GB/T 38475-2020.Detection of mycotoxins in pigment-Rapid quantitative method of colloidal gold strip test.
1范围
GB/T 38475规定了用胶体金快速定量法检测天然色素产品中生物毒素的方法。
GB/T 38475适用于基于天然产物提取及发酵制备的天然色素产品中黄曲霉素B、桔青霉素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的快速定量检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 5491粮食、油料检验 扦样 、分样法
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3原理
试样提取液中的生物毒素在层析过程中与检测试剂条中胶体金微粒标记的特异性抗体竞争结合并发生呈色反应,颜色深浅与试样中生物毒素含量相关。用读数仪检定检测条上检测线和质控线颜色深浅,根据颜色深浅和读数仪内置曲线自动计算出试样中生物毒素含量。
4试剂或材料.
除另有说明外,所用试剂均为分析纯。
4.1水
GB/T 6682,二级水。
4.2 黄曲霉毒素B
纯度≥98%。
4.3 桔青霉素
纯度≥98%。
4.4玉米赤霉烯酮
纯度≥98%。
4.5 呕吐毒素
纯度≥98%。
4.6苯+ 乙腈混合液
量取98.0mL苯,加2.0mL乙腈,混匀。
4.7稀释缓冲液
称取2.422 8 g三羟甲基氨基甲烷,加水溶解,调pH=8.0;加入9.0 g氯化钠、5 mL Triton X-100,用水定容至1 000 mL;或采用商品化的同类产品。
4.8 70%(体积分数)甲醇溶液提取液
取70.0 mL的甲醇加水30.0 mL,混匀。
4.9 PBS缓冲溶液
称取8.0 g氯化钠、1.2 g磷酸氢二钠、0.2 g磷酸二氢钾、0.2 g氯化钾,用水溶解,调节pH至7.0,用水定容至1 000 mL。
4.10 0.1%(体积分 数)吐温20-PBS溶液
移取1 mL吐温20,以PBS缓冲溶液定容至1 000 mL。
本标准规定了用胶体金快速定量法检测天然色素产品中生物毒素的方法。 本标准适用于基于天然产物提取及发酵制备的天然色素产品中黄曲霉素B1、桔青霉素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的快速定量检测。

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38475—2020
色素中生物毒素检测
胶体金快速定量法
Detection of mycotoxins in pigment-Rapid quantitativemethod of colloidal gold strip test2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-19实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口GB/T38475—2020
本标准起草单位：中国计量大学、中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司本标准主要起草人：崔海峰、叶子弘、马爱进、刘丽强、张明洲、俞晓平、许益鹏、申居旭萍、张雅芬匡华、郝帅。
1范围
色素中生物毒素检测
胶体金快速定量法
本标准规定了用胶体金快速定量法检测天然色素产品中生物毒素的方法。GB/T38475—2020
本标准适用于基于天然产物提取及发酵制备的天然色素产品中黄曲霉素Bi、桔青霉素、玉米赤霉烯酮、呕吐毒素的快速定量检测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T5491粮食、油料检验扦样、分样法GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法原理
试样提取液中的生物毒素在层析过程中与检测试剂条中胶体金微粒标记的特异性抗体竞争结合并发生呈色反应，颜色深浅与试样中生物毒素含量相关。用读数仪检定检测条上检测线和质控线颜色深浅，根据颜色深浅和读数仪内置曲线自动计算出试样中生物毒素含量试剂或材料
除另有说明外，所用试剂均为分析纯。4.1水
GB/T6682，二级水。
2黄曲霉毒素B，
纯度≥98%。
桔青霉素
纯度≥98%。
玉米赤霉烯酮
纯度≥98%。
5呕吐毒素
纯度≥98%。
GB/T38475—2020
苯十乙睛混合液
量取98.0mL苯，加2.0mL乙腈，混匀。4.7
稀释缓冲液
称取2.4228g三羟甲基氨基甲烷，加水溶解，调pH=8.0；加人9.0g氯化钠、5mLTritonX-100，用水定容至1000mL；或采用商品化的同类产品。370%（体积分数）甲醇溶液提取液4.8
取70.0mL的甲醇加水30.0mL，混匀PBS缓冲溶液
称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用水溶解，调节pH至7.0，用水定容至1000mL。
4.100.1%（体积分数）吐温20-PBS溶液移取1mL吐温20，以PBS缓冲溶液定容至1000mL。4.110.1%（体积分数）磷酸溶液准确移取1mL磷酸，加水定容至1000mL。4.120.1mg/L的生物毒素标准储备液分别准确称取一定量的生物毒素标准品，用苯十乙睛（98：2)溶液溶解，容量瓶定容至10mL，配制0.1mg/L的生物毒素标准储备液，保存于4℃备用，可保存1年。5仪器设备
5.1天平：精度0.01g和0.01mg。2粉碎机：转速不低于3000r/min。5.2
3离心机：转速不低于3000×g。5.3
涡旋振荡器。
读数仪：可测定并显示胶体金免疫层析试纸条的检测结果6胶体金免疫层析检测试纸条：性能要求见附录A。5.6
微量移液器。
免疫亲和柱：柱体积规格1mL或3mL，柱容量不低于200ng，或等效柱样品制备
试样取样
按照GB/T5491执行。
6.2试样制备
6.2.1固体样品
GB/T38475—2020
天平称取有代表性的固体或样品500g，其中300g用粉碎机粉碎至全部通过20目筛，混匀，分两份密封冷冻保存。取一份保存样品准确称取2.0g试样于10mL具塞锥形瓶中，加入20.0mL70%甲醇溶液提取液，密闭，用涡旋振荡器振荡2min3min，静置后用滤纸过滤，或取1.5mL混合液于离心管中，用离心机离心1min。取滤液或离心后上清液100μL于另一离心管中，加900μL于稀释缓冲液，充分混匀待测。如样品为特殊材料，需将稀释后的混合液用针头过滤器过滤，即为待测液。6.2.2液体样品
液体待测样品用均质器，处理不少于2min，充分混匀后，用微量移液器分别吸取1.0mL加人2个2.0mL离心管中，一份密封冷冻保存，一份用于检测。从待测离心管中吸取200μL离心液体样品于另一离心管中，加人1.8mL稀释缓冲液，充分混匀待测。6.2.3净化
将免疫亲和柱连接在10mL玻璃针筒下，准确移取10.0mL上述样品滤液过免疫亲和柱，以1滴/s～2滴/s的流速全部通过亲和柱；加人10mL0.1%吐温20-PBS溶液，以1滴/s～2滴/s的流速淋洗柱子，直至空气进人到亲和柱中，弃去全部流出液。准确加人1.0mL洗脱液进行洗脱，洗脱流速为1滴/s～2滴/s。收集全部洗脱液于离心管中备用。注：净化处理仅针对红曲红等对胶体金反应结果产生严重背景干扰的色素产品。7测定
7.1低温保存的检测试纸条取出后，室温放置20min～30min。胶体金试剂条：将试纸条浸人含300μL～500μL待测溶液的离心管中，室温孵育5min7.2
7.3胶体金检测卡：将60μL～80uL待测溶液加入到检测孔中，室温孵育5min。宜选择胶体金检测试纸条或检测卡生产厂家的读数仪配套使用。7.4
8结果分析
8.1反应结束后，取出胶体金免疫层析检测试纸条或检测卡观察C线（质控线）和T线（检测线）的显色情况。若出现C线不出现，或C线出现但弥散或严重不均匀，或C线出现但T线弥散或严重不均匀，均视为无效检测。
8.2调整读数仪参数，固定好胶体金检测试纸条或检测卡，对目标毒素进行检测，测定需要在2min内完成，重复测定3次，读数仪根据内置拟合曲线自动计算并显示样品中相应生物毒素的含量，单位为微克每千克（ug/kg）或微克每升（μg/L）。8.3在相应生物毒素的检测范围内，基于阴性对照样品，设置空白样品添加的不同浓度梯度，其中黄曲薄毒素B，浓度范围为2ug/kg128ug/kg；桔青霉素浓度范围为40μg/kg～640μg/kg；呕吐毒素浓度范围为300μg/kg14400ug/kg；玉米赤霉烯酮浓度范围为40ug/kg~1920μg/kg。基于标准样品浓度值与代表T线强度光密度值的积分面积检测数据，采用四参数logistic拟合算法建立标准曲线！拟合程度R2值应在0.99以上。
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重复性
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。10其他
本方法检出限黄曲霉毒素B,2.0μg/kg，桔青霉素40ug/kg，玉米赤霉烯酮60μg/kg，呕吐毒素500μg/kg。
A.1准确性
附录A
（规范性附录）
胶体金快速检测试纸条性能要求GB/T38475—2020
采用最低检测限2倍、5倍、8倍浓度水平的实物标准样品，每个浓度水平测定不低于6次。计算检测条检测结果与实物标准样品的偏差，3个浓度水平的偏差均应控制在一20%～十20%之间A.2精密度
采用最低检测限5倍浓度水平的实物标准样品，测定不低于6次，计算检测条批次内变异系数，变异系数≤20%。
A.3检测限
测定20份阴性样品，计算平均值加3倍标准差，其结果应小于或等于产品灵敏度标示值a
A.4批间稳定性
采用约10ug/kg浓度水平的实物标准样品进行检测，不得低于6个批次，每个批次测定不低于2次，批内测定取平均值，计算检测条批间变异系数，变异系数应小于或等于20%。A.5
特异性
选取阴性待测样品，加入与目标检测生物毒素可能存在交叉反应的其他生物毒素，除目标检测生物毒素添加样品检测结果为阳性外，其余添加样品测定结果均为阴性5
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