GB/T 16550-2020.Diagnostic techniques for newcastle disease.
1范围
GB/T 16550规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和实时荧光RT-PCR( Real-time RT-PCR)的技术要求。
GB/T 16550适用于新城疫的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通 用要求
NY/T 541兽医诊断样 品采集、保存与运输技术规范
NY/T 1948兽医实验室生物安全要求通则
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Ct值:每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数(Cyclethreshold)
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethy pyrocarbonate)
HA:血凝( Hemagglutinin)
HI:血凝抑制(Haemagglutination inhibition)
ICPI:脑内接种致病指数(Intracerebral pathogenicity index)
ND:新城疫(Newcastle disease)
NDV :新城疫病毒(Newcastle disease virus)
PBS:磷酸盐缓冲液( Phosphate buffered saline)
RBC:鸡红细胞悬液(Redbloodcell)
RNA:核糖核酸(Ribonucleic acid)
RT-PCR:反转录聚合酶链式反应( Reverse transcription- polymerase chain reaction)

ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T16550—2020
代替GB/T16550—2008
新城疫诊断技术
Diagnostic techniques for newcastle disease2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草GB/T16550—2020
本标准代替GB/T16550—2008《新城疫诊断技术》，与GB/T16550—2008相比，主要技术变化如下：
一修改了血凝和血凝抑制试验判定结果（见7.3和7.4.2008年版的5.3和6.3)；—删除了毒力评价指标中MDT和IVPI(见2008年版的4.3和4.4)；增加了实时荧光RT-PCR检测方法（见第9章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、扬州大学本标准主要起草人：刘华雷、王静静、于晓慧、吕艳、吴艳涛、胡顺林、郑东霞、赵云玲、刘文博，刘秀梵、王志亮。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为：-GB16550—1996、GB/T16550—2008。1
GB/T16550—2020
新城疫（Newcastledisease，ND）是由新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）强毒株感染禽类引起的一种急性、烈性传染病，给世界养禽业造成巨大的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将新城疫列为法定报告的动物疫病，我国农业农村部将其列为一类动物疫病新城疫病毒可感染240多种禽类，其中家鸡和珠鸡最易感，感染禽（野鸟）及带毒禽（野鸟）系主要的传染源。新城疫病毒主要经消化道和呼吸道传播，被污染的水、饲料、蛋托（箱）、种蛋、鸡胚和带毒的野生飞禽、昆虫及有关人员等均可成为传播媒介。新城疫病毒属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）、正禽腮腺炎病毒属（Orthoavulavirus），目前新城疫病毒只有一种血清型，但可分为多种基因型。OIE规定，新城疫是由新城疫病毒强毒株引起的禽类感染，因此，对于新城疫的诊断，除了鉴定新城疫病毒之外，还需要对其致病性进行评估。对于致病性评估的方法，可通过1日龄SPF鸡ICPI进行测定，也可通过分子生物学技术，如RT-PCR结合序列测定等。根据新城疫病毒F基因部分序列（47nt～420nt)差异，可将新城疫病毒分为ClassI和ClassⅡ两大类，其中ClassI在国内均系弱毒株，因此，针对ClassINDV的检测方法不具有诊断意义，本标准所涉及的诊断方法均针对ClassII新城疫强毒株。1范围
新城疫诊断技术
GB/T16550—2020
本标准规定了新城疫的临床诊断、病毒分离与鉴定、血凝和血凝抑制试验、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR）和实时荧光RT-PCR(Real-timeRT-PCR）的技术要求。本标准适用于新城疫的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541
NY/T1948
缩略语
兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范兽医实验室生物安全要求通则
下列缩略语适用于本文件
Ct值：每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值所经历的循环次数（Cyclethreshold）DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethyPyrocarbonate）HA：血凝（Hemagglutinin）
HI：血凝抑制（Haemagglutinationinhibition）ICPI：脑内接种致病指数（Intracerebralpathogenicityindex）ND：新城疫（Newcastledisease）NDV：新城疫病毒（Newcastlediseasevirus）PBS：磷酸盐缓冲液（Phosphatebufferedsaline）RBC：鸡红细胞悬液（Redbloodcell）RNA：核糖核酸（Ribonucleicacid）RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）Real-timeRT-PCR：实时荧光RT-PCR（Real-time reversetranscription-polymerase chainreaction)
SPF：无特定病原体（Specificpathogenfree）4临床诊断
4.1流行病学
4.1.1宿主范围广，鸡、火鸡、鹤鹑、鸽、鹅等多种家禽及野禽均易感，鸭也可感染4.1.2传染源主要为感染禽（野鸟）及带毒禽（野鸟），主要经消化道和呼吸道传播，被污染的水、饲料、蛋托（箱）、种蛋、鸡胚和带毒的野生飞禽、昆虫及有关人员等均可成为主要的传播媒介1
GB/T16550—2020
4.1.3该病无明显季节性，一年四季均可发生，春秋季多发4.2
2临床症状
临床致病型
根据临床表现不同.临床致病型分为：嗜内脏速发型：以消化道出血性病变为主要特征，死亡率高；a)
嗜神经速发型：以呼吸道和神经症状为主要特征，死亡率高；b)
中发型：以呼吸道和神经症状为主要特征，死亡率低；缓发型：以轻度或亚临床性呼吸道感染为主要特征；d）
无症状肠道型：以亚临床性肠道感染为主要特征。e)
4.2.2典型症状
当病鸡出现下列之一或全部临床症状时，可作为初步诊断的依据之一：发病急、病死率高；
体温升高、精神沉郁、呼吸困难、食欲下降；粪便稀薄，呈黄绿色或黄白色；c）
发病后期出现扭颈、翅膀麻痹、瘫等神经症状；免疫禽群出现产蛋下降，蛋壳质量变差，产畸形蛋或异色蛋。e)
3剖检变化
当病鸡出现下列之一或全部部检变化时，可作为初步诊断的依据之一：全身黏膜和浆膜出血，以呼吸道和消化道最为严重，气管环状出血；a）
腺胃黏膜水肿，乳头和乳头间有出血点；盲肠扁桃体肿大、出血、坏死；c
十二指肠和直肠黏膜出血，泄殖腔黏膜出血，有的可见纤维素性坏死病变；脑膜充血和出血；
亮窦、喉头、气管黏膜充血，偶有出血，肺可见淤血和水肿4.4
鉴别诊断
家禽感染高致病性禽流感病毒后，临床表现和死亡率与新城疫（ND)类似。与ND相比，高致病性禽流感以全身器官出血为特征，包括：肿头，眼脸周围浮肿，鸡冠和肉垂肿胀、发紫、出血和坏死，腿及爪鳞片出血等。在临床实践中，很难依据临床症状和剖检变化进行区分，应依靠实验室诊断进行鉴别4.5
结果判定
当禽类符合4.1，且符合4.2、4.3之一的，可判定为疑似新城疫5样品采集与处理
5.1总则
样品采集宜在发病初期、选择具有典型临床症状的家禽，可采集脑、肺脏、脾牌脏、肾、肠（包括内容物）肝和心脏等组织脏器，也可采集未见明显临床症状禽类的泄殖腔和口咽拭子样品进行实验室诊断采样过程中不得交叉污染，在田间采样应勤换一次性手套，每采集一个样品宜更换或消毒一次灭菌采样2
GB/T16550—2020
器具，尽量做到无菌采集。样品采集、处理、保存和运输应符合GB19489和NY/T541的要求5.2组织样品采集
典型临床发病禽可无菌采集脑、肺、脾、肾、肠（包括内容物）、气管、肝、心等组织脏器，装入无菌采样袋或其他灭菌容器并编号，在一20℃冷冻保存。5.3拭子样品采集
采集活禽样品时可采集口咽和泄殖腔拭子。取口咽拭子时应将拭子深人喉头及上聘裂来回旋转2次3次，要求可见明显黏液。采集泄殖腔拭子时应将拭子深入泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便。对于鸽、珍禽等体型较小的禽鸟，采样时需用适合的拭子，避免因拭子取样给禽类造成损伤。将采集后的拭子放人盛有2.0mL的PBS(0.01mol/L、pH7.0~7.4，含青霉素2000U/mL、链霉素2mg/mL、10%甘油）的采样管中，编号。用于病毒分离的拭子样品于一20℃冷冻保存，尽量避免反复冻融。5.4血清样品采集
无菌采集禽类的血液，每只2.0mL，用于新城疫抗体检测。无菌分离血清，装人2.0mL离心管中，加盖密封后冷藏或冷冻保存。
5.5样品运输
样品采集后置保温箱中，加人预冷的冰袋，密封，宜24h内送实验室。5.6样品处理
5.6.1生物安全措施
样品处理的生物安全措施按照GB19489和NY/T1948进行。5.6.2组织样品处理
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品，置组织匀浆器充分研磨，置于含抗生素的PBS（0.01moL/L.、pH7.0~7.4)中，制成浓度为10%~20%的悬浮液，冻融2次~3次，室温（20℃~25℃）静置1h~2h.3000r/min离心5min，取上清液转人无菌的1.5mL离心管中，编号备用，5.6.3拭子样品处理
将采集的子样品在振荡器上充分混合后.将拭子中的液体充分挤压后弃去拭子，室温静置作用30min，3000r/min离心5min，取上清液转人无菌的1.5mL离心管中，编号备用。5.6.4样品保存
处理好的样品在2℃8℃条件下保存应不超过24h。若需长期保存应放置于一70℃冰箱中，反复冻融不超过3次。
6病毒分离与鉴定
6.1主要仪器设备
6.1.1孵化器
6.1.2冰箱（2℃~8℃、-20℃、一70℃不同温度）。GB/T16550—2020
台式高速冷冻离心机（最天离心力12000g以上）。微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。6.1.4
1.0mL注射器（灭菌）。
Ⅱ级生物安全柜。
6.2试剂
6.2.10.01mol/LpH7.2PBS.见附录A。6.2.21%鸡红细胞悬液（RBC)，见附录B。6.3操作程序
鸡胚接种
用1.0mL注射器吸取上清液，按0.2mL/枚的剂量经尿囊腔接种9日龄～11日龄的SPF鸡胚，每个样品至少接种5枚。接种后.37℃～38℃继续孵育。18h后每12h照胚，观察鸡胚死亡情况6.3.2病毒收获
收集18h以后的死胚及96h仍存活鸡胚，置2℃～8℃、4h或过夜，无菌收取鸡胚尿囊液。6.3.3病毒鉴定
6.3.3.1血凝（HA）试验：收获感染鸡胚尿囊液，测定其血凝活性。如果没有血凝活性或血凝效价3log2，则用初代分离的尿囊液于SPF鸡胚继续盲传两代，若仍为阴性，则认为新城疫病毒分离阴性试验方法按7.3执行
6.3.3.2血凝抑制（HI)试验：对于HA效价高于或等于41og2的尿囊液，应采用新城疫病毒标准阳性血清进行血凝抑制试验以确认是否含有新城疫病毒。试验方法按7.4执行。6.3.4毒力测定
6.3.4.1测定方法
经确定仅为新城疫病毒的情况下，应根据1日龄SPF鸡脑内接种致病指数（ICPI)测定病毒毒力。6.3.4.2操作程序
6.3.4.2.1HA效价高于或等于4log2的新鲜感染尿囊液（不超过24h～48h，细菌检验为阴性），用无菌等渗盐水作10倍稀释。
6.3.4.2.2脑内接种出壳后24h～40h之间的SPF雏鸡，共接种10只，每只接种0.05mL。6.3.4.2.3每24h观察一次，共观察8d。6.3.4.2.4每天观察应给鸡打分，正常鸡记作0.病鸡记作1.死鸡记作2（每只死鸡在其死后的每日观察中仍记作2）。
6.3.4.2.5ICPI是每只鸡8d内所有观察数值的平均数，计算方法见公式(1）。ICPI=2. ×1+2a ×2
式中：
。8d累计发病数；
Et——8d累计死亡数；
——8d累计观察鸡的总数。
·（1）)
6.3.4.3结果判定
GB/T16550—2020
6.3.4.3.1ICPI值越大,NDV致病性越强，最强毒力病毒的ICPI接近2.0，而弱毒株的ICPI值为0。6.3.4.3.2ICPI≥0.7，可判为阳性。7血凝试验和血凝抑制试验
7.1主要仪器设备
7.1.1微型振荡器。
7.1.2微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。7.1.396孔V型血凝板。
7.2试剂
7.2.1PBS：见附录A。
7.2.21%鸡红细胞悬液（RBC)：见附录B7.2.3新城疫病毒标准阳性抗原，新城疫病毒标准阳性血清、阴性血清。7.3血凝试验
7.3.1在96孔V型微量血凝板1孔～12孔均加人25μLPBS7.3.2在第1孔中加入25μL抗原或病毒悬液，吹打3次～5次，充分混匀。7.3.3将抗原或病毒悬液在反应板上进行系列倍比稀释，即从第1孔中吸取25μL悬液至第2孔，混匀后再吸取25L悬液至第3孔，依次进行倍比稀释到第11孔，最后从第11孔吸取25uL弃去，第12孔不加抗原或病毒悬液，作为PBS对照。7.3.4每孔加人25μLPBS。
7.3.5每孔加人25μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。将微量反应板在微型振荡器振荡混匀或轻扣反应板混匀反应物，室温静置20min~30min或2℃～8℃静置60min，当对照孔（第12孔）红细胞呈显著纽扣状时判定结果。7.3.6结果判定：将反应板倾斜，观察红细胞有无泪珠状流尚。以完全凝集（不流尚）的最高稀释倍数为抗原或病毒悬液的血凝效价。完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。7.4血凝抑制试验
7.4.1根据测得抗原或病毒悬液血凝效价配制4单位抗原（4HAU)。4HAU的配制方法如下：假设抗原的血凝效价为8log2（1：256），则4HAU抗原的稀释倍数应是1：64（256除以4），稀释时，将1mL抗原加入63mLPBS中即为4HAU抗原。7.4.24HAU检测：4单位抗原应现用现配，在使用前进行标定。将配制的4HAU进行系列稀释，使最终稀释度分别为1：2、1：3、1：4、1：5、1：6和1：7.然后按照7.3进行血凝试验。如果配制的抗原液为4HAU，则1：4稀释度将给出凝集终点；如果4HAU高于4个单位，可能1：5或1：6为终点；如果较低，可能1：2或1：3为终点。应根据检验结果将抗原稀释度做适当调整，使工作液确为4HAU。
7.4.3取96孔V型微量血凝板，用移液器在第1孔～第11孔各加25μLPBS，第12孔加人50μLPBS
7.4.4在第1孔加人25uL血清，充分混匀后移出25uL至第2孔，依次类推，倍比稀释至第10孔，并从第10孔弃除25μL
GB/T16550—2020
7.4.5在第1孔～第11孔各加人25μL4HAU抗原，振荡15s.使液体混合均勾，室温静置至少20min或2℃~8℃至少60min。
7.4.6在第1孔～第12孔每孔加人25μL1%的鸡红细胞悬液，振荡混匀，室温静置20min～40min或2℃～8℃静置40min～60min，对照孔红细胞呈显著纽扣状时判定结果。7.4.7第11孔为抗原对照，第12孔为PBS对照，每次测定还应设已知效价的标准阳性血清和阴性血清作对照。
7.4.8结果判定：将反应板倾斜，从背侧观察加样孔底部的红细胞是否呈泪痕状流消。以完全抑制4HAU抗原的最高血清稀释倍数为该血清的HI抗体效价。只有当阴性血清对照孔血清效价≤2log2，阳性血清对照孔血清效价与标定效价相差≤1个滴度，红细胞对照无自凝现象时，试验结果有效。HI效价≤3log2，判为HI试验阴性；HI效价≥4log2判为HI试验阳性8反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）8.1
主要仪器设备
PCR扩增仪。
8.1.2台式高速冷冻离心机：最大离心力12000g以上。8.1.3Ⅱ级生物安全柜。
8.1.4微量可调移液器（2μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格），及其配套的无核酸酶处理的离心管与吸头。
8.1.5电泳仪。
8.1.6电泳槽。
8.1.7紫外凝胶成像仪
8.2试剂
RNA提取试剂Trizol。也可用商品化RNA提取试剂盒，或其他等效RNA提取试剂和方法，如自动化核酸提取仪和其他配套核酸抽提试剂进行核酸提取，8.2.2
2三氯甲烷（氯仿）。
异丙醇（分析纯）。
75%乙醇：用新开启的无水乙醇（分析纯）和DEPC处理水按3：1配制而成，一20℃预冷。8.2.4
RT-PCR相关试剂：可选择商品化试剂盒8.2.6
阳性对照：灭活的新城疫强毒感染鸡胚尿囊液。8.2.7
阴性对照：SPF鸡胚尿囊液
操作程序
样品准备
取处理后的拭子样品、组织样品或尿囊液3000r/min离心5min，取200μL离心后的上清提取RNA。
8.3.2病毒RNA提取
RNA提取应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。提取RNA时应避免RNA酶污染。用Trizol提取核酸RNA的操作步骤如下：a）在无RNA酶的1.5mL离心管中加入200μL检测样品，然后加人1mLTrizol，振荡20s，室6
温静置10min。
GB/T16550—2020
加入200μL三氯甲烷（氯仿），颠倒混匀，室温静置10min，12000r/min离心15min。b)此内容来自标准下载网
管内液体分为三层，取500μL上清液于离心管中加人500μL预冷（一20℃）的异丙醇，颠倒混匀，静置10min。12000r/min离心15min沉淀RNA，弃去所有液体（离心管在吸水纸上控干)。
加人700μL预冷（一20℃）的75%乙醇洗涤，颠倒混匀2次~3次。12000r/min离心d)
10min。
调水浴至60℃。离心管在室温下干燥至没有水滴。加人40uLDEPC处理水，60℃水浴中作用10min，充分溶解RNA，一70℃保存或立即使用。8.3.3配置RT-PCR反应体系
引物针对新城疫病毒F基因设计，上游引物P1的序列为5'-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3°下游引物P2的序列为5-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3，Y为兼并碱基（Y：C/T）8.3.3.2
RT-PCR反应体系配置
RT-PCR反应体系配置见表1。体系配好后盖紧PCR反应管盖，并做好标记。表1RT-PCR反应体系配置表
无RNA酶灭菌超纯水
10×反应缓冲液
RNase抑制剂（40U/μL)
AMV反转录酶（5U/μL)
Taq酶(5U/μL)
上游引物P1(20μmol/L)
下游引物P2(20μmol/L）
模板RNA
8.3.4RT-PCR反应
按8.3.3.2的加样顺序全部加完后，充分混匀，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。同时设立阳性对照和阴性对照。按照下列程序进行扩增：42℃反转录30min；95℃预变性3min；94℃变性30s，55℃退火30s.72℃延伸45s，共进行35次循环；最后，72℃再延伸7min。最终的RT-PCR产物置4℃保存。
8.3.5扩增产物电泳检测
1.5%琼脂糖凝胶板的制备：称取1.5g琼脂糖，加人100mL1×TAE缓冲液中。加热融化后8.3.5.1
GB/T16550—2020
加5uL（10mg/mL）漠乙锭，混匀后倒人放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拨出梳子（胶中形成加样孔）放入电泳槽中，加1×TAE缓冲液淹没胶面。
8.3.5.2加样：取5uLPCR产物与0.5μL10X加样缓冲液混匀后加入琼脂糖凝胶板的一个加样孔中每次电泳同时设标准DNAMarker、阴性对照、阳性对照。8.3.5.3电泳：接通电源，120V恒压电泳30min40min。8.3.6观察与记录
电泳结束后，取出凝胶板置凝胶成像仪（或紫外线透射仪）上观察并记录结果8.4结果判定
8.4.1试验成立条件：阳性对照出现535bp左右扩增条带（参见附录C)，同时阴性对照无扩增条带8.4.2检测样品出现535bp左右的目的片段（与阳性对照大小相符），判为新城疫病毒核酸阳性；检测样品未出现目的片段，判为新城疫病毒核酸阴性。5NDV强毒感染的确定
对扩增到的目的片段进行序列测定，根据序列测定结果，对毒株F基因编码的氨基酸序列进行分析。如果毒株F2蛋白的C端有\多个碱性氨基酸残基”,F1蛋白的N端即117位为苯丙氨酸，可确定为新城疫病毒强毒感染。“多个碱性氨基酸”是指毒株F2蛋白的C端在113位到116位残基之间至少有三个精氨酸或赖氨酸。
9实时荧光RT-PCR(Real-timeRT-PCR)9.1主要仪器设备
9.1.1荧光定量PCR仪
9.1.2其余器材同8.1.2～8.1.4。9.2试剂
按8.2执行。
引物和探针
根据我国流行的所有基因型（基因V、Ⅱ、X和X型）新城疫强毒F基因序列设计引物、探针。其中正向引物NDV-Ⅱa序列为5-CTCAGACAGGGTCAATCATAGT-3°，反向引物NDV-Ⅱb序列为5'-GCAACCCCAAGAGCTACA-3。探针NDV-IP序列为5-ATRAAGCGTTTYTGYCTCCTTCCTCC-3。探针5'端连接FAM荧光基团，3'端连接BHQ-1淬灭基团,R，Y为简并碱基（R：A/G;Y：C/T)。9.4操作程序
样品准备
按8.3.1执行。
9.4.2病毒RNA的提取
按8.3.2执行。
9.4.3实时荧光RT-PCR反应
按照表2配置实时荧光RT-PCR反应体系，盖紧盖子并做好标记。9.4.3.1
表2实时荧光RT-PCR反应体系配置表组分
DEPC处理水
2×反应混合液
正向引物NDV-Ila(20μmol/L）
反向引物NDV-IIb(20μmol/L）
探针NDV-IIp(10μmol/L）
RT/TaqMix
模板RNA
GB/T16550—2020
按9.4.3.1的加样顺序全部加完后，充分混勾，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。同时设立阳性对照和阴性对照。将PCR管放在荧光定量PCR仪器上进行RT-PCR扩增，反应条件为：50℃反转录30min；95℃预变性3min；然后94℃变性15s，59℃退火1min，共进行45次循环。每次循环在59℃1min时搜集信号。
9.4.4质控标准
阳性对照扩增曲线呈标准的S形曲线，且Ct值≤30（参见附录D）。阴性对照无Ct值.且无扩增曲线
9.5结果判定
9.5.1样品无Ct值或Ct值>38且无标准扩增曲线，判为阴性。9.5.2样品Ct值≤35，且出现标准的S形扩增曲线，判为阳性。9.5.3样品35综合判定
10.1临床判定为疑似的易感禽类，按第6章分离出新城疫病毒，且鉴定其ICPI≥0.7.或经第8章RT-PCR检测呈阳性且经序列分析证明F蛋白裂解位点具有强毒特征，或经第9章实时荧光RT-PCR检测呈阳性的，可判定为新城疫。10.2临床无明显特异症状的非免疫动物经第7章血凝试验和血凝抑制试验检测出新城疫病毒抗体的，可判定新城疫病毒感染
10.3被检禽虽然没有明显的临床症状和病理变化，但病原检测符合10.1的病原检测判定标准，可判定为新城疫病毒强毒感染。
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