GB/T 38480-2020.Determination of antifungal activity for microbial secondary metabolites-Mycelial growth rate method.
1范围
GB/T 38480规定了用菌丝生长速率法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性的方法。
GB/T 38480适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定。
2规范性引 用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
抑制中浓度 median inhibitory concentration
IC50
对真菌生长的抑制率达到50%时的浓度。
3.2
抗真菌活性 antifungal activity
抗制真菌生长繁殖的能力。
4原理
将供试次生代谢产物与培养基混合,以培养基上菌落的生长速度来衡量次生代谢产物抑丝状真菌的能力,通过计算IC50来判定活性。
5试剂或材料
除非另有规定,所用试剂均为分析纯。
5.1 水。GB/T 6682一级水。
5.2马铃 薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)。称取马铃薯浸粉3.0g、葡萄糖20.0 g、琼脂20.0 g，然后将上述各成分加入1 000 mL蒸馏水中，煮沸溶解,pH自然,分装至250 mL锥形瓶中,121℃灭菌20 min,备用。也可采用市售的商业培养基。
5.3指示 菌标准菌株:立枯丝核菌(RhizoctoniasolaniKuhn) ATCC76145.
根据微生物源抗生素类次生代谢产物应用领域不同，也可以采用其他菌株作为供试菌。
本标准规定了用菌丝生长速率法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性的方法。 本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38480—2020
微生物源抗生素类次生代谢产物菌丝生长速率法
抗真菌活性测定
Determination of antifungal activity for microbial secondary metabolites-Mycelialgrowthratemethod
2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-19实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院GB/T38480—2020
本标准主要起草人：申屠旭萍、叶子弘、马爱进、俞晓平、崔海峰、张雅芬、许益鹏1
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1范围
微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定
菌丝生长速率法
GB/T38480—2020
本标准规定了用菌丝生长速率法测定微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性的方法。本标准适用于微生物源抗生素类次生代谢产物抗真菌活性测定规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
medianinhibitoryconcentration抑制中浓度
对真菌生长的抑制率达到50%时的浓度3.2
Eantifungal activity
抗真菌活性
抗制真菌生长繁殖的能力。
将供试次生代谢产物与培养基混合，以培养基上菌落的生长速度来衡量次生代谢产物抑丝状真菌的能力，通过计算IC来判定活性试剂或材料
除非另有规定，所用试剂均为分析纯5.1水。GB/T6682级水。
5.2马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）。称取马铃薯浸粉3.0g、葡萄糖20.0g、琼脂20.0g，然后将上述各成分加人1000mL蒸馏水中，煮沸溶解.pH自然，分装至250mL锥形瓶中，121℃灭菌20min，备用。也可采用市售的商业培养基。5.3指示菌标准菌株：立枯丝核菌（RhizoctoniasolaniKuhn）ATCC76145根据微生物源抗生素类次生代谢产物应用领域不同，也可以采用其他菌株作为供试菌1
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GB/T38480—2020
6仪器设备
恒温培养箱：温度偏差在土1℃以内6.1
2超净工作台。
3无菌培养皿：直径90mm。
6.4测量仪：游标卡尺，精度o.1mm。6.5无菌打孔器：内径5mm土0.1mm5无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器。6.6
7操作步骤
7.1指示菌培养
倾注融化并经121℃灭菌冷却至55℃左右的PDA固体培养基15mL于无菌培养皿内，待其凝固后制成PDA平板，将立枯丝核菌冻存菌株用无菌接种针挑取少量菌丝接种到PDA平板中间，28℃土1℃恒温培养箱培养至菌丝覆盖整个平板，备用。上述操作均在超净工作台内进行。7.2供试样品制备
极性样品直接用水充分溶解（非极性样品加一定浓度的表面活性剂充分溶解），配制成二定浓度的母液，经无菌0.45um滤膜过滤，然后用无菌水（或相应的表面活性剂）按2借或5倍浓度逐级稀释，制备成至少5个不同浓度的待测溶液，逐级稀释时应确保既有抑制率大于50%分布的浓度点，也有抑制率小于50%分布的浓度点，现配现用。7.3检测平板制备
将7.2中制备的供试样品分别用冷却至55℃士1℃的PDA培养基按1：9的比例稀释，充分混匀后用无菌吸管各取10mL移至无菌培养血内，轻轻摇动培养血使其均匀铺平，待其凝固后制成检测平板，用对应的溶剂和PDA混合制备的平板作为空白对照平板，备用。7.4抑菌活性测定
用无菌打孔器（内径5mm士0.1mm）在活化的指示菌平板中相同的半径边缘打孔，用无菌镊子取菌饼正置于7.3制备的检测平板中间。每个处理重复5次。将平板正置于28℃土1℃恒温培养箱中培养24h～48h，取出，采用十学交叉法测量菌落直径，两次测量所得的平均值即为菌落直径8结果计算
抑制率按式(1)计算：
式中：
1—抑制率；
(D,—5)—(D2—5)bZxz.net
Dl一空白对照平板中形成的菌落直径，单位为毫米（mm）；Dz一一供试次生代谢产物平板中形成的菌落直径，单位为毫米（mm）。以五个平行样的平均值为最终结果，计算结果保留到小数点后两位2
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GB/T38480—2020
根据药剂浓度对数值与对应抑制率的概率值作回归分析，得到回归曲线Y=aX十b,其中Y为抑制率的概率值，X为药剂浓度对数值，a为回归曲线斜率，b为常数，并给出回归曲线的R2值.计算供试药剂对立枯丝核菌的IC5值。
重复性
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。rrKaeerkAca-
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