引物：5'-GAGACCGCCTTGAATCGTTC-3上游引物：5-GAGTTGACCGCGTTCATCG-3下游引物：5°-CGTCGAGGAAGACATACGG-3E游引物：5-GGATTGCTAACCACGTGGTG-3下游引物：5°-GCGAGTTGCTTGATGAGCG-37.2.4电泳试剂：Goldview或其他等效核酸染料，DNA标准相对分子质量（100bp～1kb）、Tris-乙酸（TAE)电泳缓冲液，2%琼脂糖凝胶，配制方法参见附录A。7.3
采样及样品处理
采样及样品处理按附录C的规定执行。其涉及的样品采集、包装和运输按附录F的规定执行。7.4PCR扩增反应
7.4.1PCR扩增试剂准备
取出2XPCR反应液、引物，在室温下融化，瞬时离心5s后置冰上。或采用其他等效商品化PCR反应试剂。PCR反应混合液的试剂及用量见表3。表3PCR反应混合液的成分及用量试剂
2×PCR反应液
PCR引物(10μmol/L)
每种引物1μ
灭菌双蒸水
补充反应体系至24μL
可根据需要选择牛分枝杆菌、结核分枝杆菌以及禽分枝杆菌进行PCR检测。对于牛分枝杆菌，每个PCR反应混合液中加MB上下游引物（10umol/L)各1μL；对于结核分枝杆菌，每个PCR反应混合液中加CSB上下游引物（10μmol/L)各1μL；对于禽分枝杆菌，每个PCR反应混合液中加人DnaJ上下游引物（10μmol/L）、IS1245上下游引物（10μmol/L）、IS901上下游引物（10μmol/L）各1μL。7.4.2加模板
在上述PCR反应混合液中分别加入已提取好的样品或对照核酸1μL.充分混勾。7.4.3PCR扩增检测
牛分枝杆菌或结核分枝杆菌PCR反应条件：第一步，94℃，3min；第二步，94℃，20s，牛分枝杆菌
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