SN/T 1154-2015.Detection and identification of Lolium temulentum L.
1范围
SN/T 1154规定了植物检疫中毒麦Lolium temulentum L. 的检疫鉴定方法。
SN/T 1154适用于毒麦的检疫鉴定。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1小穗spikelet
为禾本科花序的构成单位,是禾本科花序中的一个最小花簇,每个小穗有--至数朵花，并连同基端
由内、外颖片所组成。
2.2小花(带稃颖果) floret
禾本科的花(籽实)连同包被其外的内、外稃。
2.3颖glume
禾本科小穗基部苞片,共两枚，下面一枚为第一颖(外颖outer glume),上面一枚为第二颖(内颖inner glume)。
2.4稃片squama
禾本科小穗上花的苞片,共两枚,一枚为外稃(lemma),一枚为内稃(palea)。
2.5芒awn
禾本科小穗上的颖或外稃先端伸长成刚毛状物。
2.6果脐hilum
果实成熟时,由果柄上脱落下来留下的一个痕迹。
2.7毒麦成分darnel components
混杂于加工产品中毒麦籽实成分的含量。
2.8PCR聚合酶链反应polymerase chain reaction
在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点,通过变性、退火、延伸等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1154--2015
代替SN/T1154—2002
毒麦检疫鉴定方法
Detection and identification of Lolium temulentum L2015-02-09发布
2015-09-01实施
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T1154—2015
本标准代替SN/T1154一2002《植物检疫毒麦检疫鉴定方法》。本标准内容除了进一步修订完善原标准中毒麦形态特征鉴定内容，还增加了毒麦PCR的检测方法。本标准由国家认证订可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局，中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭琼霞、康林、黄振、陈冬美，于文涛、虞赞、黄可辉。本标准2002年首次发布，本次为第一次修订。I
1范围
毒麦检疫鉴定方法
本标准规定了植物检疫中毒麦LoliumtemulentumL.的检疫鉴定方法。本标准适用于毒麦的检疫鉴定。2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1
小穗spikelet
SN/T11542015
为禾本科花序的构成单位，是禾本科花序中的一个最小花簇，每个小穗有一至数朵花，并连同基端由内、外颖片所组成。
小花（带颖果）floret
禾本科的花（籽实）连同包被其外的内、外。2.3
颖glume
禾本科小穗基部苞片，共两枚，下面一枚为第一颖（外颖outerglume），上面一枚为第二颖（内颖inner glume)
片squama
禾本科小穗上花的苞片，共两枚，一枚为外程（lemma），一枚为内（palea）。2.5
芒awn
禾本科小穗上的颖或外先端伸长成刚毛状物。2.6
果脐hilum
果实成熟时，由果柄上脱落下来留下的一个痕迹。2.7
毒麦成分darnel components
混杂于加工产品中毒麦籽实成分的含量。2.8
polymerase chain reaction
PCR聚合酶链反应
在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性退火，延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。1
SN/T1154—2015
3基本信息
3.1名称
学名Lolium temulentum L
异名Bromus temulentus(L.)Bernh：Craepalia temulenta(L.)SchrankFestucatemulenta(L.)Columbus&J.P.Sm英文名beardeddarnel,darnelpoisondarnel,poison ryegrass3.2分类地位
毒麦隶属禾本科Poaceae（Gramineae）黑麦草属（LoliumL）3.3分布
起源于地中海周边地区，欧洲广布，现已扩散到：南美洲：阿根廷、巴拿马、智利、厄瓜多尔、墨西哥、危地马拉、秘鲁，乌拉圭，委内瑞拉：北美洲：加拿大、美国；大洋洲：澳大利亚；亚洲：中国、印度；非洲：埃塞俄比亚等国家和地区。
3.4其他基本信息
毒麦有两个变种分别为：长芒毒麦（L.temulentumvar.LongiaristumParnell.）和田毒麦（L.temulentumvar.arvenseBab.），其形态特征及危害性均与毒麦（L.temulentumL.）相似。因此本标准将长芒毒麦和田毒麦与毒麦一起定义。毒麦的近似种有：长芒毒麦、田毒麦、细穗毒麦（L.remotumSchrank.）、波斯黑麦草（L.persicumBoiss&Hoben.）、瑞士黑麦草（L.rigidumGaud.）黑麦草（L.peremneL.）多花黑麦草（L.multiflorumLam.)分种检索表参见附录A。
4方法原理
毒麦及其变种长芒毒麦，田毒麦均以小穗，小花（带荐颖果）的形式混杂于植物原粮，植物种子及饲料粮之中，随之调运和引种等而传播：毒麦及其变种的毒麦成分随植物原粮及饲料粮加工混杂于样品中。本标准以毒麦，长芒毒麦，由毒麦的小穗，小花（带荐颖果）的形态特征进行判定，在毒麦，长芒毒麦、田毒麦的小穗、小花（带颖果）的形态特征不明显、混杂于加工产品中毒麦、长芒毒麦、田毒麦籽实成分的含量，本标准以PCR检测结果进行判定。5仪器、器具和试剂
5.1形态特征鉴定所用的仪器和器具5.1.1仪器
体视显微镜（带目镜测微尺或镜台测微尺）、电动筛或套筛。5.1.2器具
放大镜、解剖刀、解剖针、镊子、指形管、培养皿、白瓷盘、棉花、样品袋、标签、记录纸、标本瓶、标本2
盒、防虫剂、樟脑精、干燥剂。5.2PCR检测所用的仪器和试剂
5.2.1仪器
SN/T1154—2015
荧光PCR仪、高速冷冻离心机、UV/VIS分光光度计、电泳仪、凝胶图像分析仪、恒温水浴箱、生物安全柜、震荡器、制冰机、冰箱、超低温冰箱、移液器、电子天平。5.2.2
2主要试剂
毒麦成分PCR检测试剂和材料参见附录B。6实验室检验
6.1样品制备
将现场检疫抽取的送检样品充分混勾，制成平均样品。采用四分法，取平均样品的二分之一至四分之三（较少样品时）作为检验样品，其余的作为保存样品贴标签保存，称取并记录检验样品的质量。送检样品不足1.0kg的全检。
6.2样品检验
过筛检查
根据检验样品个体的大小确定套筛的规格，按照孔径从大到小依次套上套筛并加上筛底，将检验样品倒人最上层的套筛内，盖上筛盖，以回旋法过筛，或用电动筛振荡，使样品充分分离。把过筛的筛上物和筛下物分别倒人白瓷盘内，用镊子挑捡杂草籽，并放置于培养血内于体视显微镜下观察。检验样品个体大于黑麦草属的小穗和小花的主要检查筛下物；检验样品个体小于黑麦草属的小穗和小花的，主要检查筛上物。
6.2.2挑栋检查
羊毛，棉花等纤维类样品的实验室检测，需采用挑抹检验的方法进行。采用肉眼或借助扩大镜对纤维类样品的黑麦草属的小穗，小花（带荐颖果）进行挑检，6.2.3直接检测
对混杂于加工产品中毒麦、长芒毒麦、田毒麦籽实成分的含量，采取对制备的样品直接检测。7形态鉴定
7.1形态鉴定方法
7.1.1目测鉴定
用肉眼或借助扩大镜将挑检的杂草籽实进行分类鉴定，挑取疑似黑麦草属的小穗、小花（带荐颖果）。
SN/T1154—2015
7.1.2镜检鉴定
7.1.2.1直接镜检观察
将疑似黑麦草属的果实置放解剖镜下，观察小穗、小花（带颖果）、颖果的外部形态特征。并依据毒麦小穗、小花（带颖果）、颖果等的形态特征及毒麦及其近似种分种检索表，对疑似籽实进行种类鉴定。
7.1.2.2解剖镜检观察
从外观上难于鉴别时，可采用解剖法对果实进行解，观察其籽实内部横切面及其种胚等主要形态特征。方法是：将小穗、小花放在体视显微镜的操作台上，用解部刀、解部针，对其籽实进行解剖，镜检观察其横切面、种胚的主要形态特征。7.1.3称取干粒重
将鉴定检出的毒麦的小花（带颖果），放在电子天平上称其重量，并换算为干粒重（单位：g）。7.2鉴定特征
7.2.1黑麦草属LoliumL.主要形态特征小穗含2至数朵花，单生而无柄，两侧压扁，以背腹面对向穗轴而排列成穗状花序，小穗脱节于颖之上及各花之间；除顶生小穗具外颖外，其余均退化，内颖位于背轴之一方，具5脉～9脉：外背面圆形，具5脉，无芒或有芒；内、外等长或内稍短于外，先端尖：颖果腹面中部具纵沟，片与颖果粘合，不易脱离。
7.2.2毒麦LoliumtemulentumL.的形态特征7.2.2.1植株
毒麦为一年生草本，须根较稀疏而细弱；杆成疏丛，茎直立，无毛，具3节～4节，株高50cm～110cm；叶鞘较疏松，长于节间，叶舌长约1mm；叶片线形，长10cm~50cm，宽4mm~11mm，质地较薄，无毛或微粗糙；穗状花序长10cm25cm，宽1cm～1.5cm，小穗数12个～14个，穗轴节间长5mm~7mm，下部者长可达1cm（参见图c.1)。7.2.2.2小穗
青麦每小穗含4花~7花，以5花为多：小穗轴长1.0mm~1.5mm，光滑无毛：小穗长8mm26mm，宽3mm～5mm；除顶生小穗具外颖外，其余的外颖均退化：内颖长于小穗、背轴，披针形，具狭膜质的边缘，脉纹5脉~9脉，长8mm~10mm，宽1.5mm~2.0mm（参见图C.2）。7.2.2.3小花
毒麦的小花（带颖果）长6mm~9mm宽2.2mm~2.8mm，厚1.5mm~2.5mm；椭圆形或长椭圆形，粗短而膨胀；片淡黄色或黄褐色：内、外程顶端较尖，外披针形，具5脉，背面较平直，腹面显著弓隆，先端急尖，基盘狭窄而截平，顶端膜质透明；芒自外顶端下方约0.5mm处伸出，长约10mm；内约与外荐等长，具2脊，两边脊上具窄翼和微小的纤毛，近中部通常有横皱纹和纵沟；带颖果为内、外荐所紧贴，不易剥离（参见图C.2）。4
7.2.2.4颖果
SN/T1154—2015
颖果长4mm~6mm，宽1.8mm~2.5mm，厚1.5mm~2.5mm；黄褐色灰褐色；椭圆形，背面圆形，腹面弓隆，腹沟宽而浅，先端无毛：胚部卵圆形或近圆形；种脐微小，凹陷；毒麦4粒重为10g～13g（参见图C.2）。
7.2.3毒麦变种长芒毒麦和田毒麦形态特征（参见图C.3、图C.4、图C.5）7.2.3.1 长芒毒麦(Lolium temulentum var.longiaristum Parnell)长芒毒麦为毒麦的变种，果与颖果的颜色、形状与原种极相似，但本种每小穗通常含6花～11花，带颖果长7mm~7.5mm，宽2.1mm，厚2mm，内外先端较钝，外的芒长达1cm以上。颖果长约5.5mm，宽约2mm，厚约1.5mm，千粒重为9g~10g。7.2.3.2田毒麦（Loliumtemulentumvar.arvenseBab.）田毒麦为毒麦的变种，果与颖果的颜色、形状与原种极相似，但本种每小穗通常含7花～8花，带颖果长5mm7mm，宽2mm~2.2mm，厚约1.8mm，本种外无芒，或仅具纤细而虚弱的短芒，芒长约2.5mm。颖果长约6mm，宽约2.2mm，厚约1.6mm，淡黄色至淡黄褐色，干粒重为10g~11g。8PCR检测
8.1DNA提取
对可疑小花（带颖果）、颖果等种子或可能混杂有毒麦成分的植物原粮及饲料粮等加工产品的样品进行DNA提取。毒麦成分DNA提取具体步骤参见D.1。8.2PCR检测检测步骤
8.2.1PCR引物及探针
毒麦及其变种长芒毒麦、田毒麦和近似种亚麻毒麦、多花黑麦草和瑞士黑麦草等分子检测设计的引物及探针参见D.2.1。
8.2.2PCR扩增反应体系
PCR扩增反应体系参见D.2.2。
8.2.3PCR反应程序和步骤
PCR反应程序和步骤参见D.2.3。8.3PCR检测结果
SNP位点的检测设计了VIC，FAM探针，检测结果中VIC探针出现的唯一扩增信号时，就是该种的扩增信号，即可判断为阳性。如附录E.1：毒麦在VIC探针出现扩增信号时，即可评定为毒麦，可判断为阳性：FAM探针荧光信号则是长芒毒麦、田毒麦，亚麻毒麦、多花黑麦草、瑞士黑麦草等其他种类的扩增信号，不作为评定标准。毒麦PCR检测结果VIC荧光信号结果参见图E.1；长芒毒麦PCR检测结果VIC荧光信号结果参见图E.2；田毒麦PCR检测结果VIC荧光信号结果参见图E.3：毒麦长芒毒麦、田毒麦、亚麻毒麦、多花黑麦草和瑞士黑麦草的Ct值结果参见表E.1。5
SN/T1154—2015
结果判定
9.1形态鉴定结果判定
以形态特征为依据，符合7.2描述的形态特征，可鉴定为毒麦（LoliumtemulentumL.）。PCR检测结果判定
以PCR检测结果为判定依据，符合8.2描述的PCR检测结果，可鉴定为毒麦（LoliumtemulentumL.)或样品中含有毒麦成分。10
标本和样品保存与处理
10.1保存方法
10.1.1DNA样品
检测获得的DNA样品由经手人标识确认后保存于一80℃～一20℃冰箱中，以备复核用。10.1.2样品保存
保存样品按编号、中文名称、产地、货物名称、进出境日期分别存放，并由经手人标识确认和样品管理员登记后，妥善保存。
10.2保存时间
含有毒麦及其成分的样品，妥善保存至少6个月。1.外有极明显的芒
附录A
（资料性附录）
毒麦及其近似种分种检索表
2.颗果粗短而膨胀，整个果体不等厚，侧面观背面较平直，腹面明显弓形、隆起….2.颖果瘦长而不膨胀，显著扁平，整个果体约等厚，侧面观腹面不呈弓形、不隆起SN/T1154—2015wwW.bzxz.Net
3.小穗含4花～6花，常5花，芒长约10mm，内、外顶端较尖，千粒重为10g~13g毒麦（LoliumtemulentumL)
3.小穗含6花～9花，有时可达11花，常9花，芒长10mm以上，内、外顶端较钝，千粒重为9g~10g**
长芒毒麦（L.temulentumvar.longiaristatum）4.小花（带颖果）长4mm~6mm，宽1.25mm~1.5mm，厚约0.5mm，芒长约5mm或近10mm，千粒重为1.8g~2.5g*..
..多花黑麦草（L.multiflorumLam.）4.小花（带颖果）长5mm~10mm，宽1.5mm~2.0mm，厚约1mm，芒长达7mm以上，千粒重为6g~8g
1.外通常无芒，或偶有短芒，或具极微弱的细芒波斯黑麦草（L.persicumBoiss&Hoben.）5.颖果瘦长，背腹显著扁平划船形中凹，整个果体近等厚5.颖果粗短面膨胀，背腹略扁，整个果体不等厚，侧面观背面平直，腹面显著呈弓形隆起…·6.颖果背腹显著扁平，整个果体近等厚，外程先端具短尖或钝圆，小穗含6花10花，千粒重为2g~2.2g
黑麦草（L.peremneL.)
6.颖果船形中凹，具1细弱芒，长约为颖果的一半。外坚实，革质，微呈5棱，小穗含4花～8花，千粒重为1.7g~2g*
瑞士黑麦草（L.rigidumGaud.）7.小花（带颖果）长5mm~8mm，宽2.5mm~3.0mm，厚约2.5mm，通常无芒或有微弱的短芒，每小穗含7花～8花，千粒重为10g11g...田毒麦（L.temulentumvar.arvenseBab.）7.小花（带颖果）长3mm~5mm，宽1.1mm~2.0mm，厚1mm~1.5mm，通常无芒或具长不超过5.5mm的细芒，千粒重为3g~4g细穗毒麦（L.remotumSchrank.)SN/T1154—2015
B.1检测试剂
附录B
（资料性附录）
毒麦PCR检测试剂及药品制备
液氮，蛋白酶K，Rnase，Tris饱和酚，三氯甲烷/异戊醇（24：1），异丙醇，无水乙醇，KAC，NaCl，TritonX-1oo,Tris碱.CTAB,2XTaqManUniversalPCRMasterMix,ddH2O.β-巯基Z醇，浓HCl,二水乙二胺四乙酸二钠，NaOH。
B.2药品的制备
B.2.11mol/LTris-HCI缓冲液
在800mL水中溶解121.1gTris碱，加人浓HCl调节pH至所需值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。
B.2.20.5mol/LEDTA(pH8.0）
在800mL水中加人186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H2O），剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌。B.2.3CTAB提取缓冲液
20g/LCTAB,1.4mol/LNaCl,o.1mol/LTris-HCl,20mmol/LEDTA(pH8.0）B.2.4SDS提取缓冲液
500mmol/LNaCl.50mmol/LTris-Cl(pH8.0),50mmol/LEDTA,1.5%SDS.1%β-巯基Z醇B.2.5TES
100mmolTris(pH8.0),10mmolEDTA,2%SDSB.2.6TE缓冲液（pH8.0）
10mmol/LTris-HCl(pH8.0),1mmol/LEDTA(pH8.0)8
说明：
植株：
一小穗；
叶鞘。
附录C
（资料性附录）
毒麦及其变种的植株、小穗和小花特征图b）小穗
图C.1毒麦（LoliumtemulentumL.）植株，小穗特征图SN/T1154—2015
SN/T1154—2015
说明：
1小穗
小花腹面：
小花背面：
4小花侧面：
颗果、胚；
颗果横切面。
图C.2毒麦（LoliumtemulentumL.）小穗和小花特征图
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