GB/T 39228-2020.Determination of soil microbial biomass-Fumigation-extraction method.
1范围
GB/T 39228规定了一种通过氯仿熏蒸杀死新鲜土壤微生物后,测定其可提取的有机物质总量,估算土壤微生物生物量的方法。GB/T 39228仅描述了可提取有机碳含量的测定,但该方法同时也适用于估算土壤中的微生物氨含量及微生物茚三酮反应氮含量。GB/T 39228适用于土壤pH值范围较大的好氧和厌氧(渍水、水田)土壤微生物生物量的测定。本标准也适用于含易分解有机底物和硫酸钾溶液过饱和土壤中微生物生物量的测定。
注:氯仿熏蒸也影响土壤动物,但这类生物的碳贡献一般很少(<5%),通 常可以忽略。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
ISO 10381-6:1993土壤质量 采样第6部分:实验室 测定好氧微生物过程用土壤的采集、处理及贮存指南(Soil quality-Sample- Part 6:Guidance on the collection, handing and storage of soil  for the assessment of aerobic microbial processes in the laboratory)
ISO 10694:1995土壤质量 土壤有机质和 总碳的测定干 烧法(元素分析)[Soil quality-Determination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)]
ISO 11465;1993土壤质量 土壤干重 和含水量的测定重 量法(Soil quality-Determination of dry matter and water content on a mass basis- Gravimetric method)

ICS13.080
中华人民共和国国家标准
GB/T39228—2020/ISO14240-2:1997土微生物生物量的测定
熏蒸提取法
Determination of soil microbial biomass-Fumigation-extraction method(ISO 14240-2:1997,Soil quality-Determination of soil microbial biomassPart2.Fumigation-extraction method,IDT)2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2021-03-01实施
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本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草GB/T39228—2020/1S014240-2:1997本标准使用翻详法等同采用ISO14240-2：1997土壤质量量土徽生物生物量的测定
第2部分：
熏燕提取法》。
本标准做了下列编辑性修改：
）将标准名称改为《土壤微生物生物量的测定熏蒸提取法》；b）将公式（1)中有机碳浓度C改为了C。将公式（1)、公式（2)和公式（4)中的单位删除，在公式说明中添加了其单位的表述c
d）参考文献[2]中脚注“即将出版”改为“出版时间：1998年”。本标准由中华人民共和国农业农村部提出。本标准由全国土壤质量标准化技术委员会（SAC/TC404)）归口。本标准起草单位：中国科学院亚热带农业生态研究所、湖南永清环保研究院有限责任公司、中国科学院南京土壤研究所、江苏省质量和标准化研究院，本标准主要起草人昊金水，林先贵、贺前锋、李宝珍、肖和、葛体达、刘代欢、陈美军、钱荣富、李鹏祥。
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1范围
GB/T39228—2020/ISO14240-2:1997土壤微生物生物量的测定
薰蒸提取法
本标准规定了一种通过仿熏蒸杀死新鲜上壤微生物后，测定其可提取的有机物质总量，估算土壤微生物牛物量的方法，本标准仅描述了可提取有机碳含量的测定，但该方法同时也适用于估算土滚中的微生物氮含量及微生物三酮反应氮含量。本标准适用丁上壤PHI值范围较大的好氧和厌氧（渍水、水田）土块微生物生物量的测定。本标准也适用于含易分解有机底物和硫酸钾溶液过饱和土壤中微生物生物量的测定。
注：氯仿熏蒸也影响上壤动物，但这类生物的碳贡献一般很少（<5%），通常可以忽略。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用干本文件。ISO10381-6：1993>土壤质量采样第6部分：实验室测定好氧微生物过程用土壤的采集、处理及存指南（Soil qualitySamplePart 6，Guidanceon the collcction，handing and storage of soilfor the assessment of aerobic microbial proccsscs in the laboratory)ISO10694：1995土壤质量土壤有机质和总碳的测定干烧法（元素分析）[SoilqualityDetermination of organic and total carbon after dry combustion (elementary analysis)ISO11465：1993土壤质量土壤干重和含水量的测定重量法（Soilquality一Determinationofdry matter and watcr content on a mass basisGravimetric method)3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
土壤微生物生物量soilmicrobialbiomass十壤中活体微生物细胞的质量。注：这一指标可通过测定细胞中碳或氮含量或测定其对添加碳源的矿化能力估算。使用碳或氮分析时，可测死细胞或细胞辟片，当测定土壤呼吸时，只测活体细胞4原理
十壤样品经熏蒸后，全部活体微生物细胞破损，释放出微生物有机质。熏蒸对非活休土壤有机质无显著影响。上壤样品经氯仿熏蒸24h后，对于熏蒸和未黛蒸的土壤样品，用0.5mol/LK，SO溶液定1)2009年，ISO10381-6：1993被ISO10381-6,2009代替；2018年.ISO.10381-6:2009被1SO18400-206：2018代替。
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GB/T39228—2020/ISO14240-2.1997量提取有机碳并测定，根据有机碳含量的差值，计算土壤微生物生物量碳。5材料和试剂
5.1土壤样品
应尽量按照ISO10381-6的规定采集、处理及贮存土壤样品。如果要求土壤质量均匀，按照40%左右的田间持水量将土壤样品过筛。按照附录A的规定测定土壤田间持水量。样品含水量应高于30%田间持水量，确保氧仿均勺分布和有效熏蒸。同时，要注意避免湿土涂抹和压实。渍水土壤分析前无需干燥处理。5.2试剂
应使用公认的分析纯试剂，包括：5.2.1硅脂（中等黏度）
5.2.2去乙醇鼠仿。
在光照下，去乙醇氛仿迅速降解：形成无色无味，高毒的碳酰氢（COL）气体。蓄告
5.2.3硫酸印溶液，cK,S0)-0.5mol2Lce-87135g/L)5.2.4碱有灰。
6仪器
6.1室温或恒温培养室，温康维持在25℃6.2内置防爆干燥器。
6.3滤纸
6.4玻璃烧杯。bZxz.net
6.5皮氏培养皿。
6.6聚乙烯塑科瓶（250mL）。
6.7抽真空装置水或电泵）。
水平或翻转式捷荡器。
冰箱（15℃～
防爆沸颗粒。
熏蒸和漫提
7.1熏蒸
将湿润滤纸（6.3）放置于干燥器（6.2）中，以备土壤样品熏蒸。称取相当于25名~-50g烘于质量的新鲜样品（5.1）至少3份，分别放到不同的玻璃烧杯（6.4）或皮式培养皿（6.5)中，再将其置于真空T燥器中。真空干燥器中放置盛有25mL去乙醇氟仿（5.2.2）的烧杯一个，烧杯内放入少量防爆沸颗粒（6.10），同时放入一小烧杯碱石灰（5.2.4）溶液。抽真空待氟仿剧烈沸腾约2min，关闭干燥器阀门置于25C士2℃的培养室箱（6.1）中黑暗条作下培养22h~24h。2）Whatman42号.Schleicher和Schull5951/2，Machery和Nagel261G1/4均为市杨可购买到的合适产品。本信息为方便本标准使用者之用，不构成国际标准化组织（ISO）对相关产品的背书。2
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GB/T39228—2020/ISO14240-2:1997若土壤样品不够.可称取少量样品·但需保持土壤质量和浸提液比例（1：4）不变。当土壤有机质含量超过20%时（按照ISO10694规定测量），可扩大十壤与浸提液比例至1：4以上（对于有机质含量超95%的土壤，如枯枝落叶层土壤样品，该比例最大可达1：30）以提高浸提效率。记录所用土壤的质量。熏蒸结束后，从干燥器中取出盛有氯仿的烧杯及底部滤纸，再反复抽真空（6次，每次2min）去除土壤中残余氯仿。准备好的样品以备浸提用。另称取未熏蒸的新鲜土壤样品（烘干基重50g）3份，分别置于不同的聚乙烯塑料瓶（6.6）中，作为对照样品，并立即用200mL硫酸钾液（5.2.3）进行浸提，方法见7.2。7.2漫提
将熏蒸土壤样品无损转移到聚乙烯塑料瓶（6.6）中，加人200mL硫酸钾溶液（5.2.3），用水平振荡器（6.8）按200r/min振荡30min，或用翻转式振荡器60r/min振荡45min，再用滤纸（6.3）过滤浸提液。用同样方法没提和过滤未黑蒸的对照样品。应迅速测定滤腋。若不立即分析，则将熏蒸和未熏蒸的土壤浸提液保存在一15℃~一20C的冰箱（6.9)中。测定前在室温下解冻，充分据即可注1：由于硫酸钙（CSO）过饱和，瓷酸钾的最漫提液在保存过释中（特别是低温下保存）会出现一些白色沉淀，但对本方法中有机碳测定没有干扰，不必溶解过量CaSO。注2：氯仿熏蒸还会影响幼嫩活根的细胞膜。若土填中含大量活根，则参照附录B进行预处理据取。8浸提液中碳的测定
通过测土壤样品中徽生物生物量碳，可用于比较不同土壤微生物生物量大小。微生物生物量计算需乘一不转换系数，该系数已知细胞质量与熏提取碳的相关分析试验面得，所用转换系数背与该初始系数相关。
可用重铬酸钾氧化法（8.1)或仪器分析法（8.2）测定浸提液中碳含量。8.1微生物生物量碳——重铬酸钾氧化法8.1.1原理
在强酸下，有机质被重铬酸钾氧化，Cr(V)还原成Cr（Ⅲ），回滴过剩的重铬酸钾。8.1.2其他试剂
8.1.2.1重铬酸钾，c（KCr:O）=0.0667mol/L（每升水中加人19.6125g烘十重的重铬酸钾）。警告一重铬酸钾危险，应谨慎使用，妥善处理。8.1.2.2催酸（H,PO,）.p=1.71g/L8.1.2.3硫酸（H,SO).p-1.84g/L。8.1.2.4硫酸业铁铵滴定液，c[(NH).Fe(SO.)。6H.O]=0.040mol/L.将15.69g硫酸亚铁铵溶于蒸馏水，加入20mL硫酸（8.1.2.3）酸化，用蒸馏水定容至1000mL。8.1.2.51,10-邻菲罗啉硫酸混合液，0.025mol/L。8.1.2.6酸混合液：2倍体积的硫酸（8.1.2.3）与1倍体积的磷酸（8.1.2.2）混合。8.1.3其他仪器
8.1.3.1李比希式冷凝器（冷凝水）。圆底烧瓶，250mL。
8.1.3.3酸式滴定管，10mL，按0.05mL刻度标记，3
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GB/T39228—2020/ISO14240-2:19978.1.3.4移液管，2mL。
8.1.4操作步骤
吸取8mL的过滤浸提液（7.2)（P）于圆底烧瓶（8.1.3.2）中，用移液管（8.1.3.4）加人2mL的重铬酸钾（8.1.2.1)（P）和15mL的酸混合液（8.1.2.6）。缓慢回流（8.1.3.1）涯合液30min，加入20mL~25mL水使其冷却和稀释（通过冷凝器加入来冲洗）。用间样的方法消化含8mL硫酸钾溶液（5.2.3）的两个空白样。注：消化的空自样品也称“同流空白”。加人几滴1,10-邻菲罗琳硫酸混合液（8.1.2.5）指示剂，用硫酸亚铁铵滴定液（8.1.2.4）回滴（8.1.3.3）测定过剩的重铬酸钾。
8.1.5结果计算
依据公式（1）和公式（2）计算有机碳含量：C.=[(VH-V)/VXMPXEX1000/R
式中，
式中：
样品有机碳浓度单位为微克每毫升（mg/mL）回流宝白消粗的滴定液（8.14）体积，单位为尝升（mL)，样品消耗的滴定液（8.1.2.4)休科，单为毫（mL）未回流空白消耗的滴定液8.1.2.4）体积，单位为毫升（mL）重酸钾溶液的囊度，单位应为摩尔每升（mol）：所添加重络酸钾落液的体积，单位为毫升mL有机碳转换为CO.的转换系数，取值3：所添加样品的体积，单位为毫升P
详品有机碳含量（以烘干土计），单促为微克每克（路/&）：没提液的质量，单位为克（g)：样品烘十重（按照ISO11465的标准测定），单位为克（g）：土壤合水量水重（g）/烘干土重（g）】（按ISO11465的标准洲定）。微生物生物量碳的计算按照公式（3）：Bc-Eelk
式中：
.....................(3)
E。一熏蒸土壤样品浸提的有机碳含量未熏热上最样品浸提的有机碳含量Ckc=0.38
注：系数危：出熏蒸培养法和熏蒸想取祛获得的十壤微生物生物量碳（12种土壤）间相关关系计算而得。8.2
微生物生物量碳一
8.2.1原理
碳光谱分析法
用过硫酸钾（KS.O）溶液将浸提的有机碳氧化为二氧化碳，用红外（IR）或紫外（UV）光谱分析测定。
8.2.2其他试剂
过硫酸钾（KSO）。
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8.2.2.2磷酸(H.PO,)(见8.1.2.2)。8.2.2.3聚偏磷酸钠[（NaPO.），]，超级纯。8.2.2.4过硫酸钾试剂。
GB/T39228—2020/ISO14240-2:1997将20g过硫酸钾（8.2.2.1)溶于900mL蒸馅水中，再用酸（8.2.2.2）调节至pH2，最后用蒸馏水定容至1000ml.
8.2.2.5聚值磷酸钠试剂，
将50g聚偏磷酸钠（8.2.2.3）溶于900mL蒸馅水中，再用磷酸（8.2.2.2）酸化至pH2.最后用蒸馏水定容至1000mL。
8.2.3其他仪器
1自动碳分析仪（红外检测法）或连续流动分析仪（地色法检测）8.2.3.1
本标准此部分目的是基于紫外光活化过硫酸盐光氧化有机碳测定微生物生物量碳。8.2.4操作步骤
取5mL硫覆钾囊浸提液（7.2）和5mL聚偏磷酸钠溶液（8.2.2.5）混合均.完全溶解土壤浸提液中CaSO,汇淀。
好过硫酸钾试润（8.2之）自动送人紫外氧化室，由紫外光活化将有机碳氧化为CO2。用红外线吸收或紫外光谱测定CO浓变：8.2.5
结果计算
按照公式（4）计算土境有机嵌含量（C)D
BXDXPR/DW
样品有机碳含量以烘于土计单位为微壳每克（）产品活度C。，单位为做克每毫升确酸钠需释样品的体积，单位为毫升（mL）空自样品#度Ce，单位为微克每毫升（pig/ml）磷酸销稀释空白样品的体积，单位为毫升（mL)：见公式
见公式（2）：
见公式（2）
按照公式(5)计算生物量Bcl
Be-Ec/kec
式中：
E。一熏蒸土壤样品浸提的有机碳含量C一未熏蒸土壤样品浸提的有机碳含量Ce=0.45
-*-(4)
注1：系数ec值是由熏蒸培养法和熏蒸提取法获得的土壤微生物生物量碰（23种土壤）间相关关系计算所得注2，其可使熏蒸提取法与\C标记有机质分解研究相结合。3）DohrmanDC80，MaihskTocor4是市场上可买得到的设备。该信息为方便本标准的使用者，并不为国际标准化组织(ISO)所背书。
Skalar、PerstorpAlpkem足市场上可买得到的设备。该信息为方便本标准的使用者，但并不为国际标准化组织4
(ISO)所背书。
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GB/T39228—2020/ISO14240-2：19979精度
附录C汇总了本方法中精度的多个实验室试验数据，这些数据对于其他浓度范围和测试对象可能并不适用。
rrkaeerkAca
A.1范围
附录A
（规范性附录）
土境田间持水量测定
本方法适用于精度要求不高的土填持水量测定A.2原理
GB/T39228—2020/ISO14240-2:1997底部带孔圆简用+衰部分具充，加盖并置于水中浸泡后，将吸水后的上称重，然后在105℃烘于至恒重后再称重
圆筒体积一定，长约
50mm-150
A.3.2水浴（室温D
A.3.3托摄，带有一个排水无装有痛度20A.3.4烘箱，能修保持105
A.3.5天平，称重精度为士。01：操作步聚
的温度
用滤纸覆盖带孔的圆筒（A.B.1）底部直径50.mm
ioemn.底部带礼。
50mm厚湿精石英
填充，并加盖。室温下，在水浴中浸泡圆简2h，再保走该水位1h后，从水中取出圆筒放置在有砂子的托盘（A.3.8，根据土壤类型的差异沥干2h～24h。称重带土圆筒，取出土，并将其在105C烘干至值重，再称重土填。A.5计算
持水量（WHC)的计算，用%表达：如（A1）S-T-D
式中：
S—水饱和土壤+圆简+滤纸质量，单位为克(g)：T
毛重，即圆筒十滤纸质量，单位为克（g）烘于土壤质量，单位为克（g）。D
A.6结果表达
土壤持水量（WHC)按占烘十土壤质量的百分比表达。-rrKaeerKAca-
...(A.1)
GB/T39228—2020/ISO14240-2：1997附录B
（资料性附录）
含大量活根土壤微生物生物量估算预提取过程B.1试剂
硫酸钾溶液，c（KzSO,）=0.05mol/L(8.714g/L超级纯的硫酸钾）。B.1.1
其他仪器
B.2.1离心机。
操作步骤
称取潮湿土壤（相当于25g~50g烘干土壤）于250mL玻璃瓶中，加人100mL硫酸钾溶液（B1.1)预提取，以200r/min充分搬荡20min后过筛（耕作土过2mm筛，草地土过3mm筛）。然后用75mL的硫酸钾溶液（B.1.1）仔细冲洗筛上根（和小石头），直至筛上无土壤，活根和碎石烘干并称重。土壤悬浮液用离心机（B.2.1）按大约500g离心15min。倒掉上清液，在土壤中加入3滴氯仿（5.2.2），按照7.1的操作步骤进行熏蒸。
B.4评价
采用上述方法处理含活性根土壤很重要。此外，本方法可降低土壤中无机氮背景值，更易测定土壤微生物生物量，减少了干燥土壤中微生物生物量的测定间题。因此，很适合测定土壤微生物生物量碳和氮的一年变化。通过土壤的预提取过程，提取不出微生物生物量、8
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