GB/T 38484-2020.Determination of the biological activity for plant hormone-related secondary metabolites-Cytological method.
1范围
GB/T 38484规定了用细胞学评价法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法。
GB/T 38484适用于植物激素类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
植物激素类次生代谢产物 plant hormone-related secondary metabolites
来自植物自身合成的以及通过微生物发酵或化学合成获得的具有调控植物生长、发育与休眠的活性物质。
3.1.2
生物活性 biology activity
单位浓度的植物激素类次生代谢产物与其相对应的标准物促进或抑制植物生长、发育与休眠能力的相对值。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4-MU:4-甲基伞形酮(4-methylumbelliferon)
4-MUG :4-甲基伞形酮-B-D-葡萄糖醛酸苷(4-methylumbelliferyl-B-D-glucuronide)
AuxRE::GUS:生长素响应gus报告基因(auxin-responsive gus reporter gene)
CTKRE::GUS:细胞分裂素响应gus报告基因(cytokinin-responsive gus reporter gene)
DPBS: Dulbecco' s磷酸缓冲盐溶液(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline)
GARE::GUS:赤霉素响应gus报告基因( gibbrellin-responsive gus reporter gene)
GUS:β-葡萄糖醛酸苷酶( B-glucuronidase)
NAA:萘乙酸(1-naphthylacetic acid)
ZT:玉米素(zeatin)
本标准规定了用细胞学评价法测定植物激素类次生代谢产物生物活性的方法.

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38484—2020
植物激素类次生代谢产物的生物活性测定细胞学评价法
Determination of the biological activity for plant hormone-related secondarymetabolitesCytologicalmethod2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-19实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38484—2020
本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、浙江省检验检疫科学技术研究院，本标准主要起草人：张雅芬、叶子弘、马爱进、俞晓平、黄超群、崔海峰、许益鹏、申屠旭萍、李翼、陈丽、吴娟。
1范围
植物激素类次生代谢产物的生物活性测定细胞学评价法bzxZ.net
本标准规定了用细胞学评价法测定植物激素类次生代谢产物牛物活性的方法，GB/T38484—2020
本标准适用于植物激素类次生代谢产物生长素、细胞分裂素和赤霉素的活性测定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用干本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3
术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
植物激素类次生代谢产物planthormone-relatedsecondarymetabolites来自植物自身合成的以及通过微生物发酵或化学合成获得的具有调控植物生长、发育与休眠的活性物质。
生物活性
biologyactivity
单位浓度的植物激素类次生代谢产物与其相对应的标准物促进或抑制植物生长、发育与休眠能力的相对值。
2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
4-MU：4-甲基伞形酮（4-methylumbelliferon）4-MUG：4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸首（4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide）AuxRE：:GUS：生长素响应gus报告基因（auxin-responsivegusreportergene）CTKRE::GUS：细胞分裂素响应gus报告基因（cytokinin-responsivegusreportergene）DPBS:Dulbecco's磷酸缓冲盐溶液（Dulbecco'sPhosphate-BufferedSaline）GA，：赤霉酸（gibberellicacid）GARE：:GUS：赤霉素响应gus报告基因（gibberellin-responsivegusreportergene）GUS：β-葡萄糖醛酸苷酶（β-glucuronidase）NAA：茶乙酸（1-naphthylaceticacid）ZT：玉米素（zeatin）
GB/T38484—2020
4原理
植物激素类活性物质通过与相应的激素受体结合可调节相关蛋白与其靶基因启动子中的激素应答元件结合进而诱导或抑制靶基因表达。选用携带激素响应的gus报告基因的转基因拟南芥原生质体细胞为试验材料，以标准物为参照，根据GUS酶活和标准物浓度对数的线性回归关系得到标准曲线，计算在线性范围内诱导产牛的GUS酶活相同的标准物浓度与试样浓度的比值，表示单位浓度(mg/mL)试样所具有的植物激素类次生代谢产物的生物活性。其中GUS蛋白可水解4-MUG为4-MU，由此以37℃水浴条件下每微克GUS蛋白每分钟水解4-MUG产牛的4-MU的物质的量来指示GUS酶活。
5试剂或材料
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水。GB/T6682—级。
5.2AuxRE：:GUS细胞系。拟南芥（Arabidopsisthaliana）Columbia（Col-0）生态型，含有牛长素应答元件AuxREs，携带单拷贝gus基因，活细胞数≥1×10°个/mL。5.3GARE::GUS细胞系。拟南芥（Arabidopsisthaliana）Columbia（Col-0）生态型，含有赤霉素应答元件TATC-boxs，携带单拷贝gus基因，活细胞数≥1×1o°个/mL。5.4CTKRE::GUS细胞系。拟南芥（Arabidopsisthaliana）Columbia（Col-0）生态型，含有细胞分裂素应答元件ARR1AT，携带单拷贝gus基因，活细胞数≥1×10°个/mL。5.5细胞系培养液。不含蔗糖和琼脂的MS培养基4.74g，加950mL水溶解后，加人30.00g蔗糖，0.75g氯化钙，0.35g硝酸钾，充分混匀后用氢氧化钠调整pH至5.60，加水定容至1000mL，0.22um滤膜过滤除菌。现配现用。
5.6DPBS，pH7.4。称取氯化钠8.00g，氯化钾0.20g，十二水合磷酸氢二钠2.90g，磷酸二氢钾0.24g，加水定容至1000mL，混匀后常温保存备用。可使用同类商品化产品。5.7抽提液。称取二水合乙二胺四乙酸二钠3.72g，加人700μLβ-硫基乙醇，1mL聚乙二醇辛基苯基醚，用DPBS溶解并定容至1000mL，混匀后常温保存备用。5.8含1mmol/L4-MUG的抽提液。称量105.6mg4-MUG，用抽提液溶解并定容至300mL，现配现用。
5.90.2mg/mL牛血清蛋白溶液。称量20.0mg牛血清蛋白标准品，用DPBS溶解并定容至100mL，现配现用。
5.10反应终止液。称取21.20gNa2COs，用水溶解并定容至1000mL。5.11考马斯亮蓝染色液。称取0.5g考马斯亮蓝G-250，溶干50mL90%的乙醇中，并加人DPBS100mL，用水定容至1000mL，混匀后常温保存。有效期一个月。5.1210μmol/L4-MU母液。称取17.6mg4-MU，用反应终止液溶解并定容至10mL，混匀，得到10mmol/L4-MU溶液。吸取1mL10mmol/L4-MU溶液加人9mL反应终止液，混勾，得到1mmol/L4-MU溶液。吸取100μL1mmol/L4-MU溶液加人9.9mL反应终止液混匀，得到10μmol/L4-MU溶液。4℃避光暂存。
5.134-MU使用液。吸取200μL10μmol/L4-MU母液，加入至9.8mL反应终止液中，混匀后得到200nmol/L的4-MU使用液。然后吸取1mL200nmol/L的4-MU，加人1mL反应终止液，混匀后得到100nmol/L的4-MU使用液，依次两倍稀释，得到50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L、6.25nmol/L的4-MU使用液。
5.14NAA。纯度≥98%。
5.15GA。纯度≥98%。
5.16ZT。纯度≥98%。
GB/T38484—2020
5.171mg/mLNAA标准贮备液。称取10.0mgNAA标准品，用0.5mL无水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混勾后，4℃冰箱冷藏，保存期1个月。5.181mg/mLGA：标准贮备液。称取10.0mgGA：标准品，用0.5mL无水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混匀后，4℃冰箱冷藏，保存期1个月。5.191mg/mLZT标准贮备液。称取10.0mgZT标准品，用0.5mL无水乙醇溶解，用水定容至10mL，充分混匀后，4℃冰箱冷藏，保存期1个月。5.20NAA标准工作液。吸取200μL1mg/mLNAA标准备液，800μL细胞系培养液，混匀，得2×10-1mg/mLNAA溶液。依次10倍稀释得2.00×10-4mg/mL2.00×10-5mg/mL、2.00X10-mg/mlNAA标准工作液。吸取632μL1mg/mLNAA标准贮备液，368μL细胞系培养液，混匀，得6.32×10-1mg/mLNAA溶液。依次10倍稀释得6.32×10-5mg/mL、6.32×10-6mg/mLNAA标准工作液。临用前配制。
5.21GA：标准工作液。吸取200μL1mg/mLGA：标准贮备液，800μL细胞系培养液，混匀，得2×10-lmg/mLGA，溶液。依次10倍稀释得2.00×10-*mg/mL、2.00×10-5mg/mL、2.00×10-6mg/mLGA：标准工作液。吸取632μL1mg/mLGA：标准贮备液，368μL细胞系培养液，混勾，得6.32×10-1mg/mLGA：溶液。依次10倍稀释得6.32×10-5mg/mL、6.32×10-mg/mLGA，标准工作液。临用前配制。
5.22ZT标准工作液。吸取200μL1mg/mLZT标准贮备液，800μL细胞系培养液，混匀，得2×10-1mg/mLZT溶液。依次10倍稀释得2.00×10-3mg/mL、2.00×10-4mg/mL、2.00×10-5mg/mLZT标准工作液。吸取632μL1mg/mLZT标准贮备液，368μL细胞系培养液，混匀，得6.32×10-1mg/mlZT溶液。依次10倍稀释得6.32×10-4mg/mL、6.32×10-5mg/mLZT标准工作液。临用前配制。6仪器设备
pH计：精度0.01。
电子分析天平：精度0.1mg、0.01g、1g。6.3光照培养箱：25℃±1℃。
6.4恒温水浴锅：37℃。
细胞培养板，
酶标仪：可同时检测吸光度和荧光强度。6.7
酶标板：黑色。
7测定步骤
7.1试样制备
按供试样品的有效物质（或待测物质）质量换算，称量足量固体样品或量取足量液体样品，按产品使用说明书或待测物质特性选择合适的试剂或水溶解配制有效物质（或待测物质）的溶液作为待测试样，浓度记为Po（mg/mL）。待测时用相应缓冲液将待测试样进行5倍或10倍梯度稀释，稀释后浓度记为，（mg/mL）。试样至少制备3个浓度梯度，每个浓度样品至少重复测量三次。3
GB/T38484—2020
7.2GUS蛋白诱导表达水平测定
7.2.1试样处理诱导GUS蛋白表达及样品制备准备3个以上细胞培养板，每个板为一个重复，对每格进行编号，按检测对象选择相应的细胞系和标准物，将1mL的AuxREs::GUS细胞系加人细胞培养板的培养孔，每个孔再分别对应加人1mL细胞系培养液、不同浓度的NAA标准品工作液和不同浓度的试样溶液，做好标记，25℃光照培养箱培养6h进行处理诱导GUS表达。然后将处理后的细胞系转移至10mL离心管，加入1mL抽提液混勾后冰上裂解20min。4℃14000g离心30min后吸取上清液即为样品溶液。7.2.2样品中总蛋白浓度的测定
分别吸取0μL、2.0μL、4.0μL、6.0μL、8.0μL、12.0μL、16.0μL、20.0μL标准品牛血清蛋白溶液加人酶标板加样孔.中，加DPBS溶液补足至20.0uL(各孔中牛血清蛋白含量分别为0μg、0.40μg、0.80ug、0.12μg、0.16ug、2.40ug、3.20μg、4.00ug）；根据样品中蛋白含量吸取适量样品（体积为V.)加人酶标板加样孔中，加DPBS溶液补足至20.0μL；每个标准品或样品溶液重复加人3个加样孔，以DPBS溶液为空白对照调零，然后分别加人200μL考马斯亮蓝染色液与标准品或样品溶液混匀，在波长595nm处测量吸光度，以牛血清蛋白含量为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准曲线，并根据式（1)计算样品中总蛋白浓度P点。
式中：
Pa——样品的总蛋白浓度，单位为微克每微升（μg/uL)；m—从标准曲线得到的样品的蛋白质含量，单位为微克（μug）；V，——测蛋白含量时加样的体积，单位为微升(uL)。计算结果保留至小数点后四位。7.2.3样品中GUS蛋白酶活测定
取适量样品溶液（使总蛋白含量在20ug200μg），记录体积V2，加入1mL含有1mmol/L4-MUG的抽提液，37℃水浴，在水浴5min、25min、45min、65min以及85min时各取出200μL反应液，加人800μL反应终止液混勾后，吸取200μL加人酶标板加样孔。吸取200μL4-MU使用液(4-MU含量分别为200nmol、100nmol、50nmol、25nmol、12.5nmol、6.25nmol)，加人酶标板加样孔.。注意，每个样品检测酶标板上均需带上标准品，每个标准品或样品溶液重复加入3个加样孔，以反应终止液为空白对照调零，在激发波长365nm，吸收波长455nm的条件下测量荧光强度。以4-MU标准品浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，并通过该标准曲线将样品反应后荧光强度换算为样品反应后实际产生的4-MU的物质的量，最后以样品反应时间为横坐标，样品反应后产生的4-MU的物质的量为纵坐标绘制标准曲线，计算GUS蛋白每分钟水解4-MUG产生4-MU的物质的量n，并根据式(2)计算样品中GUS酶活y。
式中：
样品中GUS酶活，单位为皮摩尔每分微克[pmol/（min·μg）]；（2）
n——样品中GUS蛋白每分钟水解4-MUG产生4-MU的物质的量，单位为皮摩尔每分(pmol/min)；P益——样品中总蛋白浓度，单位为微克每微升（ug/uL)；V2——测GUS酶活时的加样体积，单位为微升(μL)。4
计算结果保留至小数点后三位。3标准曲线绘制
GB/T38484—2020
按7.2所述测定标准品工作液处理后GUS蛋白诱导表达水平，并参照附录A对数据进行记录。以10为底取标准品工作液浓度的对数值x为自变量，GUS酶活y为因变量，绘制标准曲线。7.4测量
按7.2所述测定试样溶液处理后GUS蛋白诱导表达水平，并参照附录A对数据进行记录。y值在标准曲线线性范用的试验视为有效试验，记录试样浓度β，无效试验所获得的数据应舍去。然后依据有效y值从标准曲线中计算，依据式（3)计算试样中植物激素类次生代谢产物的生物活性，若有多个有效y值，则按式（3)计算取其平均值。E_2p×10
式中：
植物激素类次生代谢产物的生物活性；待测试样的浓度，单位为毫克每毫升（mg/mL）；p
o——稀释后待测试样的浓度，单位为克每毫升（mg/mL)；标准工作液浓度的对数值。
...（3)
以三次以上独立实验结果的平均值为试样中含有的植物激素类次生代谢产物的生物活性定值，计算结果保留三位有效数字。
重复性
在重复性条件下获得的三次独立测定结果的绝对值差值不得超过算数平均值的20%。5
GB/T38484—2020
A.1牛长素活性检测数据记录见表A.1，表A.1
对照组
检测指标
细胞系培养液
试验溶液实际浓度
蛋白浓度标准曲线
总蛋白
浓度蓝
酶活y
标准曲线
附录A
（资料性附录）
检测数据记录表
生长素活性检测数据记录表
NAA标准品工作液
2.00×10-4
1.00×10-4
6.32×10-5
3.16×10-5
细胞分裂素活性检测数据记录见表A.2。A.2
对照组
检测指标
细胞系培养液
试验溶液实际浓度
蛋白浓度标准曲线
6.32×10-6
3.16×10-6
细胞分裂素活性检测数据记录表ZT标准品工作液
2.00×10-3
1.00×10-3
6.32×10-4
3.16×10-4
1.00×10-4
6.32×10-5
3.16×10-5
2.00×10-0
1.00×10-6
2.00×10-5
1.00×10-5
试样溶液
试样溶液
检测指标
总蛋白
浓度pn
酶活y
标准曲线
对照组
细胞系培养液
3赤霉素活性检测数据记录见表A.3。表A.2（续）
ZT标准品工作液
6.32×10-
2.00×10-4
6.32×10-
3赤霉素活性检测数据记录表
对照组
检测指标
细胞系培养液
试验溶液实际浓度
蛋白浓度标准曲线
总蛋白
浓度e
酶活y
标准曲线
2.00×10-
GA：标准品工作液
6.32×10-5
2.00×10-5
6.32×10-
GB/T38484—2020
试样溶液
2.00×10-5
2.00×10-6
试样溶液
1.00×10-6
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