GB/T 19180-2020.Diagnostic techniques for bovine spongiform encephalopathy.
1范围
GB/T 19180规定了BSE诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求。
GB/T 19180适用于BSE的诊断,其中临床诊断适用于BSE的监测和流行病学调查,H●E组织病理染色法适用于BSE中枢神经系统的病理诊断,免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于BSE的病原学诊断。
2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSE:牛海绵状脑病( Bovine Spongiform Encephalopathy)
H●E:苏木精伊红(Hematoxylin and eosin)
HRP :辣根过氧化物酶( Horseradish peroxidase)
PBS:磷酸盐缓冲溶液(Phosphate buffered solution)
PK酶:蛋白酶K(Proteinase K)
PVDF :聚偏氟乙烯(Polyvinylidene fluoride)
SDS:十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)
TBST :等渗缓冲盐溶液(Tris-HCl buffered solution with Tween)
3临床诊断
3.1易感动物
牛科和猫科动物，包括各种牛、各种羊和各种猫科动物。
3.2临床症状
3.2.1行为异常
表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁;不自主运动,如磨牙、震颤;不愿经过有缝隙的地面或进人畜栏等。
3.2.2感觉或反应过敏
表现为视、听、触三觉过于敏感。对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感,这是BSE病牛的特征性临床表现。
3.2.3 运动异常
病牛步态呈“鹅步”状,共济失调,四肢伸展过度,有时倒地,难以站立。
3.2.4体 重和体况下降
病牛的体重和体况下降,表现出异常消瘦,体质虚弱。

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T19180—2020
代替GB/T19180—2003
牛海绵状脑病诊断技术
Diagnostic techniques for bovine spongiform encephalopathy2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。GB/T19180—2020
本标准代替GB/T19180—2003《牛海绵状脑病诊断技术》。本标准与GB/T19180—2003相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：一一增补了H·E组织病理染色法、免疫组织化学方法和免疫印迹方法的适用范围，删除了“也可用于其他动物的传染性海绵状脑病的诊断”（见第1章）；优化了临床症状的描述（见4.3）；优化了H·E组织病理染色法操作步骤（见5.1)和免疫组织化学方法操作步骤（见5.2）；一增补了免疫印迹方法（见5.3）。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：王志亮、刘雨田、孙成友、迟田英、宋芳芳、邹艳丽、于小静、吴晓东、王树双本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-GB/T19180—2003。
GB/T19180—2020
牛海绵状脑病（BovineSpongiformEncephalopathy，BSE）是由病毒引起的牛的一种慢性致死性神经性疾病，对动物和人构成较大危害。世界动物卫生组织（OIE）将其列为严重影响国际贸易的动物疫病之，我国将其归为一类动物疫病。我国现行《牛海绵状脑病诊断技术》（GB/T19180一2003）系2003年6月4日由原国家质量监督检验检疫总局发布，2003年12月1日起实施。该标准仅包括临床症状、组织病理学、免疫组织化学等三种诊断方法，未包括E陆生动物手册指定的另一种确诊方法即免疫印迹。免疫印迹方法比免疫组织化学方法更灵敏，特异性更好。因此，免疫印迹方法是牛海绵状脑病诊断技术中一种更好的确诊方法，它能更好地服务于我国疯牛病的监测工作BSE分为典型BSE和非典型BSE。典型BSE是由于牛采食污染牛羊病毒的肉骨粉或者饲料而引起，非典型BSE为自然发生的一种散发性BSE。自然条件下，BSE经由消化道传播，未发现水平和重直传播的证据。典型BSE的潜伏期一般为2年～8年，平均为4年～5年，多发于4～6岁的牛，2岁以下罕见，6岁以上明显减少。根据病原的分子量大小，非典型BSE又分为H型和L型。非典型BSE的平均发病年龄为11岁。BSE病程多为数月至一年，最终死亡。大多数BSE病牛无典型临床症状，因此BSE的诊断应通过实验室检测来实现。BSE的病原是动物机体内脱蛋白的异构体，在病牛血清里检测不到BSE病毒抗体，所以血清学检测方法对于BSE来说是无意义的。目前，实验室诊断方法多以检测BSE病原为目的，包括免疫组织化学方法、免疫印迹方法、ELISA方法等，其中免疫组织化学方法和免疫印迹方法是OIE手册规定的BSE确诊方法。BSE病牛的中枢神经被病毒侵害会出现海绵状空泡变性，在中枢神经保存良好且未发生自溶的情况下，应用H·E组织病理染色法可以观察到这些病变情况。OIE手册规定H·E组织病理染色法是确诊BSE的辅助方法，在使用免疫组织化学方法诊断BSE时应同时使用H·E组织病理染色法予以辅助确诊；在使用免疫印迹方法诊断BSE时，如果样品适合进行H·E组织病理染色，那么也应同时使用H·E组织病理染色法予以辅助确诊。1范围
牛海绵状脑病诊断技术
本标准规定了BSE诊断的临床诊断、实验室诊断及综合判定技术要求GB/T19180—2020
本标准适用于BSE的诊断,其中临床诊断适用于BSE的监测和流行病学调查，H·E组织病理染色法适用于BSE中枢神经系统的病理诊断，免疫组织化学方法和免疫印迹方法适用于BSE的病原学诊断。
缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSE：牛海绵状脑病（BovineSpongiformEncephalopathy）H·E：苏木精伊红（Hematoxylinandeosin）HRP：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase）PBS：磷酸盐缓冲溶液（Phosphatebufferedsolution）PK酶：蛋白酶K(ProteinaseK)）PVDF：聚偏氟乙烯（Polyvinylidenefluoride）SDS：十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate）TBST：等渗缓冲盐溶液（Tris-HCIbufferedsolutionwithTween）临床诊断
易感动物
牛科和猫科动物，包括各种牛、各种羊和各种猫科动物3.2临床症状
3.2.1行为异常
表现为不安、恐惧、异常震惊或沉郁；不自主运动，如磨牙、震颤；不愿经过有缝隙的地面或进人畜栏等。
3.2.2感觉或反应过敏
表现为视、听、触三觉过于敏感。对光线的明暗变化、外部声响以及颈部触摸过度敏感，这是BSE病牛的特征性临床表现。
3.2.3运动异常
病牛步态呈“鹅步”状，共济失调，四肢伸展过度，有时倒地，难以站立。3.2.4体重和体况下降
病牛的体重和体况下降，表现出异常消瘦，体质虚弱GB/T19180—2020
3病理变化
剖检无明显病变。
结果判定
易感动物出现上述临床症状，又不能确定为其他疾病时，可判定为疑似BSE。确诊应采集易感动物的脑组织进行实验室诊断。4实验室诊断
4.1H·E组织病理染色法
4.1.1实验室生物安全要求
实验操作应在生物安全Ⅱ级以上的实验室进行。涉及有毒挥发性试剂的操作应在通风橱中进行，如甲醛、甲酸、二甲苯、氯仿等。4.1.2仪器设备
显微镜、切片机、电锯/钢锯、骨钳、眼科剪、直形镊（长约25cm）、手术刀、切片刀、烘烤箱、脱水筐、染色缸、包埋模具、载玻片、盖玻片、玻璃棒、染色架、量筒（量程分别为100mL、1000mL、5000mL）、通风橱。
4.1.3试剂
4.1.3.1蒸馏水。
10%中性福尔马林固定液（见附录A中A.1)。无水乙醇。
二甲苯。
氯仿。
软蜡（熔点56℃）。
硬蜡（熔点60℃）。
苏木素染液（H·E染液，见A.2）。1%盐酸酒精（见A.3）。
饱和碳酸锂水溶液（见A.4）。
95%酒精伊红溶液（见A.5）。
中性树胶。
无机试剂原料均为分析纯。
4.1.4采样
将牛头固定，用电锯从前额两牛角根部向枕骨大孔背侧缘方向锯开，使脑部暴露。剪开脑膜并切断所有与脑部相连的神经和血管，取出整脑，包括大脑、小脑和完整脑干。大规模监测采样时，可用专用采样（国家牛海绵状脑病参考实验室提供）从枕骨大孔处取出延脑部组织即可。采样勺取样时，先上下左右四个方向剪开脑硬膜，再用戴一次性乳胶手套的手指绕延脑转一转以切断脑神经和血管，然后紧贴颅腔壁插入采样勺，插入深度约5cm～7cm。用力将采样勺的手柄往上翘，再往下切断脑组织，然后左右切断脑组织，最后将切下的脑组织往外出2
4.1.5固定
GB/T19180—2020
将所有组织直接放入10倍体积的10%中性福尔马林固定液中渗透固定96h，换新配制的固定液再固定48h。
4.1.6组织切片制作
4.1.6.1取材
把大脑、小脑、脑干组织分离开，分别横切成3mm～5mm厚的组织块，选取以下部位组织做进步处理，包括大脑、小脑、脑桥、丘脑、四叠体、脑门、延髓。适当修剪这七块用于检测的组织边角以适用脱水筐大小，剩余组织继续固定以备用。用脱水筐装好检测用的组织块，并用铅笔做好标记，盖好脱水筐盖。投人新配制的10倍体积的固定液再固定72h。4.1.6.2甲酸处理
将装有组织块的脱水筐移入98%甲酸中作用1h，自来水冲洗20min，然后再移人新配制固定液中处理3h。
4.1.6.3脱甲醛
将装有组织块的脱水筐放人染色缸中，用缓慢流动的自来水漂洗24h。4.1.6.4脱水
将装有组织块的脱水筐放人染色缸中，依次在以下梯度酒精中分别脱水：75%酒精浸泡2h。
b）85%酒精浸泡2h。
95%酒精I浸泡2h。
d）95%酒精Ⅱ浸泡2h。
100%酒精I浸泡2h。
100%酒精Ⅱ浸泡2h。
5透明
4.1.6.5.1
氯仿I浸泡2.5h或者二甲苯I浸泡40min。4.1.6.5.2
氯仿Ⅱ浸泡3h或者二甲苯浸泡30min。4.1.6.6
依次在以下石蜡中浸蜡，温度为60℃：软蜡I浸泡40min。
b）：车
软蜡Ⅱ浸泡1h。
硬蜡浸泡1h。
4.1.6.7.1若包埋模具为金属条结构的，则先组装好包埋模具，放置在光滑平整的金属台面上，再将熔化的新硬蜡倒人包埋模具里，直至倒满，然后将浸好蜡的组织块放入其中（待切片的一面朝下，并放平整）。如果一个模具里可以放置多个组织，则两个组织之间距离应大于1.5cm。冷却过夜，用切片刀修3
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切成形，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。4.1.6.7.2如果包埋模具为凹型的用于单个组织包埋的模具（常见包埋机所用模具），则先将模具加热至70℃，放置在同样温度的金属台面上，然后滴满熔化的新硬蜡，再将浸好蜡的组织块放入其中（待切片的一面朝下，并放平整），用去除盖子的脱水筐（尺寸与包埋模具匹配）放于其上，最后将整个包埋模具（包括组织等）平移至冷台上。待冷却好后，将脱水筐从包埋模具中取出，获得平整的石蜡组织块，然后给每个组织块贴上标签。
4.1.6.8切片
将石蜡组织块切成5um厚的组织薄片。每块组织连续切片3片～10片，切片刀、碎屑和废弃组织应焚烧处理。组织薄片用干净的粘附剂预处理过的载玻片贴片（组织应贴在磨砂面/标记面的同侧，以便给玻片做标记)，然后用铅笔在载玻片上做好标记，4.1.6.9烤片
贴好组织薄片的载玻片先在自然条件下晾于，然后放人烘烤箱中50C烘烤4h以上。4.1.7组织染色
脱蜡和脱二甲苯
取烘烤好的玻片整齐放人染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：二甲苯I10min。
二甲苯IⅡI10min。
100%酒精I2min。
100%酒精2min。
95%酒精I2min。
95%酒精Ⅱ2min。
85%酒精2min。
75%酒精2min。
自来水洗2min。
H·E染色
4.1.7.2.1
4.1.7.2.2
4.1.7.2.3
4.1.7.2.4
4.1.7.2.5
4.1.7.2.6
4.1.7.2.7
4.1.7.2.8
4.1.7.2.9
苏木素染液15min。
自来水漂洗2min。
1%盐酸酒精10s。
自来水漂洗5min。
饱和碳酸锂水溶液30 s。
自来水漂洗10min。
75%酒精2min。
85%酒精2min
95%酒精伊红液1min。
脱水和透明
4.1.7.3.1
4.1.7.3.2
95%酒精2min。
100%酒精12min
3100%酒精Ⅱ2min。
4.1.7.3.3
二甲苯I2min。
4.1.7.3.4
4.1.7.3.5
二甲苯Ⅱ2min。
4.1.7.4封片
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用干净玻璃棒取一滴中性树胶，滴加在玻片的组织上，再用干净的盖玻片进行封片，放置在平整的台面上使其自然干燥。
5镜检及判定bzxZ.net
4.1.7.5.1分别在倍数为10×10、10×20和10X40的光学显微镜下观察切片。4.1.7.5.2阳性结果。灰质区出现空泡变性，特别是神经纤维网浆和神经细胞内有规则的圆形或卵圆形空泡，空泡内不着色或被伊红淡染，界限明显，胞核被挤压于一侧，甚至消失；有的神经细胞被单个或多个特异性空泡胀大，成为“气球样”空泡性神经细胞。容易出现空泡病变的部位是中脑和延髓的核群且呈双侧对称性分布。
4.1.7.5.3阴性结果。灰质区无特征性空泡变性。4.1.7.5.4在正常情况下，动眼神经核和红核处的核周质也可能有少量空泡出现，但不呈双侧对称，应注意区别。若在脑干灰质区未发现双侧对称性海绵状空泡病变，则用免疫组织化学方法做进一步诊断，组织病理学诊断只是疯牛病确诊的辅助方法，确诊时应结合免疫组织化学或免疫印迹诊断方法。4.2免疫组织化学方法
4.2.1实验室生物安全要求
见4.1.1。
4.2.2仪器设备
见4.1.2。另外，还需要高压锅（温度能达到134℃）、水浴锅、恒温箱、冰箱（含冷冻和冷藏）、电磁炉、金属锅（烧水用）、陶瓷锅（直径不少于18cm）、湿盒（在玻片盒的底部铺上湿的吸水纸便成了湿盒）、微量移液器（量程分别为0.5μ~10μ5μ～50μ、10μ100μ、50μ～200μ、100μ～1000μ）。4.2.3试剂
4.2.3.1蒸馏水。
10%中性福尔马林固定液（见A.1）。无水乙醇。
二甲苯。
氯仿。
软蜡（熔点56℃）。
硬蜡（熔点60℃）。
蛋白酶K缓冲液（见附录B中B.1)蛋白酶K工作液（见B.2）。
高压缓冲液（见B.3）。
4.2.3.113%双氧水-甲醇（见B.4，如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中的试剂)。
4.2.3.120.1mol/LPBS(见B.5)。5
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35%正常猪血清（见B.6，如果免疫组织化学显色试剂盒中带有类似的试剂，则使用试剂盒中的试剂，但不得使用反自动物源性血清）。4.2.3.14Mayer氏苏木素液（商品化产品）。4.2.3.15
水溶性封片剂（商品化产品）。二步法免疫组织化学显色试剂盒（商品化产品，其中二抗应为抗鼠二抗）。一抗（商品化产品）工作液（见B.7）。4.2.3.18
8无机试剂原料均为分析纯。
4.2.4采样
见4.1.4。
4.2.5固定
见4.1.5。
4.2.6组织切片制作
见4.1.6。
4.2.7免疫组织化学操作步骤
4.2.7.1设置对照。免疫组织化学诊断应设置疯牛病阳性和阴性对照组织切片。4.2.7.2脱蜡和脱二甲苯。取烘烤好的玻片和对照切片整齐放人染色架上，依次在以下试剂中脱蜡和脱二甲苯：
a）二甲苯I10min。
b）二甲苯Ⅱ10min。
100%酒精12min。
100%酒精Ⅱ2min。
e）95%酒精I2min。
95%酒精Ⅱ2min
85%酒精2min。
75%酒精2min。
自来水洗2min。
3从自来水中取出装有玻片的染色架，在PBS中洗5minX3次。在洗第一次PBS的同时，配制4.2.7.3
适量的蛋白酶K缓冲液，并放入水浴锅中预热37℃。另外，取出冷冻的蛋白酶K母液使其化冻，以待用。
4.2.7.4在最后一次PBS漂洗时，配制好蛋白酶K工作液。PBS洗完后，立即将玻片放入装有蛋白酶K工作液的染色缸中，并确保玻片全部浸入液体，在37℃水浴中消化处理15min。与此同时，准备好煮沸的蒸馏水，并配制好高压缓冲液。4.2.7.5将高压缓冲液倒人陶瓷锅，并立即将玻片放人其中，确保玻片完全浸人水中.盖好盒盖，在121℃（约103kPa)高压处理20min，自然冷却至60℃以下取出在PBS中洗5min×3次，洗最后一遍时配制好3%双氧水甲醇溶液。4.2.7.6
4.2.7.7将玻片完全浸入3%双氧水甲醇溶液中室温处理5min。4.2.7.8
在PBS中洗5minX3次。如果正常猪血清是冷冻的，则需要提前取出化冻，用前5min配制好。
在玻片的组织上滴满5%正常猪血清，置湿盒中轻轻盖上盖子，室温作用20min。同时，取出冷冻的一抗进行化冻，并配制好工作液4.2.7.10弃去正常猪血清，用吸水纸吸干组织四周的液体。GB/T19180—2020
4.2.7.11将一抗工作液滴加在组织上，确保组织完全覆盖，湿盒中37℃作用4h，或者在2℃～8℃下作用过夜。
4.2.7.12在PBS中洗5minX3次，同时取出2℃~8℃下保存的免疫组织化学显色试剂盒，使其回温至室温状态
4.2.7.13洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满显色试剂盒中的标记聚合物-HRF的抗鼠二抗，湿盒中室温作用30min4.2.7.14在PBS中洗5minX3次
4.2.7.15洗完后用吸水纸吸干组织四周的液体，然后在组织上滴满试剂盒中的底物显色液，确保组织完全覆盖，湿盒中室温作用5min~10min，4.2.7.16在蒸馏水中漂洗3min×3次4.2.7.17将玻片放人Mayer氏苏木素液复染作用1min。4.2.7.18在蒸馏水中漂洗5min。4.2.7.19用水溶性封片剂封片。4.2.8结果判定
4.2.8.1在阳性和阴性对照片染色结果正确的情况下，分别在倍数为10×10、10×20和10X40的光学显微镜下观察组织玻片，进行结果判定4.2.8.2
阳性结果：脑组织灰质区特别是脑问部的迷走神经背核、孤束核和三叉神经脊束核等处出现特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阳性4.2.8.3阴性结果：脑组织灰质区未见特异性颗粒状染色，则判定为疯牛病阴性。4.3免疫印迹方法
4.3.1实验室生物安全要求
见4.1.1，但组织匀浆、消化及变性时需在负压罩下操作。4.3.2仪器设备
电泳仪、半于转印仪、组织匀浆机、化学发光成像仪、冰箱（含冷冻和冷藏）、温箱（能恒定在37℃C）金属浴、摇床、电子天平、平皿（直径为12cm～15cm）、玻璃棒、眼科剪、眼科镊、保鲜膜、玻璃板（大小约20cm×20cm）专用铲刀（用于撬开预制胶）、塑料桶、微量移液器（量程分别为0.5μL~10uL、5μL~50μ、10μ~100μL、50μ~200μL100μL~1000μ)。4.3.3试剂
4.3.3.1蒸馏水。
10道泳道的12%SDSNuPage胶（又称预制胶，商品化产品）。4.3.3.2
预染蛋白质Marker（商品化产品，应含有15kDa～35kDa之间的蛋白条带）。匀浆缓冲液(见附录C中C.1)。
蛋白酶K溶液(见C.2)。
消化阻止液（见C.3)。
上样缓冲液（见C.4）。
电泳缓冲液（商品化产品，与12%SDSNuPage匹配）。G
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甲醇。
TBST(见 C.5)。
转印缓冲液（见C.6）。
封闭液（见C.7）。
3PVDF膜。
3MM滤纸。
一抗（商品化产品）工作液（见C.8）标记HRP的免抗鼠IgG（商品化产品）工作液（见C.9）。化学发光显色试剂盒（商品化产品）。阳性对照（见C.10）。
阴性对照（见C.11)。
无机试剂原料均为分析纯。
4.3.4菜样
通过枕骨大孔采集脑部组织，并于一15℃～一20℃冷冻保存待用4.3.5实验操作步骤
4.3.5.1样品处理
取100mg130mg脑门部组织放人1.5mL的专用匀浆管中，加人1.2mL匀浆缓冲液。用匀浆机以6200r/min的速度匀浆45sec。将匀浆好的样品吸取到1.5mL离心管中，以7000g离心5min然后将上清移至另一离心管中。4.3.5.2PK酶消化
取50L离心好的样品、阳性对照、阴性对照分别移至1.5mL离心管中，各加入5uL蛋白酶K溶液，使蛋白酶K终浓度达到50μg/mL以上，混匀后放在48℃金属浴中消化40min。为防止消化过程中离心管盖被热气体撑开，可以加一重物如铁块压住盖子。消化完后各加入3L消化阻止液阻止蛋白水解反应。
4.3.5.3蛋白变性
在消化完的样品、阳性对照、阴性对照中分别加人50μL上样缓冲液，混匀后置96℃金属浴中变性5min。
4.3.5.4电泳
4.3.5.4.1将预制胶安放好，在电泳槽内槽加满电泳缓冲液的工作液（不要溢出），外槽加至浸没过胶底端1/3处和电泳槽中的导热丝（总共需要约400mL电泳缓冲液）。如果电泳仪与预制胶不匹配，则可以自行配制12%SDSPage胶，配方及操作可参见相关资料。4.3.5.4.2两端平行地拨出梳子，在第一道泳道加人10μL蛋白质Marker，第二道泳道加12uL阳性对照，第三道泳道加人12L阴性对照，在其余泳道加人12μL变性完的样品（样品要趁热加）。安装好电泳装置，接通电源，设定电压200V、时间40min进行电泳。同时，配制好转印缓冲液，放2℃～8℃预冷。
4.3.5.5电转印
电泳完后，取出预制胶。用专用铲刀从四周撬开预制胶外壳，切掉胶的加样齿孔及胶底部染4.3.5.5.1
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液线以下部分。在胶上倒一点转印缓冲液，使胶保持湿润。然后按照胶的大小，剪好PVDF膜及4张滤纸，PVDF膜应比滤纸稍大。将PVDF膜放人100%甲醇中浸湿1min，之后将滤纸和膜放入转印缓冲液中浸泡平衡15min。
4.3.5.5.2在玻璃板上先放置两层对齐的滤纸，用玻璃棒沿一个方向轻赶气泡，用铲刀将胶取出放于滤纸上，并与滤纸对齐。夹取另两张滤纸，滴一些转印液在胶上，并使胶全部浸湿，然后将浸好的膜从一端慢慢往另一端放下，直至完全覆盖在胶上。如果发现膜与胶之间有白点·说明它们之间存在气泡，则用玻璃棒滚动将其驱赶。如果气泡太多，则取下膜，在转印液中再次浸湿，重新放置于胶上。如此反复，直至没有气泡。然后，将取出另两层滤纸整齐放于膜上，用玻璃棒驱赶气泡。“三明治”做好后，用铲刀将其转人转印槽中，注意膜的一端朝向正极。往”三明治”上倒入少量转印缓冲液，再用玻璃棒轻赶气泡4.3.5.5.3盖上盖子，接通电源，设定电压15V、时间15min进行转印。4.3.5.6封闭
转印结束后，弃去胶和滤纸。观察Marker转印效率，如果膜上有清晰的Marker条带，说明转印效率良好，否则转印失败。将膜放人装有封闭液的平皿中，确保膜完全（至少有蛋白的区域）浸没，4℃作用过夜或者37℃作用1h。注意与胶接触的一面朝上，以后的步骤都是这样。封闭结束，置摇床上用TBST摇洗3次，每次5min
4.3.5.7一抗作用
将膜放人一抗工作液中，确保膜完全浸没，室温下置摇床摇振孵育1.5h。作用完后，置摇床上用TBST摇洗6次，每次5min。
4.3.5.8二抗作用
将膜放人标记HRP的免抗鼠IgG工作液中.确保膜完全浸没，室温下置摇床摇振孵育1h。孵育40min后，打开化学发光成像仪进行预热。孵育完后，置摇床上用TBST摇洗6次，每次5min。4.3.5.9底物作用
按照化学发光显色试剂盒说明书配制好化学发光底物溶液（至少5mL），混合均勾。将膜放置在一干净平血中，将底物溶液滴加到膜的表面上，作用10min。4.3.5.10化学发光
按照5倍手膜的大小剪一块保鲜膜，并将其展平放于桌上。底物作用完后，将膜取出。再将膜平放在保鲜膜中间位置，拿起保鲜膜的一边，沿PVDF膜的一边折起，覆盖在PVDF膜上，再将周边的保鲜膜稍微折叠，即可放入化学发光成像仪中或通过X光胶片曝光。一般情况曝光2min～3min即可。若条带太浅，则需要增加曝光时间；相反，则应减少曝光时间，直至效果最佳。注意，每次都要以图片格式保存好照片，以便判定结果。
4.3.6结果判定
4.3.6.1在阳性对照和阴性对照均成立的条件下，才可判定其余样品的结果。4.3.6.2阳性结果：曝光照片上的样品泳道出现三条特异性黑色条带，且对比胶上的蛋白质Marker分析条带大小在17ku～33ku之间，则判定为疯牛病阳性。4.3.6.3阴性结果：曝光照片上的样品泳道没有特异性黑色条带，或者有个别杂条带，但对比胶上的蛋白质Marker分析条带天小不在17ku～33ku之间，则判定为疯牛病阴性
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