GB/T 18648-2020
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
GB/T 18648-2020.Diagnostic techniques for African swine fever.
1范围
GB/T 18648规定了ASF的临床诊断,实验室诊断样品采集及处理,以及普通PCR方法、荧光PCR方法、荧光RAA方法、高敏荧光免疫分析法、夹心ELISA抗原检测方法、间接ELISA抗体检测方法、阻断ELISA抗体检测方法、夹心ELISA抗体检测方法、间接免疫荧光方法等实验室诊断方法。
GB/T 18648适用于家猪和野猪ASF的诊断与监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ASF :非洲猪瘟( African Swine Fever)
ASFV :非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus)
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethy Pyrocarbonate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylenediaminetetraacetic Acid)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
FAM :6-羧基荧光素( 6-Carboxy-Fluorescein)
OD:光密度(Optical Density)
PBS:磷酸盐缓冲液( Phosphate Buffered Saline)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
RAA:重组酶介导的等温核酸扩增技术( Recombinase Aided Amplification)
SPF :无特定病原体(Specific Pathogen Free)
1范围
GB/T 18648规定了ASF的临床诊断,实验室诊断样品采集及处理,以及普通PCR方法、荧光PCR方法、荧光RAA方法、高敏荧光免疫分析法、夹心ELISA抗原检测方法、间接ELISA抗体检测方法、阻断ELISA抗体检测方法、夹心ELISA抗体检测方法、间接免疫荧光方法等实验室诊断方法。
GB/T 18648适用于家猪和野猪ASF的诊断与监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
ASF :非洲猪瘟( African Swine Fever)
ASFV :非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus)
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethy Pyrocarbonate)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylenediaminetetraacetic Acid)
ELISA:酶联免疫吸附试验( Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
FAM :6-羧基荧光素( 6-Carboxy-Fluorescein)
OD:光密度(Optical Density)
PBS:磷酸盐缓冲液( Phosphate Buffered Saline)
PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)
RAA:重组酶介导的等温核酸扩增技术( Recombinase Aided Amplification)
SPF :无特定病原体(Specific Pathogen Free)
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标准内容
ICS11.220
中华人民共和国国家标准
GB/T18648—2020
代替GB/T18648—2002
非洲猪瘟诊断技术
Diagnostic techniques for African swine fever2020-12-14发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-12-14实施
规范性引用文件
缩略语
生物安全措施
临床诊断
易感动物和宿主
临床表现
病理变化
临床诊断结果判定
实验室诊断样品采集及处理
采样用具
样品采集
样品处理
普通PCR方法·
仪器设备
引物序列
试验程序
试验成立条件
普通PCR结果判定
荧光PCR方法
仪器设备
引物和探针
试验程序
试验成立条件
荧光PCR结果判定
荧光RAA方法
仪器设备
GB/T18648—2020
GB/T18648—2020
试验程序
试验成立条件
荧光RAA结果判定
10高敏荧光免疫分析法，
仪器设备
试验程序
高敏荧光免疫分析结果判定
11夹心ELISA抗原检测方法
仪器设备
试验程序
11.4、试验成立条件
夹心ELISA抗原检测结果判定
12间接ELISA抗体检测方法
仪器设备
试验程序
试验成立条件
间接ELISA抗体检测结果判定
阻断ELISA抗体检测方法·
仪器设备
试验程序
阻断率计算方法
试验成立条件
阻断ELISA抗体检测结果判定
夹心ELISA抗体检测方法
仪器设备
试验程序
试验成立条件
夹心ELISA抗体检测结果判定
15间接免疫荧光方法
仪器设备
试验程序
15.4试验成立条件
15.5间接免疫荧光结果判定
16综合判定
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
样品保存液的配制方法
聚合酶链式反应溶液的配制方法酶联免疫吸附试验溶液的配制方法GB/T18648—2020
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草GB/T18648—2020
本标准代替GB/T18648—2002《非洲猪瘟诊断技术》，与GB/T18648—2002相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下：
一增加了缩略语（见第3章）：
—增加了生物安全措施（见第4章）；增加了临床诊断（见第5章）；
增加了实验室诊断样品采集及处理（见第6章）；增加了荧光PCR方法（见第8章）、荧光RAA方法（见第9章）、高敏荧光免疫分析法（见第10章）、夹心ELISA抗原检测方法（见第11章）、阻断ELISA抗体检测方法（见第13章）、夹心ELISA抗体检测方法（见第14章）、间接免疫荧光方法（见第15章）等实验室诊断方法；增加了综合判定（见第16章）；增加了样品保存液的配制方法（见附录A）、聚合酶链式反应溶液的配制方法（见附录B)；修改了酶联免疫吸附试验溶液的配制方法（见附录C,2002年版的附录C）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：吴晓东、李林、胡永新、樊晓旭、邹艳丽、任炜杰、张永强、戈胜强、王清华、李金明、包静月、赵永刚、徐天刚、李岭、刘珊、蒋正军、王树双、马洪超、王志亮本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18648—2002。
1范围
非洲猪瘟诊断技术
GB/T18648—2020
本标准规定了ASF的临床诊断，实验室诊断样品采集及处理，以及普通PCR方法、荧光PCR方法、荧光RAA方法、高敏荧光免疫分析法、夹心ELISA抗原检测方法、间接ELISA抗体检测方法、阻断ELISA抗体检测方法、夹心ELISA抗体检测方法、间接免疫荧光方法等实验室诊断方法。本标准适用于家猪和野猪ASF的诊断与监测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求缩略语
下列缩略语适用于本文件
ASF：非洲猪瘟（AfricanSwineFever）ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethyPyrocarbonate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）FAM:6-羧基荧光素（6-Carboxy-Fluorescein）OD：光密度（OpticalDensity）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）RAA：重组酶介导的等温核酸扩增技术（RecombinaseAidedAmplification）SPF：无特定病原体（SpecificPathogenFree）TMB：四甲基联苯胺（3，3.5，5-Tetramethyl-Benzidine）4生物安全措施
进行ASF实验室诊断时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB19489执行。5临床诊断
易感动物和宿主
猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感，且表现出相似的临床症状和死亡广率；而非洲野猪，例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪，感染ASFV后很少或者不出现临床症状，是1
GB/T18648—2020
病毒的储存宿主。
5.2临床表现
5.2.1最急性：无明显临床症状突然死亡。5.2.2急性：体温可高达42℃，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视黏膜潮红、发结。眼、鼻有黏液脓性分泌物；呕吐；便秘，粪便表面有血液和黏液覆盖；或腹泻，粪便带血。共济失调或步态僵直，呼吸困难，病程延长则出现瘫痪、抽搐等其他神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达100%。病程4d~10d
5.2.3亚急性：临床症状与急性相同，但病情较轻，病死率较低。体温波动无规律，一般高于40.5℃。仔猪病死率较高。病程5d～30d。5.2.4慢性：波状热，呼吸困难，湿咳。消瘦或发育迟缓，体弱，毛色暗淡。关节肿胀，皮肤溃疡，跛足。死亡率低。病程2个月到15个月。5.3
病理变化
典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血，肾脏、肺脏表面有出血点，心内膜和心外膜有大量出血点，胃、肠道黏膜弥漫性出血；胆囊、膀胱出血；肺脏肿大，切面流出泡沫性液体，气管内有血性泡沫样黏液；脾脏肿大，易碎，呈暗红色至黑色，表面有出血点，边缘钝圆，有时出现边缘梗死；颌下淋巴结、腹腔淋巴结肿大，严重出血。最急性型的个体可能不出现明显的病理变化5.4临床诊断结果判定
易感动物出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为疑似ASF病例6实验室诊断样品采集及处理
6.1试剂
0.1mol/LPBS(pH7.4），配制方法见附录A的A.16.1.2
0.04mol/LPBS(pH7.4），配制方法见A.2。6.1.350%甘油-PBS保存液，配制方法见A.3。6.1.4青霉素，浓度为10.000IU/mL。6.1.5
链霉素，浓度为10000ug/mL。
采样用具
器械：解剖刀、剪刀、镊子、骨锯、注射器及针头、组织匀浆器等。6.2.2容器：真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2mL、10mL）、样品保存管等。6.2.3个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等、6.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。6.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。6.3
样品菜集
口鼻拭子菜集
采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物：取分泌物后：立即将拭子浸入1mL50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧2
离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。6.3.2全血样品菜集
GB/T18648—2020
在发病猪群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝剂）采集一定数量发病猪、同群猪全血各5mL，密封后冷藏或冷冻保存。
6.3.3血清样品采集
在每一发病猪群中，采集发病猪、同群猪全血各5mL，室温放置12h～24h，分离血清，装人离心管中，密封后冷藏或冷冻保存。
6.3.4组织样品采集
采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。脾脏、肾脏采集约3cm×3cm大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集，骨髓采集长度约3cm。将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中。6.4样品处理
6.4.1口、鼻拭子样品处理
口、鼻拭子标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用6.4.2全血样品处理
全血标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。6.4.3血清样品处理
血清标记样品编号，立即进行ASFV抗体检测或冷冻储存备用。6.4.4组织样品处理
取适量采集的组织样品置于组织勾浆器中充分研磨，加人终浓度为1000IU/mL的青霉素、1000μg/mL的链霉素，灭菌的0.1mol/LPBS(pH7.4)制备10%组织匀浆液。2000r/min离心处理10min。取上清液，标记编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。7普通PCR方法
7.1试剂
7.1.1DNA提取试剂盒。
PCR预混液（2X）：TaqDNA聚合酶（0.05U/μL），反应缓冲液，4mmol/LMgCl2以及7.1.2
0.4 mmol/L的 dNTP。
7.1.3无核酸酶水，配制方法见附录B的B.1。7.1.4TAE缓冲液，配制方法见B.2和B.3。7.1.52%的琼脂糖凝胶，配制方法见B.4。7.1.66×上样缓冲液。
仪器设备
自动化核酸提取仪，
GB/T18648—2020
PCR扩增仪。
台式低温高速离心机（最大离心力12.000g以上）。7.2.4
稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。7.2.5
凝胶成像仪（或紫外透射仪)。
微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。7.2.7
无核酸酶离心管与吸头。
7.2.8PCR扩增管。
引物序列
引物针对ASFVB646L基因的保守区域设计。上游引物PPA-1：5-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3；下游引物PPA-2：5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3。扩增产物大小为257bp。7.4试验程序
7.4.1核酸提取
采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于一20℃冰箱保存。每次抽提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样本（血清、全血、10%组织匀浆或细胞培养上清液）；阴性对照样品应为无核酸酶水或者ASFV核酸阴性样本（血清、全血、10%组织浆或细胞培养上清液）。7.4.2核酸扩增
7.4.2.1扩增体系
每个样品配制22uLPCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水
PCR预混液（2X）
PPA-1(10μmol/L)
PPA-2(10μmol/L)
将22uLPCR反应混合液加入每个0.2mLPCR扩增管：将3LDNA模板加人PCR扩增管中每次进行普通PCR扩增时均应设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。加入模板后，密封反应管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放在PCR仪中。按7.4.2.2条件运行扩增程序7.4.2.2扩增条件
95℃预变性10min；95℃变性15s62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸7min。
7.4.2.3PCR扩增产物电泳
将5μL的6×上样缓冲液加人PCR产物中，混匀后取8μL加人到使用1×TAE缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶中，电泳30min～40min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果7.5试验成立条件
阳性对照应有大小为257bp的特异性扩增条带，且阴性对照和空白对照应无任何扩增条带。6普通PCR结果判定
GB/T18648—2020
符合7.5的条件，被检样品有大小为257bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带分子量大小相符，则该样品判为ASFV核酸阳性；被检样品无特异性的扩增条带，则判为ASFV核酸阴性。8荧光PCR方法
8.1试剂
8.1.1DNA提取试剂盒。
8.1.2无核酸酶水，配制方法见B.1。8.1.3荧光PCR预混液（2X）。
仪器设备
8.2.1荧光PCR扩增仪
8.2.2台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。8.2.3微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。8.2.4无核酸酶离心管与吸头。
8.2.5PCR扩增管。
引物和探针
引物和探针针对ASFVB646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F1：5'-GCTTTCAGGAT-AGAGATACAGCTCT-3；下游引物VP72-R1：5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3°；TaqMan探针VP72-T1:FAM-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-BHQ1。8.4试验程序
8.4.1核酸提取
方法同7.4.1。
8.4.2核酸扩增
8.4.2.1扩增体系
每个样品配制18L荧光PCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水
荧光PCR预混液（2X）
VP72-F1(10μmol/L)
VP72-R1(10μmol/L)
VP72-T1(10μmol/L)
将18μL荧光PCR反应混合液加入PCR扩增管；将2μLDNA模板加入每个PCR扩增管中。每次进行荧光PCR扩增时均应设阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。加人模板后，密封PCR扩增管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放人荧光PCR仪中。按8.4.2.2运行扩增程序5
GB/T18648—2020
8.4.2.2扩增条件
50℃孵育2min；95℃预变性5min；95℃变性15s,58℃退火延伸1min，45个循环，在每一循环的58℃时收集FAM荧光信号。
试验成立条件
阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。8.6
荧光PCR结果判定
符合8.5的条件，被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，则判为ASFV核酸阳性；当无Ct值或Ct值≥40，则判为ASFV核酸阴性；当389.1试剂
DNA提取试剂盒。
无核酸酶水，配制方法见B.1。
RAA反应预混液。
RAA荧光基础反应单元：包含重组酶，单链结合蛋白，DNA聚合酶的冻干粉。280mmol/L乙酸镁。
2仪器设备
恒温荧光基因检测仪
台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。9.2.3
微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。9.2.4无核酸酶离心管与吸头。
3引物
引物和探针针对ASFVB646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F2：5-TAGTGATAGAC-CCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3：下游引物VP72-R2：5'-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3'；探针VP72-T2：GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTAT（FAM-dT）C(THF)(BHQ1-dT)CCCGTGGCTTCAAAG9.4试验程序
9.4.1核酸提取
方法同7.4.1。
9.4.2核酸扩增
9.4.2.1扩增体系
每个样品配制42.5μL荧光RAA反应混合液，组成如下：RAA预混液
VP72-F2(10μmol/L)
VP72-R2(10μmol/L)此内容来自标准下载网
VP72-T2(1oμmol/L)
GB/T18648—2020
将42.5μL荧光RAA反应混合液加入RAA荧光基础反应单元中；将5μLDNA模板加入每个反应管中，将2.5μL乙酸镁加在反应单元管盖上。每次进行荧光RAA扩增时均应设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。加入模板后，密封反应管，放入恒温振荡混匀仪。完成混匀收集后，将所有反应管放入荧光恒温检测仪中。按9.4.2.2运行扩增程序。9.4.2.2扩增条件
扩增温度39℃，扩增时间15min，每隔20s收集荧光信号。9.5
试验成立条件
阳性对照起峰时间≤1.67min且出现特异性起峰曲线，阴性对照无起峰时间或阴性对照起峰时间≥10min且无特异性起峰曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。6荧光RAA结果判定
符合9.5的条件，被检样品起峰时间≤10min且出现特异性起峰曲线，则判为ASFV核酸阳性：被检样品无起峰时间或被检样品起峰时间>10min且无特异性起峰曲线，则判定为ASFV核酸阴性。高敏荧光免疫分析法
10.1试剂
无核酸酶水，配制方法见B.1
0.1mol/LPBSpH7.4）.配制方法见A.1。10.1.3
ASFV抗原高敏荧光检测试剂卡（检测卡）仪器设备
高敏荧光分析仪。
组织匀浆机。
微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μl等不同规格）。台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。7
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生物安全措施
临床诊断
易感动物和宿主
临床表现
病理变化
临床诊断结果判定
实验室诊断样品采集及处理
采样用具
样品采集
样品处理
普通PCR方法·
仪器设备
引物序列
试验程序
试验成立条件
普通PCR结果判定
荧光PCR方法
仪器设备
引物和探针
试验程序
试验成立条件
荧光PCR结果判定
荧光RAA方法
仪器设备
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试验程序
试验成立条件
荧光RAA结果判定
10高敏荧光免疫分析法，
仪器设备
试验程序
高敏荧光免疫分析结果判定
11夹心ELISA抗原检测方法
仪器设备
试验程序
11.4、试验成立条件
夹心ELISA抗原检测结果判定
12间接ELISA抗体检测方法
仪器设备
试验程序
试验成立条件
间接ELISA抗体检测结果判定
阻断ELISA抗体检测方法·
仪器设备
试验程序
阻断率计算方法
试验成立条件
阻断ELISA抗体检测结果判定
夹心ELISA抗体检测方法
仪器设备
试验程序
试验成立条件
夹心ELISA抗体检测结果判定
15间接免疫荧光方法
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15.4试验成立条件
15.5间接免疫荧光结果判定
16综合判定
附录A（规范性附录）
附录B（规范性附录）
附录C（规范性附录）
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聚合酶链式反应溶液的配制方法酶联免疫吸附试验溶液的配制方法GB/T18648—2020
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一增加了缩略语（见第3章）：
—增加了生物安全措施（见第4章）；增加了临床诊断（见第5章）；
增加了实验室诊断样品采集及处理（见第6章）；增加了荧光PCR方法（见第8章）、荧光RAA方法（见第9章）、高敏荧光免疫分析法（见第10章）、夹心ELISA抗原检测方法（见第11章）、阻断ELISA抗体检测方法（见第13章）、夹心ELISA抗体检测方法（见第14章）、间接免疫荧光方法（见第15章）等实验室诊断方法；增加了综合判定（见第16章）；增加了样品保存液的配制方法（见附录A）、聚合酶链式反应溶液的配制方法（见附录B)；修改了酶联免疫吸附试验溶液的配制方法（见附录C,2002年版的附录C）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SAC/TC181)归口。本标准起草单位：中国动物卫生与流行病学中心。本标准主要起草人：吴晓东、李林、胡永新、樊晓旭、邹艳丽、任炜杰、张永强、戈胜强、王清华、李金明、包静月、赵永刚、徐天刚、李岭、刘珊、蒋正军、王树双、马洪超、王志亮本标准所代替标准的历次版本发布情况为：GB/T18648—2002。
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下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求缩略语
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ASF：非洲猪瘟（AfricanSwineFever）ASFV：非洲猪瘟病毒（AfricanSwineFeverVirus）DEPC：焦碳酸二乙酯（DiethyPyrocarbonate）EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）ELISA：酶联免疫吸附试验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）FAM:6-羧基荧光素（6-Carboxy-Fluorescein）OD：光密度（OpticalDensity）PBS：磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline）PCR：聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）RAA：重组酶介导的等温核酸扩增技术（RecombinaseAidedAmplification）SPF：无特定病原体（SpecificPathogenFree）TMB：四甲基联苯胺（3，3.5，5-Tetramethyl-Benzidine）4生物安全措施
进行ASF实验室诊断时，如样品处理、核酸提取等，应按照GB19489执行。5临床诊断
易感动物和宿主
猪科动物是ASFV的易感动物。家猪和欧亚野猪对ASFV高度易感，且表现出相似的临床症状和死亡广率；而非洲野猪，例如疣猪、丛林猪、红河猪和巨林猪，感染ASFV后很少或者不出现临床症状，是1
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病毒的储存宿主。
5.2临床表现
5.2.1最急性：无明显临床症状突然死亡。5.2.2急性：体温可高达42℃，沉郁，厌食，耳、四肢、腹部皮肤有出血点，可视黏膜潮红、发结。眼、鼻有黏液脓性分泌物；呕吐；便秘，粪便表面有血液和黏液覆盖；或腹泻，粪便带血。共济失调或步态僵直，呼吸困难，病程延长则出现瘫痪、抽搐等其他神经症状。妊娠母猪流产。病死率可达100%。病程4d~10d
5.2.3亚急性：临床症状与急性相同，但病情较轻，病死率较低。体温波动无规律，一般高于40.5℃。仔猪病死率较高。病程5d～30d。5.2.4慢性：波状热，呼吸困难，湿咳。消瘦或发育迟缓，体弱，毛色暗淡。关节肿胀，皮肤溃疡，跛足。死亡率低。病程2个月到15个月。5.3
病理变化
典型的病理变化包括浆膜表面充血、出血，肾脏、肺脏表面有出血点，心内膜和心外膜有大量出血点，胃、肠道黏膜弥漫性出血；胆囊、膀胱出血；肺脏肿大，切面流出泡沫性液体，气管内有血性泡沫样黏液；脾脏肿大，易碎，呈暗红色至黑色，表面有出血点，边缘钝圆，有时出现边缘梗死；颌下淋巴结、腹腔淋巴结肿大，严重出血。最急性型的个体可能不出现明显的病理变化5.4临床诊断结果判定
易感动物出现上述临床症状和病理变化，可初步判定为疑似ASF病例6实验室诊断样品采集及处理
6.1试剂
0.1mol/LPBS(pH7.4），配制方法见附录A的A.16.1.2
0.04mol/LPBS(pH7.4），配制方法见A.2。6.1.350%甘油-PBS保存液，配制方法见A.3。6.1.4青霉素，浓度为10.000IU/mL。6.1.5
链霉素，浓度为10000ug/mL。
采样用具
器械：解剖刀、剪刀、镊子、骨锯、注射器及针头、组织匀浆器等。6.2.2容器：真空采血管（含EDTA抗凝剂）、离心管（2mL、10mL）、样品保存管等。6.2.3个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、防护靴、口罩、一次性手套等、6.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。6.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。6.3
样品菜集
口鼻拭子菜集
采集病死猪或发病猪、同群猪的口鼻拭子样品。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，采集口腔、鼻腔的分泌物：取分泌物后：立即将拭子浸入1mL50%甘油-PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧2
离心管盖，密封后冷藏或冷冻保存。6.3.2全血样品菜集
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在发病猪群中，使用真空采血管（含EDTA抗凝剂）采集一定数量发病猪、同群猪全血各5mL，密封后冷藏或冷冻保存。
6.3.3血清样品采集
在每一发病猪群中，采集发病猪、同群猪全血各5mL，室温放置12h～24h，分离血清，装人离心管中，密封后冷藏或冷冻保存。
6.3.4组织样品采集
采集病死猪或扑杀发病猪的组织样品。首选脾脏，其次为扁桃体、淋巴结、肾脏、骨髓等。脾脏、肾脏采集约3cm×3cm大小，扁桃体整体采集，淋巴结选取出血严重的整体采集，骨髓采集长度约3cm。将所采集样品放入50%甘油-PBS保存液中。6.4样品处理
6.4.1口、鼻拭子样品处理
口、鼻拭子标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用6.4.2全血样品处理
全血标记样品编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。6.4.3血清样品处理
血清标记样品编号，立即进行ASFV抗体检测或冷冻储存备用。6.4.4组织样品处理
取适量采集的组织样品置于组织勾浆器中充分研磨，加人终浓度为1000IU/mL的青霉素、1000μg/mL的链霉素，灭菌的0.1mol/LPBS(pH7.4)制备10%组织匀浆液。2000r/min离心处理10min。取上清液，标记编号，立即进行ASF病原检测或冷冻储存备用。7普通PCR方法
7.1试剂
7.1.1DNA提取试剂盒。
PCR预混液（2X）：TaqDNA聚合酶（0.05U/μL），反应缓冲液，4mmol/LMgCl2以及7.1.2
0.4 mmol/L的 dNTP。
7.1.3无核酸酶水，配制方法见附录B的B.1。7.1.4TAE缓冲液，配制方法见B.2和B.3。7.1.52%的琼脂糖凝胶，配制方法见B.4。7.1.66×上样缓冲液。
仪器设备
自动化核酸提取仪，
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PCR扩增仪。
台式低温高速离心机（最大离心力12.000g以上）。7.2.4
稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。7.2.5
凝胶成像仪（或紫外透射仪)。
微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。7.2.7
无核酸酶离心管与吸头。
7.2.8PCR扩增管。
引物序列
引物针对ASFVB646L基因的保守区域设计。上游引物PPA-1：5-AGTTATGGGAAACCCGACCC-3；下游引物PPA-2：5'-CCCTGAATCGGAGCATCCT-3。扩增产物大小为257bp。7.4试验程序
7.4.1核酸提取
采用DNA提取试剂盒提取各类样本中的病毒核酸，或用自动化核酸提取仪提取各类样本中的病毒核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，否则应置于一20℃冰箱保存。每次抽提核酸，应至少包括一个阳性对照和一个阴性对照。阳性对照样品应为ASFV核酸阳性样本（血清、全血、10%组织匀浆或细胞培养上清液）；阴性对照样品应为无核酸酶水或者ASFV核酸阴性样本（血清、全血、10%组织浆或细胞培养上清液）。7.4.2核酸扩增
7.4.2.1扩增体系
每个样品配制22uLPCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水
PCR预混液（2X）
PPA-1(10μmol/L)
PPA-2(10μmol/L)
将22uLPCR反应混合液加入每个0.2mLPCR扩增管：将3LDNA模板加人PCR扩增管中每次进行普通PCR扩增时均应设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。加入模板后，密封反应管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放在PCR仪中。按7.4.2.2条件运行扩增程序7.4.2.2扩增条件
95℃预变性10min；95℃变性15s62℃退火30s，72℃延伸30s，40个循环；72℃终延伸7min。
7.4.2.3PCR扩增产物电泳
将5μL的6×上样缓冲液加人PCR产物中，混匀后取8μL加人到使用1×TAE缓冲液配制的2%琼脂糖凝胶中，电泳30min～40min。电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中观察结果7.5试验成立条件
阳性对照应有大小为257bp的特异性扩增条带，且阴性对照和空白对照应无任何扩增条带。6普通PCR结果判定
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符合7.5的条件，被检样品有大小为257bp的特异性扩增条带，且与阳性对照条带分子量大小相符，则该样品判为ASFV核酸阳性；被检样品无特异性的扩增条带，则判为ASFV核酸阴性。8荧光PCR方法
8.1试剂
8.1.1DNA提取试剂盒。
8.1.2无核酸酶水，配制方法见B.1。8.1.3荧光PCR预混液（2X）。
仪器设备
8.2.1荧光PCR扩增仪
8.2.2台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。8.2.3微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。8.2.4无核酸酶离心管与吸头。
8.2.5PCR扩增管。
引物和探针
引物和探针针对ASFVB646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F1：5'-GCTTTCAGGAT-AGAGATACAGCTCT-3；下游引物VP72-R1：5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3°；TaqMan探针VP72-T1:FAM-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-BHQ1。8.4试验程序
8.4.1核酸提取
方法同7.4.1。
8.4.2核酸扩增
8.4.2.1扩增体系
每个样品配制18L荧光PCR反应混合液，组成如下：无核酸酶水
荧光PCR预混液（2X）
VP72-F1(10μmol/L)
VP72-R1(10μmol/L)
VP72-T1(10μmol/L)
将18μL荧光PCR反应混合液加入PCR扩增管；将2μLDNA模板加入每个PCR扩增管中。每次进行荧光PCR扩增时均应设阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。加人模板后，密封PCR扩增管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放人荧光PCR仪中。按8.4.2.2运行扩增程序5
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8.4.2.2扩增条件
50℃孵育2min；95℃预变性5min；95℃变性15s,58℃退火延伸1min，45个循环，在每一循环的58℃时收集FAM荧光信号。
试验成立条件
阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值≥40且无特异性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。8.6
荧光PCR结果判定
符合8.5的条件，被检样品Ct值≤38且出现特异性扩增曲线，则判为ASFV核酸阳性；当无Ct值或Ct值≥40，则判为ASFV核酸阴性；当38
DNA提取试剂盒。
无核酸酶水，配制方法见B.1。
RAA反应预混液。
RAA荧光基础反应单元：包含重组酶，单链结合蛋白，DNA聚合酶的冻干粉。280mmol/L乙酸镁。
2仪器设备
恒温荧光基因检测仪
台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。9.2.3
微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μL等不同规格）。9.2.4无核酸酶离心管与吸头。
3引物
引物和探针针对ASFVB646L基因的保守序列设计。上游引物VP72-F2：5-TAGTGATAGAC-CCCACGTAATCCGTGTCCCAAC-3：下游引物VP72-R2：5'-CGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTT-3'；探针VP72-T2：GATACGTTAATATGACCACTGGGTTGGTAT（FAM-dT）C(THF)(BHQ1-dT)CCCGTGGCTTCAAAG9.4试验程序
9.4.1核酸提取
方法同7.4.1。
9.4.2核酸扩增
9.4.2.1扩增体系
每个样品配制42.5μL荧光RAA反应混合液，组成如下：RAA预混液
VP72-F2(10μmol/L)
VP72-R2(10μmol/L)此内容来自标准下载网
VP72-T2(1oμmol/L)
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将42.5μL荧光RAA反应混合液加入RAA荧光基础反应单元中；将5μLDNA模板加入每个反应管中，将2.5μL乙酸镁加在反应单元管盖上。每次进行荧光RAA扩增时均应设立阳性、阴性及空白对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板，空白对照应用无核酸酶水作为模板。加入模板后，密封反应管，放入恒温振荡混匀仪。完成混匀收集后，将所有反应管放入荧光恒温检测仪中。按9.4.2.2运行扩增程序。9.4.2.2扩增条件
扩增温度39℃，扩增时间15min，每隔20s收集荧光信号。9.5
试验成立条件
阳性对照起峰时间≤1.67min且出现特异性起峰曲线，阴性对照无起峰时间或阴性对照起峰时间≥10min且无特异性起峰曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。6荧光RAA结果判定
符合9.5的条件，被检样品起峰时间≤10min且出现特异性起峰曲线，则判为ASFV核酸阳性：被检样品无起峰时间或被检样品起峰时间>10min且无特异性起峰曲线，则判定为ASFV核酸阴性。高敏荧光免疫分析法
10.1试剂
无核酸酶水，配制方法见B.1
0.1mol/LPBSpH7.4）.配制方法见A.1。10.1.3
ASFV抗原高敏荧光检测试剂卡（检测卡）仪器设备
高敏荧光分析仪。
组织匀浆机。
微量可调移液器（2.5μL、10μL、100μL、200μL、1000μl等不同规格）。台式低温高速离心机（最大离心力12000g以上）。7
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