SN/T 3507-2013
基本信息
标准号： SN/T 3507-2013
中文名称：进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 进出口 纺织品 山羊绒 鉴别 PCR 实时 荧光
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3507-2013.
1范围
SN/T 3507规定了纺织品中山羊绒.绵羊毛鉴别的PCR和实时荧光PCR方法。
SN/T 3507适用于纺织品中山羊绒.绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别.
2规范性引用文件.
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注8期的版本适用于本文件.凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产 品检测实验室技 术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1聚合酶链式反应polymerase chatl n readt hom;PCR
一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下.以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以4种单核苷酸(dNTP)为底物,通过变性一退火- 延伸的循环反应,使极少量的DNA的特定片段.在短短几小时内扩增上百万倍.
3.2实时荧光PCR realtime fuorecence PCR
在PCR反应体系中加人荧光基团.利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法.
4缩略语
下列缩略讲适用于本文件.
bp:碱基对(base pair)
Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数( eycle threshold)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxy ribonuleic acid)
DTT:二硫疏糖醇.
dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy ribonucleoside triplhosphate)
5原理
用试剂盒法提取样品DNA.针对山羊.绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针,通过单一PCR.实时荧光PCR技术.对DNA中的山羊成分.绵羊成分分别进行特异性扩增.根据实验结果,判定该样品中是否含有山羊绒.绵羊毛。
1范围
SN/T 3507规定了纺织品中山羊绒.绵羊毛鉴别的PCR和实时荧光PCR方法。
SN/T 3507适用于纺织品中山羊绒.绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别.
2规范性引用文件.
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注8期的版本适用于本文件.凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产 品检测实验室技 术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件.
3.1聚合酶链式反应polymerase chatl n readt hom;PCR
一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下.以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,以4种单核苷酸(dNTP)为底物,通过变性一退火- 延伸的循环反应,使极少量的DNA的特定片段.在短短几小时内扩增上百万倍.
3.2实时荧光PCR realtime fuorecence PCR
在PCR反应体系中加人荧光基团.利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法.
4缩略语
下列缩略讲适用于本文件.
bp:碱基对(base pair)
Ct值:每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数( eycle threshold)
DNA:脱氧核糖核酸(deoxy ribonuleic acid)
DTT:二硫疏糖醇.
dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxy ribonucleoside triplhosphate)
5原理
用试剂盒法提取样品DNA.针对山羊.绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针,通过单一PCR.实时荧光PCR技术.对DNA中的山羊成分.绵羊成分分别进行特异性扩增.根据实验结果,判定该样品中是否含有山羊绒.绵羊毛。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3507—2013
进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法
Identification of cashmere and wool in textiles for import and export-PCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethod2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3507—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：邵碧英、林志武、陈文炳、缪婷玉、彭娟、柯家骥。1范围
进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法
本标准规定了纺织品中山羊绒、绵羊毛鉴别的PCR和实时荧光PCR方法。本标准适用于纺织品中山羊绒、绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别。规范性引用文件
SN/T3507—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
polymerasechainreaction;PCR
聚合酶链式反应
一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性一退火一延伸的循环反应·使极少量的DNA的特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。3.2
实时荧光PCR
real-timefluorescencePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacidDTT：二硫疏糖醇
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）5原理
用试剂盒法提取样品DNA。针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针，通过单一PCR实时荧光PCR技术，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判定该样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。SN/T3507—2013
6试剂
6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。6.2组织和毛发提取试剂盒（与DNAIQTM系统结合使用）：参见附录A中A.1。)6.32XTaqPCRMasterMix:0.1U/μLTaqDNA聚合酶.500μmol/LdNTP.20mmol/LTris-HCl(pH8.3）100mmol/LKCl,3mmol/LMgCl2，其他稳定剂和增强剂，-20℃保存。6.4Premir Er TaqTM(Perfect Real Time)(2X):见 A.2。6.595%或100%乙醇。
6.6琼脂糖。
6.7溴化乙锭。
6.8DNA marker。
6.9TE溶液(pH8.0)。
5XTBE缓冲液。
仪器与设备
7.1冰箱：4℃~-20℃。
7.2天平：感量0.001g。
7.3分析研磨机。
7.4剪刀。
微孔干浴器或水浴锅。
瞬时离心机。
7.7涡旋仪。
1.5mL磁分离架。
微量可调移液器及枪头：10uL、20μL、100uL、200μL、1000μL。1.5mL离心管。
PCR薄壁管。
实时荧光PCR光学反应管。
超净工作台。
PCR仪。
实时荧光定量PCR仪。
电泳装置。
凝胶成像仪。
8取样
纱线：从不同的管纱、简纱或绞纱上随机取样，共取约1g的纱样。织物：从不同位置剪取，共取约1g的织物。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
9制样
SN/T3507—2013
用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散、混匀，再用剪刀尽量剪碎至纤维长度2mm～3mm，再次用分析研磨机混匀。
10DNA的提取
10.1称取约5mg试样，放人1.5mL离心管中，每个样平行提取2管，加100μLDTT（1mol/L）和75uL蛋白酶K储存液.混匀，56℃温浴过夜10.2加350L裂解液，上下颠倒混匀，瞬时离心，将上清液移至新的1.5mL离心管中。10.3加7uL完全悬浮的DNAIQTM树脂，高速涡旋振荡3s，室温放置10min。10.4将离心管高速涡旋振荡2S，将离心管置于磁分离架上。10.5待磁珠完全吸附至管壁后，小心吸去溶液，加人100L裂解缓冲液，高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上。
10.6吸去裂解液，加入100uL1×洗涤液，高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上，加100uL洗液重复洗涤3次，尽可能吸尽最后一次的洗涤液10.7打开盖子，风干5min。
10.8加人70uL洗脱液.高速涡旋振荡2s.65℃温浴5min。10.9取出离心管，高速涡旋振荡2s，置于磁分离架上，小心吸取溶液（即DNA溶液）于新的1.5mL离心管中，一20℃保存备用。
11DNA的鉴别
11.1质量控制
进行PCR、实时荧光PCR鉴别时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：扩增山羊成分时用山羊绒DNA，扩增绵羊成分时用绵羊毛DNA。阴性对照：扩增山羊成分时用非山羊绒DNA，扩增绵羊成分时用非绵羊毛DNA。空白对照：实验用水。11.2PCR法
11.2.1引物
所用引物信息见表1，用TE溶液（pH8.0）稀释至10umol/L，一20℃保存备用表1PCR扩增所用引物
扩增成分
内参基因
引物名称
12SG-F
12SG-R
引物序列
5*-GCG/ATACGCAATCTTACGATCAA-35′-CTGG/TCCTCCAATTCATGTGAG-35-CGCCCTCCAAATCAATAA-3
5'-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3
退火温度
产物大小
SN/T3507—2013
扩增成分
引物名称
12SS-F
12SS-R
11.2.2PCR反应体系
表1（续）
引物序列
5-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-3
5'-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3'
退火温度
产物大小
2XTaqPCRMasterMix12.5μL.10umol/L引物各0.5μL,DNA模板5μL.ddH,O6.5μL11.2.3PCR反应条件
94℃.5min；94℃30s，退火温度（表1）.30s，72℃，30s，40个循环；72℃，5min。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整11.2.4PCR产物的检测
将适量5XTBE稀释成0.5XTBE溶液，配制2.0%琼脂糖凝胶。取15uLPCR产物，点样进行电泳，并加DNAmarker点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液（10μg/μL)中浸泡30min。用凝胶成像系统观察、拍照、记录与分析电泳结果。11.2.5PCR结果及判断
阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品未出现预期大小的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一步确证。
11.2.6结果确证实验
可疑阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与附录B中的相应序列进行比对，同源率达100%，可确证为阳性结果，或采用实时荧光PCR法进行确证。11.3实时荧光PCR法
引物及探针
所用的引物、探针见表2，用TE溶液（pH8.0）稀释至10umol/L，一20℃保存备用表2实时荧光PCR所用引物、探针扩增成分
内参基因
引物名称
引物序列
5'-AAAGGACTTGGCGGTGCTT-3'
5'-GGGTTTGCTGAAGATGGCG-3*
5'-FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCG-TAMARA-3'
退火温度
产物大小
扩增成分
引物名称
12SG-F
12SG-Rwww.bzxz.net
12SG-P
12SS-F
12SS-R
12SS-P
表2（续）
引物序列
5-CGCCCTCCAAATCAATAA-3
5*-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3
5'-FAM-ACGTGTTAAAGCACTACATC-TAMARA-35'-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-35′-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3
5*-FAM-AAACCAAGATATAGCTTAATT-TAMARA-3\11.3.2PCR反应体系
SN/T3507—2013
退火温度
产物大小
PremiaExTaqTM(PerfectRealTime)（2X)12.5μL,10μmol/L引物探针各0.75μL,ROXReferenceDyeI（50X)0.5μL.DNA模板5μLddH2O4.75μL。注：ROXReferenceDyeI（50X）适用于ABI7500、7500Fast实时荧光PCR系统，其他型号的荧光PCR仪请参照说明书操作。
11.3.3PCR反应条件
95℃，30s；95℃，5s，退火温度（表2），35s，40个循环。注：不同仪器可根据仪器要求和PremixErTaqTM(PerfectRealTime)使用说明书将反应参数作适当调整。11.3.4结果分析
反应结束后，应设置无效基线范围。基线范围选择在3～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值一40为准。设置阈值后，分析样品的检测结果。11.3.5结果判断
待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值大于或等于40.内参照基因检测Ct值在20～30之间者阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值小于或等于36，内参照基因检测Ct值在20～30之间者，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分：再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。
SN/T3507—2013
结果表述
未检出山羊绒、绵羊毛
检出山羊绒、绵羊毛
防止污染的措施
检测过程中防止交叉污染的措施参照GB/T19495.2。附录A
（资料性附录）
试剂盒及试剂
SN/T3507—2013
A.1组织和毛发提取试剂盒（与DNAIQTM系统结合使用）（推荐使用Promega公司产品）A.1.1组成（100次）
温育缓冲液（incubationbuffer）蛋白酶K（proteinaseK）
二硫疏糖醇（DTT）
2X洗涤缓冲液（washbuffer）
裂解缓冲液（lysisbuffer）
洗脱液（elutionbuffer）
树脂（resin）
A.1.2试剂配制
A.1.2.1蛋白酶K储存液
向冻干的蛋白酶K瓶中加人5.5mL温育缓冲液，轻摇使之完全溶解。此蛋白酶K储存液的终浓度为18mg/mL。将蛋白酶K储存液分装成小包装，可在一20℃保存至1年，反复冻融不要超过5次。使用前将蛋白酶K放置在冰上融化及保存。A.1.2.21mol/LDTT
将5gDTT溶于无核酸酶的水中至终体积为32.4mL则DTT的终浓度为1mol/L，分装成小包装使用并保存在一20℃。
A.1.2.31×洗涤缓冲液
向2×洗涤缓冲液中加入15mL95%～100%的乙醇和15mL异丙醇，混匀，室温保存。A.1.2.4裂解液
确定所需的裂解液的总量，每100μL裂解缓冲液中加入1uL1mol/LDTT，颠倒几次混匀，室温保存一个月。
A.2PremixExTaqM（PerfectRealTime)(2×）试剂盒组成PremiaETaqTM(PerfectRealTime)(2X）1.0mLX5支ROXReferenceDye(50X)
200μLX1支
SN/T3507—2013
ROXReferenceDyeII（5oX)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
200μLX1支
在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H，O），剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌。A.4
5×TBE缓冲液
Tris碱
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
蒸馏水定容至
B.1绵羊序列
附录B
（资料性附录）
绵羊、山羊序列
SN/T3507—2013
ATATCAACCACACGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATACTGGAAAGTGTGCTTGGATAAACCAAGATATAGCTTAATTAAAGCATCTAGTTTACACCTAGAAGATTTCACACATTATGAGTATCTTGAACTATACCTAGCCCAAAATCTCCCACTCTCCAGTTTAAAB.2山羊序列
CGCCCTCCAAATCAATAAGACT/CAAGAGGAGCAOG/TTA/GTCAAGCACACATCTT/CGTAGCTTAC/TAACGCCTC/TGCTTAACCACACCCCTACGGGAGACAGCAGTGACAAAAATTAAGCCATAAACGAAAGTTTGACTAAGCCATGTTGACCAGG/AGTTGGTAAATCTCGTGCCAGCCACCGCGGTCATACGATTAACCCAAGCTAACAGGAATACGGCGTAAAACGTGTTAAAGCACTACATCAAATAGAGTTAAATTCTAATTAAACTGTAAAAAGCCATAATTACAACAAAAATAGATGACGAAAGTAACCCTACTGCAGCTGATACACTATAG9
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进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法
Identification of cashmere and wool in textiles for import and export-PCRmethodandreal-timefluorescencePCRmethod2013-03-01发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-09-16实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T3507—2013
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。本标准起草单位：中华人民共和国福建出人境检验检疫局。本标准主要起草人：邵碧英、林志武、陈文炳、缪婷玉、彭娟、柯家骥。1范围
进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别PCR法和实时荧光PCR法
本标准规定了纺织品中山羊绒、绵羊毛鉴别的PCR和实时荧光PCR方法。本标准适用于纺织品中山羊绒、绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别。规范性引用文件
SN/T3507—2013
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
polymerasechainreaction;PCR
聚合酶链式反应
一种模拟天然DNA复制的体外扩增法，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过变性一退火一延伸的循环反应·使极少量的DNA的特定片段，在短短几小时内扩增上百万倍。3.2
实时荧光PCR
real-timefluorescencePCR
在PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
bp：碱基对（basepair）
Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数（cyclethreshold）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacidDTT：二硫疏糖醇
dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）5原理
用试剂盒法提取样品DNA。针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针，通过单一PCR实时荧光PCR技术，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增，根据实验结果，判定该样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。SN/T3507—2013
6试剂
6.1实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。6.2组织和毛发提取试剂盒（与DNAIQTM系统结合使用）：参见附录A中A.1。)6.32XTaqPCRMasterMix:0.1U/μLTaqDNA聚合酶.500μmol/LdNTP.20mmol/LTris-HCl(pH8.3）100mmol/LKCl,3mmol/LMgCl2，其他稳定剂和增强剂，-20℃保存。6.4Premir Er TaqTM(Perfect Real Time)(2X):见 A.2。6.595%或100%乙醇。
6.6琼脂糖。
6.7溴化乙锭。
6.8DNA marker。
6.9TE溶液(pH8.0)。
5XTBE缓冲液。
仪器与设备
7.1冰箱：4℃~-20℃。
7.2天平：感量0.001g。
7.3分析研磨机。
7.4剪刀。
微孔干浴器或水浴锅。
瞬时离心机。
7.7涡旋仪。
1.5mL磁分离架。
微量可调移液器及枪头：10uL、20μL、100uL、200μL、1000μL。1.5mL离心管。
PCR薄壁管。
实时荧光PCR光学反应管。
超净工作台。
PCR仪。
实时荧光定量PCR仪。
电泳装置。
凝胶成像仪。
8取样
纱线：从不同的管纱、简纱或绞纱上随机取样，共取约1g的纱样。织物：从不同位置剪取，共取约1g的织物。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
9制样
SN/T3507—2013
用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散、混匀，再用剪刀尽量剪碎至纤维长度2mm～3mm，再次用分析研磨机混匀。
10DNA的提取
10.1称取约5mg试样，放人1.5mL离心管中，每个样平行提取2管，加100μLDTT（1mol/L）和75uL蛋白酶K储存液.混匀，56℃温浴过夜10.2加350L裂解液，上下颠倒混匀，瞬时离心，将上清液移至新的1.5mL离心管中。10.3加7uL完全悬浮的DNAIQTM树脂，高速涡旋振荡3s，室温放置10min。10.4将离心管高速涡旋振荡2S，将离心管置于磁分离架上。10.5待磁珠完全吸附至管壁后，小心吸去溶液，加人100L裂解缓冲液，高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上。
10.6吸去裂解液，加入100uL1×洗涤液，高速涡旋振荡2s，将离心管置于磁分离架上，加100uL洗液重复洗涤3次，尽可能吸尽最后一次的洗涤液10.7打开盖子，风干5min。
10.8加人70uL洗脱液.高速涡旋振荡2s.65℃温浴5min。10.9取出离心管，高速涡旋振荡2s，置于磁分离架上，小心吸取溶液（即DNA溶液）于新的1.5mL离心管中，一20℃保存备用。
11DNA的鉴别
11.1质量控制
进行PCR、实时荧光PCR鉴别时设置阳性对照、阴性对照和空白对照。阳性对照：扩增山羊成分时用山羊绒DNA，扩增绵羊成分时用绵羊毛DNA。阴性对照：扩增山羊成分时用非山羊绒DNA，扩增绵羊成分时用非绵羊毛DNA。空白对照：实验用水。11.2PCR法
11.2.1引物
所用引物信息见表1，用TE溶液（pH8.0）稀释至10umol/L，一20℃保存备用表1PCR扩增所用引物
扩增成分
内参基因
引物名称
12SG-F
12SG-R
引物序列
5*-GCG/ATACGCAATCTTACGATCAA-35′-CTGG/TCCTCCAATTCATGTGAG-35-CGCCCTCCAAATCAATAA-3
5'-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3
退火温度
产物大小
SN/T3507—2013
扩增成分
引物名称
12SS-F
12SS-R
11.2.2PCR反应体系
表1（续）
引物序列
5-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-3
5'-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3'
退火温度
产物大小
2XTaqPCRMasterMix12.5μL.10umol/L引物各0.5μL,DNA模板5μL.ddH,O6.5μL11.2.3PCR反应条件
94℃.5min；94℃30s，退火温度（表1）.30s，72℃，30s，40个循环；72℃，5min。注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整11.2.4PCR产物的检测
将适量5XTBE稀释成0.5XTBE溶液，配制2.0%琼脂糖凝胶。取15uLPCR产物，点样进行电泳，并加DNAmarker点样以判断PCR产物的片段大小。电压大小根据电泳槽长度来确定，一般控制在3V/cm～5V/cm长度，电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定。电泳结束后，将凝胶置溴化乙锭溶液（10μg/μL)中浸泡30min。用凝胶成像系统观察、拍照、记录与分析电泳结果。11.2.5PCR结果及判断
阳性对照出现预期大小的扩增条带，阴性对照和空白对照均未出现条带；待测样品未出现预期大小的扩增条带，判断结果为阴性。待测样品出现预期大小的扩增条带，判断结果为可疑阳性，需进一步确证。
11.2.6结果确证实验
可疑阳性结果的，可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序，所获得的序列与附录B中的相应序列进行比对，同源率达100%，可确证为阳性结果，或采用实时荧光PCR法进行确证。11.3实时荧光PCR法
引物及探针
所用的引物、探针见表2，用TE溶液（pH8.0）稀释至10umol/L，一20℃保存备用表2实时荧光PCR所用引物、探针扩增成分
内参基因
引物名称
引物序列
5'-AAAGGACTTGGCGGTGCTT-3'
5'-GGGTTTGCTGAAGATGGCG-3*
5'-FAM-TAGAGGAGCCTGTTCTATAATCGATAAACCCCG-TAMARA-3'
退火温度
产物大小
扩增成分
引物名称
12SG-F
12SG-Rwww.bzxz.net
12SG-P
12SS-F
12SS-R
12SS-P
表2（续）
引物序列
5-CGCCCTCCAAATCAATAA-3
5*-CTATAGTGTATCAGCTGCA-3
5'-FAM-ACGTGTTAAAGCACTACATC-TAMARA-35'-ATATCAACCACACGAGAGGAGAC-35′-TTTAAACTGGAGAGTGGGAGA-3
5*-FAM-AAACCAAGATATAGCTTAATT-TAMARA-3\11.3.2PCR反应体系
SN/T3507—2013
退火温度
产物大小
PremiaExTaqTM(PerfectRealTime)（2X)12.5μL,10μmol/L引物探针各0.75μL,ROXReferenceDyeI（50X)0.5μL.DNA模板5μLddH2O4.75μL。注：ROXReferenceDyeI（50X）适用于ABI7500、7500Fast实时荧光PCR系统，其他型号的荧光PCR仪请参照说明书操作。
11.3.3PCR反应条件
95℃，30s；95℃，5s，退火温度（表2），35s，40个循环。注：不同仪器可根据仪器要求和PremixErTaqTM(PerfectRealTime)使用说明书将反应参数作适当调整。11.3.4结果分析
反应结束后，应设置无效基线范围。基线范围选择在3～15个循环，如果有强阳性样本，应根据实际情况调整基线范围。阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，且Ct值一40为准。设置阈值后，分析样品的检测结果。11.3.5结果判断
待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值大于或等于40.内参照基因检测Ct值在20～30之间者阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值小于或等于36，内参照基因检测Ct值在20～30之间者，阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常者，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分。待测样品山羊成分、绵羊成分检测Ct值在36～40之间，应重做实时荧光PCR扩增。再次扩增后的结果Ct值仍小于40者，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，则可判定该样品检出山羊成分、绵羊成分：再次扩增后结果Ct值大于40，且阴性对照、阳性对照和空白对照结果正常，可判定该样品未检出山羊成分、绵羊成分。
SN/T3507—2013
结果表述
未检出山羊绒、绵羊毛
检出山羊绒、绵羊毛
防止污染的措施
检测过程中防止交叉污染的措施参照GB/T19495.2。附录A
（资料性附录）
试剂盒及试剂
SN/T3507—2013
A.1组织和毛发提取试剂盒（与DNAIQTM系统结合使用）（推荐使用Promega公司产品）A.1.1组成（100次）
温育缓冲液（incubationbuffer）蛋白酶K（proteinaseK）
二硫疏糖醇（DTT）
2X洗涤缓冲液（washbuffer）
裂解缓冲液（lysisbuffer）
洗脱液（elutionbuffer）
树脂（resin）
A.1.2试剂配制
A.1.2.1蛋白酶K储存液
向冻干的蛋白酶K瓶中加人5.5mL温育缓冲液，轻摇使之完全溶解。此蛋白酶K储存液的终浓度为18mg/mL。将蛋白酶K储存液分装成小包装，可在一20℃保存至1年，反复冻融不要超过5次。使用前将蛋白酶K放置在冰上融化及保存。A.1.2.21mol/LDTT
将5gDTT溶于无核酸酶的水中至终体积为32.4mL则DTT的终浓度为1mol/L，分装成小包装使用并保存在一20℃。
A.1.2.31×洗涤缓冲液
向2×洗涤缓冲液中加入15mL95%～100%的乙醇和15mL异丙醇，混匀，室温保存。A.1.2.4裂解液
确定所需的裂解液的总量，每100μL裂解缓冲液中加入1uL1mol/LDTT，颠倒几次混匀，室温保存一个月。
A.2PremixExTaqM（PerfectRealTime)(2×）试剂盒组成PremiaETaqTM(PerfectRealTime)(2X）1.0mLX5支ROXReferenceDye(50X)
200μLX1支
SN/T3507—2013
ROXReferenceDyeII（5oX)
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
200μLX1支
在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na·2H，O），剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0，然后定容至1L，分装后高压灭菌。A.4
5×TBE缓冲液
Tris碱
0.5mol/LEDTA(pH8.0)
蒸馏水定容至
B.1绵羊序列
附录B
（资料性附录）
绵羊、山羊序列
SN/T3507—2013
ATATCAACCACACGAGAGGAGACAAGTCGTAACAAGGTAAGCATACTGGAAAGTGTGCTTGGATAAACCAAGATATAGCTTAATTAAAGCATCTAGTTTACACCTAGAAGATTTCACACATTATGAGTATCTTGAACTATACCTAGCCCAAAATCTCCCACTCTCCAGTTTAAAB.2山羊序列
CGCCCTCCAAATCAATAAGACT/CAAGAGGAGCAOG/TTA/GTCAAGCACACATCTT/CGTAGCTTAC/TAACGCCTC/TGCTTAACCACACCCCTACGGGAGACAGCAGTGACAAAAATTAAGCCATAAACGAAAGTTTGACTAAGCCATGTTGACCAGG/AGTTGGTAAATCTCGTGCCAGCCACCGCGGTCATACGATTAACCCAAGCTAACAGGAATACGGCGTAAAACGTGTTAAAGCACTACATCAAATAGAGTTAAATTCTAATTAAACTGTAAAAAGCCATAATTACAACAAAAATAGATGACGAAAGTAACCCTACTGCAGCTGATACACTATAG9
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