GB/T 38792-2020
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标准简介
GB/T 38792-2020.Technical specification for cytological evaluation of protein allergenicity.
1范围
GB/T 38792规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法。
GB/T 38792适用于由免疫球蛋白E(IgE)介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
蛋白质致敏性 protein allergenicity
由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性。
注:本标准中的蛋白质致敏性特指由嗜碱性粒细胞(RBL-2H3)表面结合的IgE与蛋白质相互作用后导致β-氨基己糖苷酶释放的程度。
4要求
4.1按 照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管、交接、配制、回收、退还/销毁处理,并制定相应的管理制度和程序。
4.2实验室应符合生物安全一 级要求。细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。其中,缓冲间面积应不小于3 m2,并设有更衣柜和紫外灯,紫外灯的强度为不少于1.5 W/m3。紫外灯源距地面不应超过2.5m,每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。
4.3评价使用的仪 器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要。评价需要的器皿材料应经过无菌处理,试验操作过程均为无菌操作。
4.4实验用水应满足GB/T 6682的要求,所使试剂使用前都需经无菌处理。
4.5评 价实验结束后,实验材料应进行无害化处理。
4.6蛋白质致敏性评价结果以β-氨基己糖苷酶最大释放率表示。
4.7评 价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、β-氨基己糖苷酶最大释放率。
1范围
GB/T 38792规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法。
GB/T 38792适用于由免疫球蛋白E(IgE)介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
蛋白质致敏性 protein allergenicity
由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性。
注:本标准中的蛋白质致敏性特指由嗜碱性粒细胞(RBL-2H3)表面结合的IgE与蛋白质相互作用后导致β-氨基己糖苷酶释放的程度。
4要求
4.1按 照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管、交接、配制、回收、退还/销毁处理,并制定相应的管理制度和程序。
4.2实验室应符合生物安全一 级要求。细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。其中,缓冲间面积应不小于3 m2,并设有更衣柜和紫外灯,紫外灯的强度为不少于1.5 W/m3。紫外灯源距地面不应超过2.5m,每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。
4.3评价使用的仪 器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要。评价需要的器皿材料应经过无菌处理,试验操作过程均为无菌操作。
4.4实验用水应满足GB/T 6682的要求,所使试剂使用前都需经无菌处理。
4.5评 价实验结束后,实验材料应进行无害化处理。
4.6蛋白质致敏性评价结果以β-氨基己糖苷酶最大释放率表示。
4.7评 价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、β-氨基己糖苷酶最大释放率。
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标准内容
ICS07.080
中华人民共和国国家标准
GB/T38792—2020
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范Technical specification for cytological evaluation of protein allergenicity2020-04-28发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38792—2020
本标准起草单位：中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司、石家庄君乐宝乳业有限公司。
本标准主要起草人：马爱进、吴晓玲、胥传来、匡华、袁爱梦、刘丽强、马伟、徐丽广、王忠兴、郝帅、柴艳兵、张耀广。
1范围
蛋自质致敏性细胞学评价技术规范本标准规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法。本标准适用于由免疫球蛋白E（IgE）介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价。规范性引用文件
GB/T38792—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
蛋白质致敏性proteinallergenicity由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性注：本标准中的蛋白质致敏性特指由嗜碱性粒细胞（RBL-2H3)表面结合的IgE与蛋白质相互作用后导致β-氨基已糖苷酶释放的程度。
4要求
4.1按照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管、交接、配制、回收、退还/销毁处理.并制定相应的管理制度和程序。
4.2实验室应符合生物安全一级要求。细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于1.5W/m。紫外灯源距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。
4.3评价使用的仪器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要。评价需要的器皿材料应经过无菌处理，试验操作过程均为无菌操作。4.4实验用水应满足GB/T6682的要求，所使试剂使用前都需经无菌处理。4.5评价实验结束后，实验材料应进行无害化处理。4.6蛋白质致敏性评价结果以β-氨基已糖苷酶最大释放率表示。4.7
7评价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、β-氨基已糖酶最大释放率。SAG
GB/T38792—2020
5证实方法
5.1β-氨基己糖苷酶释放率测定5.1.1样品前处理
5.1.1.1固体样品
5.1.1.1.1
植物性样品
将待测样品粉碎、450μm微孔滤膜过滤后，准确称取5.00g于聚丙烯离心管中，向离心管中加人40mL水，充分振荡混匀。将离心管水平置于振荡器中，室温下100次/min，振荡12h，5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚内烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉未可于2℃~8℃贮存，时间不超过24h。
5.1.1.1.2动物性样品
将待测样品搅碎勾浆后，准确称取5.00g，置于漏斗中，加人50mL石油醚进行连续3次冲洗后，放人烘箱中烘干。将烘干后的样品置于聚丙烯离心管中，向离心管中加人10mL15%三氯乙酸溶液（体积分数），充分振荡混匀，静置10min。样品溶液5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉末可于2℃～8℃贮存，时间不超过24h。5.1.1.2液体或半液体样品
称取5.00g液体样品，置于漏斗中，加人50mL石油醚进行连续3次冲洗后，放入烘箱中烘干。将烘干后的样品置于聚丙烯离心管中加人40mL水，充分振荡混匀匀，将离心管水平置于振荡器中，室温下100次/min，振荡过夜12h，5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉末可于2℃～8℃贮存，时间不超过24h。5.1.2样品溶液制备
称取上述蛋白样品50.0mg，用PBS缓冲液（参见附录A）溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成质量浓度为1mg/mL的储备溶液。试验时用Tyrodes液（参见附录A）稀释成一定浓度的工作液，现用现配。
5.1.3细胞培养
将RBL-2H3细胞（参见附录A)置于细胞培养瓶中，加入10mL的细胞培养液（参见附录A），于37℃,5%二氧化碳细胞培养箱中培养48h～72h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。当细胞生长至培养瓶的80%～90%时，进行细胞计数和细胞接种。5.1.4细胞接种
将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用PBS缓冲液洗细胞一次。向细胞培养瓶内加人2.0mL胰蛋白酶溶液（参见附录A），于37℃消化2min～4min。在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆接近脱壁时，将胰蛋白酶溶液倒掉。加入10mL细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱壁制成细胞悬液。吸取细胞悬液，以200μL/孔加到细胞培养板中，使细胞接种密度为1×10°细胞/mL。37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中培养24h使其贴壁。2
5.1.5细胞活化
GB/T38792—2020
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以200μL/孔向细胞培养板内加人含50ug/mLIgE（参见附录A)的细胞培养液，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中继续培养24h。5.1.6细胞与蛋白的激发作用
5.1.6.1样品组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。分别以50uL/孔向细胞培养板内加入不同浓度的待测蛋白工作液，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min。反应结束后，放入冰水中终止反应。上述各项均设3个复孔。5.1.6.2全部释放组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以50uL/孔向细胞培养板内加人细胞裂解液（参见附录A），轻轻吹打使裂解液和RBL-2H3细胞充分接触，4℃反应45min后，吸取全部细胞培养上清，1200r/min离心5min，收集细胞上清液。上述设3个复孔。5.1.6.3空白对照组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以50μuL/孔向细胞培养板内加入Kaeerr
Tyrode's液，37℃5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min，反应结束后，放人冰水中终止反应。上述设3个复孔。
5.1.7测定
吸取5.1.6中作用后的反应液，以30/孔转移至新的细胞培养板中，以50μL/孔向细胞培养板内加人PNP-NAG溶液（参见附录A），37反应1h后，以200μL/孔加入碳酸钠终止液（参见附录A)终止反应，用酶标仪在波长405nm处测各孔吸光度值。样品组的吸光度标记为A1，空白对照组的吸光度标记为A。全部释放组标记为Am。5.2β-氨基已糖苷酶释放率结果计算β3-氨基已糖苷酶释放率按式(1)计算：(Ai-A.)
(Am-A.）
式中：
Rβ-氨基已糖苷酶释放率；免费标准下载网bzxz
A1—样品组的吸光度；
A。——空白对照组的吸光度；
A，一全部释放组的吸光度。
平行样的平均值为最终释放率值，计算结果保留到小数点后两位。·（1)
GB/T38792—2020
GB/T6682规定的二级水。
附录A
（资料性附录）
溶液配制
A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）称取7.90g氯化钠、1.44g磷酸氢二钠1.80g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾，用980mL水溶解.用酸调节pH至7.2，再加水定容至1000mL.0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。
A.30.001mol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷溶液（PNP-NAG溶液）称取34.2mgPNP-NAG，加水溶解并定容至100mLo.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用Kaeer
A.40.1mol/L碳酸钠终止液
称取1.06g碳酸钠，加水溶解并定容至100mL,0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。A.5台氏液（Tyrode's液）
称取7.90g氯化钠、0.20g氯化钾、0.26g七水硫酸镁、0.07g二水磷酸二氢钠、1.00g碳酸氢钠、0.20g氯化钙和1.00g葡萄糖.用980mL水溶解，用盐酸调节pH至7.2，再加水定容至1000mL，0.22um微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。A.6细胞培养液
Eagle最低必需培养基（Eagle'sMinimalEssentialMedium，MEM），加人小牛血清和青霉素-链霉素，配制成含体积分数为10%小牛血清、1%青霉素-链霉素的细胞培养液，其中青霉素和链霉素的终浓度分别是100U/mL和100μg/mL。EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基，按生产厂商提供资料配制并除菌，4℃保存备用。A.7细胞裂解液
商品化1%TritionX-100细胞裂解液，主要成分为50mmolTris-HCl(pH7.2）、150mmol氯化钠和5mmol乙二胺四乙酸、体积分数为1%曲拉通X-100。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用胰蛋白酶溶液
GB/T38792—2020
称取2.50g胰蛋白酶（活力1：250），加人1000mLPBS缓冲液（A.2），混匀0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。A.9
嗜碱性粒细胞（RBL-2H3细胞）
大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞，ATCC CRL-2256细胞株。IgE球蛋白
鼠源，纯度>95%，质量浓度>50ug/mL，可选用各种同类商品化产品。iiKaeeiKAca
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中华人民共和国国家标准
GB/T38792—2020
蛋白质致敏性细胞学评价技术规范Technical specification for cytological evaluation of protein allergenicity2020-04-28发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-11-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国标准化研究院提出并归口。GB/T38792—2020
本标准起草单位：中国标准化研究院、江南大学、北京萨姆伯科技有限公司、石家庄君乐宝乳业有限公司。
本标准主要起草人：马爱进、吴晓玲、胥传来、匡华、袁爱梦、刘丽强、马伟、徐丽广、王忠兴、郝帅、柴艳兵、张耀广。
1范围
蛋自质致敏性细胞学评价技术规范本标准规定了蛋白质致敏性细胞学评价要求、证实方法。本标准适用于由免疫球蛋白E（IgE）介导的食品蛋白质致敏性的细胞学评价。规范性引用文件
GB/T38792—2020
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
蛋白质致敏性proteinallergenicity由蛋白质诱发机体发生过敏反应的特性注：本标准中的蛋白质致敏性特指由嗜碱性粒细胞（RBL-2H3)表面结合的IgE与蛋白质相互作用后导致β-氨基已糖苷酶释放的程度。
4要求
4.1按照相关法律法规和标准要求对样品进行接收、保管、交接、配制、回收、退还/销毁处理.并制定相应的管理制度和程序。
4.2实验室应符合生物安全一级要求。细胞实验工作区一般要由准备室、缓冲间、无菌室、细胞保存室组成。其中，缓冲间面积应不小于3m，并设有更衣柜和紫外灯，紫外灯的强度为不少于1.5W/m。紫外灯源距地面不应超过2.5m，每次照射时间为20min~30min。无菌室无菌等级的最低标准应达到万级。
4.3评价使用的仪器与设备种类、数量、性能、量程、精度应能满足评价的需要。评价需要的器皿材料应经过无菌处理，试验操作过程均为无菌操作。4.4实验用水应满足GB/T6682的要求，所使试剂使用前都需经无菌处理。4.5评价实验结束后，实验材料应进行无害化处理。4.6蛋白质致敏性评价结果以β-氨基已糖苷酶最大释放率表示。4.7
7评价结果应表述出评价蛋白的名称、纯度、使用浓度、β-氨基已糖酶最大释放率。SAG
GB/T38792—2020
5证实方法
5.1β-氨基己糖苷酶释放率测定5.1.1样品前处理
5.1.1.1固体样品
5.1.1.1.1
植物性样品
将待测样品粉碎、450μm微孔滤膜过滤后，准确称取5.00g于聚丙烯离心管中，向离心管中加人40mL水，充分振荡混匀。将离心管水平置于振荡器中，室温下100次/min，振荡12h，5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚内烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉未可于2℃~8℃贮存，时间不超过24h。
5.1.1.1.2动物性样品
将待测样品搅碎勾浆后，准确称取5.00g，置于漏斗中，加人50mL石油醚进行连续3次冲洗后，放人烘箱中烘干。将烘干后的样品置于聚丙烯离心管中，向离心管中加人10mL15%三氯乙酸溶液（体积分数），充分振荡混匀，静置10min。样品溶液5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉末可于2℃～8℃贮存，时间不超过24h。5.1.1.2液体或半液体样品
称取5.00g液体样品，置于漏斗中，加人50mL石油醚进行连续3次冲洗后，放入烘箱中烘干。将烘干后的样品置于聚丙烯离心管中加人40mL水，充分振荡混匀匀，将离心管水平置于振荡器中，室温下100次/min，振荡过夜12h，5000r/min离心10min，小心吸取上清液于另一个干净的聚丙烯离心管中，真空冷冻干燥，固体蛋白粉末可于2℃～8℃贮存，时间不超过24h。5.1.2样品溶液制备
称取上述蛋白样品50.0mg，用PBS缓冲液（参见附录A）溶解并定容至50mL容量瓶中，配制成质量浓度为1mg/mL的储备溶液。试验时用Tyrodes液（参见附录A）稀释成一定浓度的工作液，现用现配。
5.1.3细胞培养
将RBL-2H3细胞（参见附录A)置于细胞培养瓶中，加入10mL的细胞培养液（参见附录A），于37℃,5%二氧化碳细胞培养箱中培养48h～72h，倒置显微镜下观察细胞生长情况。当细胞生长至培养瓶的80%～90%时，进行细胞计数和细胞接种。5.1.4细胞接种
将细胞培养液从细胞培养瓶内吸出，用PBS缓冲液洗细胞一次。向细胞培养瓶内加人2.0mL胰蛋白酶溶液（参见附录A），于37℃消化2min～4min。在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆接近脱壁时，将胰蛋白酶溶液倒掉。加入10mL细胞培养液，用吸管吹打，使细胞脱壁制成细胞悬液。吸取细胞悬液，以200μL/孔加到细胞培养板中，使细胞接种密度为1×10°细胞/mL。37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中培养24h使其贴壁。2
5.1.5细胞活化
GB/T38792—2020
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以200μL/孔向细胞培养板内加人含50ug/mLIgE（参见附录A)的细胞培养液，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中继续培养24h。5.1.6细胞与蛋白的激发作用
5.1.6.1样品组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。分别以50uL/孔向细胞培养板内加入不同浓度的待测蛋白工作液，37℃，5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min。反应结束后，放入冰水中终止反应。上述各项均设3个复孔。5.1.6.2全部释放组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以50uL/孔向细胞培养板内加人细胞裂解液（参见附录A），轻轻吹打使裂解液和RBL-2H3细胞充分接触，4℃反应45min后，吸取全部细胞培养上清，1200r/min离心5min，收集细胞上清液。上述设3个复孔。5.1.6.3空白对照组
将细胞培养液从细胞培养板内吸出，用PBS缓冲液洗细胞三次。以50μuL/孔向细胞培养板内加入Kaeerr
Tyrode's液，37℃5%二氧化碳细胞培养箱中反应45min，反应结束后，放人冰水中终止反应。上述设3个复孔。
5.1.7测定
吸取5.1.6中作用后的反应液，以30/孔转移至新的细胞培养板中，以50μL/孔向细胞培养板内加人PNP-NAG溶液（参见附录A），37反应1h后，以200μL/孔加入碳酸钠终止液（参见附录A)终止反应，用酶标仪在波长405nm处测各孔吸光度值。样品组的吸光度标记为A1，空白对照组的吸光度标记为A。全部释放组标记为Am。5.2β-氨基已糖苷酶释放率结果计算β3-氨基已糖苷酶释放率按式(1)计算：(Ai-A.)
(Am-A.）
式中：
Rβ-氨基已糖苷酶释放率；免费标准下载网bzxz
A1—样品组的吸光度；
A。——空白对照组的吸光度；
A，一全部释放组的吸光度。
平行样的平均值为最终释放率值，计算结果保留到小数点后两位。·（1)
GB/T38792—2020
GB/T6682规定的二级水。
附录A
（资料性附录）
溶液配制
A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS缓冲液）称取7.90g氯化钠、1.44g磷酸氢二钠1.80g磷酸二氢钾、0.20g氯化钾，用980mL水溶解.用酸调节pH至7.2，再加水定容至1000mL.0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。
A.30.001mol/L对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷溶液（PNP-NAG溶液）称取34.2mgPNP-NAG，加水溶解并定容至100mLo.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用Kaeer
A.40.1mol/L碳酸钠终止液
称取1.06g碳酸钠，加水溶解并定容至100mL,0.22μm微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用。A.5台氏液（Tyrode's液）
称取7.90g氯化钠、0.20g氯化钾、0.26g七水硫酸镁、0.07g二水磷酸二氢钠、1.00g碳酸氢钠、0.20g氯化钙和1.00g葡萄糖.用980mL水溶解，用盐酸调节pH至7.2，再加水定容至1000mL，0.22um微孔滤膜滤过除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。A.6细胞培养液
Eagle最低必需培养基（Eagle'sMinimalEssentialMedium，MEM），加人小牛血清和青霉素-链霉素，配制成含体积分数为10%小牛血清、1%青霉素-链霉素的细胞培养液，其中青霉素和链霉素的终浓度分别是100U/mL和100μg/mL。EMEM培养基可选用各种商品供应的粉末培养基，按生产厂商提供资料配制并除菌，4℃保存备用。A.7细胞裂解液
商品化1%TritionX-100细胞裂解液，主要成分为50mmolTris-HCl(pH7.2）、150mmol氯化钠和5mmol乙二胺四乙酸、体积分数为1%曲拉通X-100。0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用胰蛋白酶溶液
GB/T38792—2020
称取2.50g胰蛋白酶（活力1：250），加人1000mLPBS缓冲液（A.2），混匀0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用或选用同类商品化产品。A.9
嗜碱性粒细胞（RBL-2H3细胞）
大鼠嗜碱性粒细胞性白血病细胞，ATCC CRL-2256细胞株。IgE球蛋白
鼠源，纯度>95%，质量浓度>50ug/mL，可选用各种同类商品化产品。iiKaeeiKAca
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