ICS07.080 GB/T38484—2020 植物激素类次生代谢产物的生物活性测定细胞学评价法 Determination of the biological activity for plant hormone-related secondary metabolites Cytological method 2020-11-19发布 国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会 发布 2020-11-19实施 前言 本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草，由中国标准化研究院提出并归口。本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院。本标准主要起草人：张雅芬、叶子弘、马爱进、俞晓平、黄超群、崔海峰、许益鹏、申屠旭萍、李翼、陈丽、吴娟。 1 范围 本标准规定了用细胞学评价法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法。本标准适用于植物激素类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义、缩略语 3.1 术语和定义 3.1.1 植物激素类次生代谢产物 plant hormone-related secondary metabolites：来自植物自身合成以及通过微生物发酵或化学合成获得的具有调控植物生长、发育与休眠的活性物质。 3.1.2 生物活性 biology activity：单位浓度的植物激素类次生代谢产物与其相对应的标准物促进或抑制植物生长、发育与休眠能力的相对值。 3.2 缩略语 4-MU：4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferone） 4-MUG：4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸酯（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide） AuxRE::GUS：生长素响应gus报告基因（auxin-responsive gus reporter gene） CTKRE::GUS：细胞分裂素响应gus报告基因（cytokinin-responsive gus reporter gene） DPBS：Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液（Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline） GA：赤霉酸（gibberellic acid） GARE::GUS：赤霉素响应gus报告基因（gibberellin-responsive gus reporter gene） GUS：β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase） NAA：吲哚乙酸（1-naphthylacetic acid） ZT：玉米素（zeatin） 4 原理 植物激素类活性物质通过与相应激素受体结合，可调节相关蛋白与其靶基因启动子中的激素应答元件结合，进而诱导或抑制靶基因表达。选用携带激素响应的GUS报告基因的转基因拟南芥原生质体细胞为试验材料，以标准物为参照，根据GUS酶活和标准物浓度对数的线性回归关系得到标准曲线，计算在线性范围内诱导产生GUS酶活相同的标准物浓度与试样浓度的比值，表示单位浓度(mg/mL)试样所具有的植物激素类次生代谢产物的生物活性。其中GUS蛋白可水解4-MUG为4-MU，以37℃水浴条件下每微克GUS蛋白每分钟水解4-MUG产生的4-MU的物质的量指示GUS酶活。 5 试剂或材料 除非另有规定，仅使用分析纯试剂。 5.1 水，GB/T6682标准级。 5.2 AuxRE::GUS细胞系：拟南芥(Arabidopsis thaliana) Columbia(Col-0)生态型，含生长素应答元件AuxREs，携带单拷贝gus基因，活细胞数≥1×10^6个/mL。 5.3 GARE::GUS细胞系：拟南芥Col-0生态型，含赤霉素应答元件TATC-boxs，携带单拷贝gus基因，活细胞数≥1×10^6个/mL。 5.4 CTKRE::GUS细胞系：拟南芥Col-0生态型，含细胞分裂素应答元件ARR1AT，携带单拷贝gus基因，活细胞数≥1×10^6个/mL。 5.5 细胞系培养液：不含蔗糖和琼脂的MS培养基4.74g，加950mL水溶解后，加人30