GB/T 19423-2020.Determination of nicarbazin in feeds.
1范围
GB/T 19423描述了饲料中尼卡巴嗪的高效液相色谱和液相色谱-串联质谱测定方法。
GB/T 19423适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中尼卡巴嗪的测定。
GB/T 19423高效液相色谱法中配合饲料、浓缩饲料的检出限为0.5mg/kg,定量限为1mg/kg,添加剂预混合饲料的检出限为1mg/kg,定量限为2mg/kg;液相色谱-串联质谱法的检出限为0.02mg/kg,定量限为0.05 mg/kg.
2规范性引用文件
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GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 20195动物饲料试样 的制备
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4高效液相色谱法
4.1原理
试样中的尼卡巴嗪用甲醇-乙腈混合溶液提取,经MAX固相萃取小柱净化后,用高效液相色谱仪检测,外标法定量。
4.2试剂或材料
除非另有规定,仅使用分析纯试剂。
4.2.1水:GB/T 6682,一级。
4.2.2乙 腈:色谱纯。
4.2.3提取溶液:甲醇十乙腈=50+ 50。
4.2.4
80%乙腈溶液:准确量取80 mL乙腈(4.2.2),加水定容至100 mL,混匀。
4.2.5氢氧化 钠溶液(0.2 mol/L):准确量取0.8 g氢氧化钠,用水稀释并定容至100 mL,混匀。
4.2.6 4%甲 酸乙腈溶液:准确量取4 mL甲酸,用乙腈(4.2.2)稀释并定容至100 mL,混匀。

ICS65.120
CCSB46
中华人民共和国国家标准
GB/T19423—2020
代替GB/T19423—2003
饲料中尼卡巴嗪的测定
Determination of nicarbazin in feeds2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-07-01实施
GB/T19423—2020
本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
本文件代替GB/T19423—2003《饲料中尼卡巴嗪的测定高效液相色谱法》，与GB/T19423-2003相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：增加了液相色谱-串联质谱测定方法（见第5章）；更改了高效液相色谱法的检出限，增加了定量限（见第1章，2003年版的第1章）；—更改了高效液相色谱法的提取和净化方法（见4.5.1、4.5.2，2003年版的7.1)；更改了高效液相色谱法的试验数据处理（见4.6，2003年版的7.4）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)提出并归口。本文件起草单位：广东省农业科学院农产品公共监测中心、浙江省兽药饲料监察所、贵州省兽药饲料检测所。
本文件主要起草人：王威利、丁晨红、张志健、赵贵、万凯、王旭、李亚菲、苏秋权、林雪贤、章厉勘、侯轩、黄晓梅、殷秋妙、梁锐、崔泽锋、谢丽丽、王英。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：-GB/T19423—2003。
1范围
饲料中尼卡巴嗪的测定
本文件描述了饲料中尼卡巴嗪的高效液相色谱和液相色谱-串联质谱测定方法。本文件适用于配合饲料、浓缩饲料和添加剂预混合饲料中尼卡巴嗪的测定GB/T19423-—2020
本文件高效液相色谱法中配合饲料、浓缩饲料的检出限为0.5mg/kg，定量限为1mg/kg，添加剂预混合饲料的检出限为1mg/kg，定量限为2mg/kg；液相色谱-串联质谱法的检出限为0.02mg/kg，定量限为0.05mg/kg。
规范性引用文件
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GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T20195动物饲料试样的制备
术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。4高效液相色谱法
4.1原理
试样中的尼卡巴嗪用甲醇-乙睛混合溶液提取，经MAX固相萃取小柱净化后，用高效液相色谱仪检测，外标法定量。
4.2试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。4.2.1水：GB/T6682，一级。
4.2.2乙：色谱纯
4.2.3提取溶液：甲醇+乙睛=50+50。4.2.480%乙腈溶液：准确量取80mL乙腈（4.2.2），加水定容至100mL，混匀。4.2.5氢氧化钠溶液（0.2mol/L）：准确量取0.8g氢氧化钠，用水稀释并定容至100mL，混匀。4.2.64%甲酸乙睛溶液：准确量取4mL甲酸，用乙睛（4.2.2）稀释并定容至100mL.混勾4.2.7标准储备溶液（1000μg/mL）：称取尼卡巴嗪（Nicarbazin，CiHisNO。CAS号：330-95-0，含量不低于99%）标准品10mg（精确至0.01mg）于10mL容量瓶中，加人2mL二甲基亚溶解，用乙（4.2.2)定容，摇匀，于一18℃以下保存，有效期为3个月4.2.8标准中间溶液（100μg/mL）：准确量取标准储备溶液（4.2.7)1mL，置于10mL容量瓶中，用乙1
GB/T19423—2020
晴（4.2.2）稀释至刻度，于一18℃以下保存，有效期为3个月4.2.9标准系列溶液：准确移取适量标准中间溶液（4.2.8）于10mL容量瓶中，用80%乙睛溶液（4.2.4）稀释定容配成标准系列溶液，质量浓度分别为：0.04μg/mL0.1ug/mL、0.2.μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL，临用现配。4.2.10MAX固相萃取小柱：60mg/3mL，或性能相当者。4.2.11微孔滤膜：0.45μm，有机系。4.3
仪器设备
高效液相色谱仪：配紫外检测器/二极管阵列检测器4.3.2
分析天平：感量0.001g和0.01mg。涡漩混合器。
氮吹仪。
超声波清洗机
冷冻离心机：转速不低于8000r/min。固相萃取装置
4样品
按GB/T20195制备试样，至少200g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混勾，装人磨口瓶中保存，备用。
试验步骤
4.5.1提取
平行做两份试验，称取试样2g（添加剂预混合饲料0.2g～1g尼卡巴嗪含量小于10mg）.精确至0.001g，于50mL离心管中，准确加人25mL提取溶液（4.2.3），涡漩混匀1min.置于50℃水浴超声提取20min，每隔5min充分振荡一次。于8000r/min离心5min。取上清液于50mL离心管中，残渣用25mL提取溶液（4.2.3）重复提取一次.合并两次提取液，混匀。准确移取5mL提取液于15mL离心管中，加人0.2mL氢氧化钠溶液（4.2.5），涡漩混匀后，得到试样待净化溶液，备用。注：当添加剂预混合饲料中尼卡巴嗪含量大于1%时，建议适当减少称样量（试样中约相当于尼卡巴嗪含量10mg）进行测定。
4.5.2净化
MAX固相萃取小柱（4.2.10)先用3mL提取溶液（4.2.3)预淋洗。将4.5.1得到的试样待净化溶液全部过柱，抽干。用5mL4%甲酸乙腈溶液（4.2.6）洗脱，收集洗脱液，于50℃水浴中氮气吹至少于2mL，用80%乙睛溶液（4.2.4）定容至5mL，涡漩混匀后过0.45um微孔滤膜，得到试样溶液，用高效液相色谱仪测定。
4.5.3测定
4.5.3.1高效液相色谱参考条件
色谱柱：Cls柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5.0um；或性能相当者。流动相：乙腈+水=50+50。
流速：1.0mL/min。
柱温：30℃。
进样量：20μL。
检测波长：350nm。
4.5.3.2标准系列溶液和试样溶液测定GB/T19423-—2020
在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（4.2.9）和4.5.2得到的试样溶液上机测定。尼卡巴嗪标准溶液的高相液相色谱图见附录A。4.5.3.3定性
以保留时间定性，试样溶液中尼卡巴嗪保留时间应与标准系列溶液中尼卡巴嗪的保留时间一致，其相对偏差在士2.5%之内。
4.5.3.4定量
以尼卡巴嗪标准系列溶液中的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数不应低于0.99。试样溶液与标准溶液中尼卡巴嗪的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应将试样提取液用提取溶液（4.2.3)稀释（稀释倍数n）至线性范围内，重新试验。单点校准定量时，试样溶液中尼卡巴嗪的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%4.6试验数据处理
试样中尼卡巴嗪的含量以质量分数计。多点校准按公式（1）计算，单点校准按公式（2）计算：w=P:×V/×V×1 000
m×VzX1000
式中：
试样中尼卡巴嗪的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；p
......(1)
从标准曲线查得的试样溶液中尼卡巴嗪的质量浓度，单位为微克每毫升（ug/mL)；试样提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）：V
试样定容的体积，单位为毫升（mL）：V2
式中：
用于净化的试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；试样的质量，单位为克（g）；
超出线性范围后，需要进一步稀释的倍数。A×V×V:×p×1000
A.XV,XmX1 000
试样中尼卡巴嗪的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；试样溶液中尼卡巴嗪的峰面积；试样提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）：试样定容的体积，单位为毫升（mL)；标准溶液中尼卡巴嗪的质量浓度，单位为微克每毫升（g/mL）标准溶液中尼卡巴嗪的峰面积；用于净化的试样提取液的体积，单位为毫升（mL)；V
试样的质量，单位为克（g)；
超出线性范围后，需要进一步稀释的倍数。测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。（2）
GB/T19423—2020
精密度
在重复性条件下，两次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的10%。5液相色谱-串联质谱法
5.1原理
试样中的尼卡巴嗪用甲醇-乙睛混合溶液提取，经MAX固相萃取小柱净化后，用液相色谱-串联质谱仪检测，基质匹配外标法定量。5.2
2试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.2.1水GB/T6682，—级。
5.2.2乙腈：色谱纯、
提取溶液：甲醇十乙睛=50十50。5.2.4氢氧化钠溶液（0.2mol/L）：准确量取0.8g氢氧化钠.用水稀释并定容至100mL混匀。5.2.54%甲酸乙腈溶液：准确量取4mL甲酸，用乙腈（5.2.2）稀释并定容至100mL，混匀。5.2.6标准储备溶液（1000μg/mL）：同4.2.7。5.2.7标准中间溶液（10μg/mL）：准确量取标准储备溶液（5.2.6)0.1mL，置于10mL容量瓶中，用乙睛（5.2.2）稀释至刻度，于一18℃以下保存，有效期为3个月5.2.8标准工作溶液（1μg/mL）：准确量取标准中间溶液（5.2.7)1.0mL，置于10mL容量瓶中，用乙睛（5.2.2）稀释至刻度，于一18℃以下保存，有效期为1个月。5.2.9MAX固相萃取小柱：60mg/3mL，或性能相当者。5.2.10
微孔滤膜：0.22um，有机系。
仪器设备
液相色谱-串联质谱：配有电喷雾离子源。5.3.2
分析天平：感量0.001g和0.01mg。5.3.3
涡漩混合器。
5.3.4超声波清洗机，
5.3.5冷冻离心机：转速不低于8000r/min。5.3.6固相萃取装置。
5.4样品
按GB/T20195制备样品，至少200g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混勾，装入磨口瓶中保存，备用。选取与待测样品类型相同，均匀一致，且在待测物保留时间处仪器响应值小于方法定量限30%的饲料样品，作为空白样品。5.5
试验步骤
5.5.1提取
平行做两份试验。称取试样2g（添加剂预混合饲料1g），精确至0.001g，于50mL离心管中，准确加入25mL提取溶液（5.2.3），涡漩混匀1min，置于50℃水浴超声提取20min，每隔5min充分振荡4
GB/T19423-—2020
次。于8000r/min离心5min。取上清液于100mL容量瓶中，残渣用25mL提取溶液（5.2.3）重复提取一次，合并两次提取液，用提取溶液（5.2.3）定容至刻度，混匀。准确移取2mL提取液于15mL离心管中，加人0.1mL氢氧化钠溶液（5.2.4），涡漩混匀后，得到试样待净化溶液，备用。注：当添加剂预混合饲料中尼卡巴嗪含量大于1%时，建议适当减少称样量（试样中约相当于尼卡巴嗪含量10mg）进行测定。
5.5.2净化
MAX固相萃取小柱（5.2.9)先用3mL提取溶液（5.2.3）预淋洗。将5.5.1得到的试样待净化溶液全部过柱，抽干，准确加入5mL4%甲酸乙睛溶液（5.2.5）洗脱，收集洗脱液，准确移取洗脱液2mL，用乙（5.2.2）定容至10mL，混匀后过0.22um微孔滤膜，得到试样溶液，用液相色谱-串联质谱仪测定。5.5.3基质匹配标准系列溶液的制备称取基质空白试样，按照5.5.1和5.5.2处理得到空白试样溶液。取适量的标准工作溶液（5.2.8），以空白基质溶液进行稀释，配制成质量浓度分别为0.04ng/mL、0.1ng/mL、0.2/ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL和50ng/mL基质匹配标准系列溶液，待测，临用现配，5.5.4测定
液相色谱参考条件
色谱柱：C18柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径2.7um，或性能相当者。柱温：30℃。
流速：0.3mL/min。
进样量：5uL。
流动相：A：水；B：乙睛。梯度洗脱程序见表1。表1梯度洗脱程序
2质谱参考条件
电离方式：电喷雾电离，负离子模式（ESI-）。检测方式：多反应监测（MRM）。毛细管电压：4.5kV。
离子源温度：400℃。
脱溶剂温度：526℃。
GB/T19423—2020
干燥气流量：氟气600L/h
尼卡巴嗪的定性、定量离子对及其他参考质谱条件等见表2。表2尼卡巴嗪的定性、定量离子对及其他参考质谱条件被测物名称
尼卡巴嗪
为定量离子
监测离子对
300.90>137.05
300.90>107.05
5.5.4.3基质匹配标准系列溶液和试样溶液测定锥孔电压
碰撞能量
在仪器的最佳条件下，分别取基质匹配标准系列溶液（5.5.3）和5.5.2得到的试样溶液上机测定尼卡巴嗪标准溶液定量离子质量色谱图见附录B5.5.4.4定性
在相同试验条件下，试样溶液与基质匹配标准系列溶液中尼卡巴嗪的保留时间相对偏差应在2.5%之内。根据表2选择的定性离子对，比较试样谱图中尼卡巴嗪定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质匹配标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度，若偏差不超过表3规定的范围：则可判定为样品中存在对应的尼卡巴嗪。表3定性测定时相对离子丰度的最天充许偏差相对离子丰度/%
最大允许偏差/%
5.5.4.5定量
20~50（含）
10~20（含）
以尼卡巴嗪基质匹配标准系列溶液的浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，标准曲线的相关系数不应低于0.99。试样溶液与标准溶液中尼卡巴嗪的响应值均应在仪器检测的线性范围内，如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液和基质匹配标准溶液用提取溶液（5.2.3)稀释（稀释倍数n）至线性范围内，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中尼卡巴嗪的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。
试验数据处理
试样中尼卡巴嗪的含量以质量分数计。多点校准按公式（3)计算，单点校准按公式（4)计算：p,xVixV
mxV.x1000×n
式中：
试样中尼卡巴嗪的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；p
从标准曲线查得的试样溶液中尼卡巴嗪的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；试样提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）；试样定容的体积，单位为毫升（mL）；（3）
式中：
试样的质量，单位为克（g）；
用于净化的试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；超出线性范围后，需要进一步稀释的倍数。AxVixVXp
w=A.xV.xmx1000
试样中尼卡巴嗪的含量，单位为毫克每千克（mg/kg)；试样溶液中尼卡巴嗪的峰面积；试样提取溶液的总体积，单位为毫升（mL）；试样定容的体积，单位为毫升（mL）；标准溶液中尼卡巴嗪的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；标准溶液中尼卡巴嗪的峰面积；用于净化的试样提取液的体积，单位为毫升（mL）；试样的质量，单位为克（g）；
超出线性范围后，需要进一步稀释的倍数测定结果用平行测定的算术平均值表示，计算结果保留三位有效数字。精密度
GB/T19423-—2020
.（4)
在重复性条件下，两次独立测试结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的15%。GB/T19423—2020
附录A
（资料性）
尼卡巴标准溶液的高效液相色谱图尼卡巴嗪标准溶液的高效液相色谱图见图A.1。1.25核测器4.350 mm
间/min
尼卡巴嗪标准溶液（0.1μg/mL）的高效液相色谱图20.0
附录B
（资料性）
尼卡巴嗪标准溶液的定量离子质量色谱图尼卡巴嗪标准溶液的定量离子质量色谱图见图B.1。:1:300. 9000>137. 0500()
100000-
90 000:
80 000-
推70 000:
50 000
30 000-
20 000:wwW.bzxz.Net
10 000-
6767/0098/1
时间/min
GB/T19423—2020
尼卡巴嗪标准溶液（2ng/mL）的定量离子质量色谱图7.0
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