GB/T 38477-2020.Determination of gene expression-Western blot.
1范围
GB/T 38477规定了用蛋白印迹( Western blot)法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤和结果分析。
GB/T 38477适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语、定义和缩略语
3.1 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1
基因表达 gene expression
将储存在DNA分子中的遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA:牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin)
ECL:增强型化学发光( Enhanced Chemiluminescence)
SDS:十二烷基硫酸钠( Sodium Dodecyl Sulfate)
SDS-PAGE:十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
TBS: Tris缓冲盐溶液( Tris Buffered Saline)
TBST :吐温-20/ Tris缓冲盐溶液(Tween-20/ Tris Buffered Saline)
4.原理
SDS-PAGE分离的蛋白质转移到转印膜上后，先用抗目的蛋白质的一抗与转印膜上的蛋白质反应,然后利用带标记的二抗与一抗反应,最后根据二抗标记物的特性,检测微量蛋白质。
本标准规定了用蛋白印迹（Western blot）法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤及结果分析。 本标准适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定。 　　

ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38477—2020
基因表达的测定
蛋白印迹法
Determination of gene expression-Western blot2020-11-19发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-19实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38477—2020
本标准起草单位：河北医科大学、中国标准化研究院、河北省食品检验研究院、中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心、中国医科大学、河北师范大学本标准主要起草人：吕品、马爱进、张岩、赵伟东、曹鹏秀、赵美承、王宁。I
1范围
基因表达的测定
蛋自印迹法
GB/T38477—2020
本标准规定了用蛋白印迹（Westernblot)法测定基因表达的方法原理、试剂或材料、仪器设备、测定步骤和结果分析。
本标准适用于动植物组织或体外培养细胞目的基因表达测定。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682
分析实验室用水规格和试验方法术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
基因表达
gene expression
将储存在DNA分子中的遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子的过程。2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA：牛血清白蛋白（BovineSerumAlbumin）ECL：增强型化学发光（EnhancedChemiluminescence）SDS：十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate）SDS-PAGE：十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SodiumDodecylSulfate-PolyacrylamideGelElectrophoresis)
TBS：Tris缓冲盐溶液（TrisBufferedSaline）TBST：叶温-20/Tris缓冲盐溶液（Tween-20/TrisBufferedSaline)4原理
SDS-PAGE分离的蛋白质转移到转印膜上后，先用抗目的蛋白质的一抗与转印膜上的蛋白质反应，然后利用带标记的二抗与一抗反应，最后根据二抗标记物的特性，检测微量蛋白质1
GB/T38477—2020
5试剂或材料
5.1总则
除非另有规定，仅使用分析纯试剂。水
GB/T6682，二级。
31mol/LTris-盐酸溶液
称取12.1gTris加人80mL水溶解，用盐酸调至所需pH,加水定容至100mL。5.42mol/L氯化钠溶液
将117g氯化钠加水溶解，定容至1000mL。50.5mol/L乙二胺四乙酸溶液
称取18.61g乙二胺四乙酸二钠二水合物，加人80mL水，充分搅拌，用氢氧化钠调pH至8.0，然后定容至100mL。
6动物细胞/组织总蛋白裂解液
取5mL1mol/LTris-盐酸溶液（pH8.0）、7.5mL2mol/L氯化钠溶液、lmL0.5mol/L乙二胺四乙酸溶液、1mL乙基苯基聚乙二醇、0.1g十二烷基硫酸钠、1g脱氧朋酸钠、加水定容至100mL。使用前加人蛋白酶抑制剂。
5.7植物总蛋白抽提试剂盒
含裂解液和蛋白酶抑制剂。
31.5mol/LTris-盐酸（pH8.8）溶液5.8
将18.15gTris加人80mL水溶解，用1mol/L盐酸调pH至8.8，加水定容至100mL。5.9
丙烯酰胺溶液
称取29g丙烯酰胺单体和1gN，N'-甲叉双丙烯酰胺，加水溶解并定容至100mL，过滤，置于棕色瓶，4℃避光保存，2个月内使用。5.100.1g/mL十二烷基硫酸钠溶液称取10g十二烷基硫酸钠，加水溶解并定容至100mL，室温保存。0.1g/mL过硫酸铵溶液
称取1g过硫酸铵，加水溶解并定容至10mL，分装后，于一20℃保存。5.12蛋白浓度测定试剂盒
含蛋白质标准品BSA和染料试剂。2
5.135×SDS上样缓冲液
GB/T38477—2020
取2.5mL1mol/LTris-盐酸（pH6.8)缓冲液、2g十二烷基硫酸钠、1.2mLβ-巯基乙醇、4mL甘油、0.2g漠酚蓝加人水中溶解，定容至40mL。5.145×SDS-PAGE电泳缓冲液
称取23.5g甘氨酸和3.775gTris，加水溶解，定容至250mL。使用时按如下比例稀释至使用浓度：取133mL5XSDS-PAGE电泳缓冲液，7mL0.1g/mL十二烷基硫酸钠溶液，加水定容至700mL。5.15转膜缓冲液
称取3.03gTris，14.4g甘氨酸，加水溶解，再加200mL甲醇混勾，定容至1L，4℃保存。5.16TBS溶液
量取75mL2mol/L氯化钠溶液和10mL1mol/LTris-盐酸（pH7.5)缓冲液，加水定容至1L。5.17TBST溶液
量取75mL2mol/L氯化钠溶液、10mL1mol/LTris-盐酸（pH7.5)缓冲液和1mL叶温-20，加水定容至1L。
5.18封闭液
称取5g脱脂奶粉，溶于100mLTBST溶液，混匀，现用现配。6
仪器设备
6.1电泳仪。
转膜仪。
垂直电泳槽。
分析天平，感量0.001g。
平板摇床。
低温离心机，最大离心力25910g。化学发光仪/红外荧光成像系统。振荡器。
真空干燥器。
2.45mm超厚滤纸。
1.5mL离心管。
磁力搅拌器。
7测定步骤
7.1总蛋白的提取
动物总蛋白的提取
将20mg体外培养的细胞或研碎的组织转移至1.5mL的离心管中，加150μL～250μL预冷的细胞裂3
GB/T38477—2020
解液（含蛋白酶抑制剂），振荡器震荡15s，冰浴5min，重复震荡-冰浴30min后，4℃，12000r/min离心10min，得上清液。
7.1.2植物总蛋白的提取
按照植物总蛋白提取试剂盒说明进行。7.2
2蛋白浓度的测定
按照蛋白浓度测定试剂盒说明进行。3SDS-PAGE
7.3.1蛋白变性下载标准就来标准下载网
测完蛋白浓度后，计算含100μg总蛋白的溶液体积即为上样量。取出上样样品于离心管中，加人5×SDS上样缓冲液至终浓度为1X，将样品于沸水中煮3min～5min使蛋白质变性。7.3.2制胶
根据蛋白质相对分子质量大小选择相应的SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度，参见附录A。7.3.3上样
取7.3.1的蛋白样品上样，相邻齿道加上标准分子量预染蛋白，空余齿道用1×上样缓冲液补足体积。
7.3.4电泳
选择电压为8V/cm，当染料进入分离胶后，把申压提高到15V/cm，继续申泳直到溴酚蓝达到分离胶底部，然后关闭申源。
7.4转膜
7.4.1凝胶准备
将进行宗SDS-PAGE后的凝胶浸泡干转膜缓冲液中30min。7.4.2半干法转移蛋白质
将转印膜和两张与转印膜相同尺寸的滤纸干转膜缓冲液中浸泡5min。由下至上安装转移装置：阳极板一超厚滤纸一转印膜一凝胶一超厚滤纸一阴极板，根据凝胶面积按0.65mA/cm2接通申流，根据目的蛋白相对分子量大小，转移1.5h～3h。7.5
将转印膜置于封闭液中，室温摇动1h。7.6
免疫反应
将封闭后的转印膜转移到一抗工作液中，室温下摇动1h以上或4℃缓慢摇动过夜。弃去一抗工作液，用TBST摇动洗涤转印膜3次，每次10min，最后用TBS摇动洗涤转印膜5min。将转印膜置于二抗工作液中，室温下摇动1h3h。弃去二抗工作液，以TBST摇动洗涤转印膜3次，每次10min，最后用TBS摇动洗涤转印膜5min。4
7.7成像
辣根过氧化物酶标记二抗的成像GB/T38477—2020
取ECL化学发光液A、B等量混匀，加在转印膜上，避光显色1min～5min，化学发光仪成像。7.7.2
荧光标记二抗的成像
利用荧光成像系统成像
结果分析
成像图片本底干净，能观察到转印膜均匀的轻微背景轮廓，目的条带清晰且不过曝，即可判为目的蛋白表达。
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SDS-PAGE分离胶
根据所需浓度不同，按照表A.1配制。表A.1
凝胶浓度
1.5 mol/L Tris-盐
酸(pH8.8)）
SDS-PAGE浓缩胶
（资料性附录）
试剂配制
配制10mL不同浓度分离胶所用溶液溶液成分
0.1g/mL十二烷基
丙烯酰胺溶液
按照表A.2配制SDS-PAGE浓缩胶。表A.2
凝胶浓度
1 mol/L Tris-盐
酸(pH6.8)
硫酸钠溶液
过硫酸铵溶液
配制5mL5%浓缩胶所用溶液
溶液成分
0.1g/mL十二烷基
丙烯酰胺溶液
硫酸钠溶液
过硫酸铵溶液
四甲基乙二胺
四甲基乙二胺
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