中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3507—2013 进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 PCR法和实时荧光PCR法 Identification of cashmere and wool in textiles for import and export — PCR method and real-time fluorescence PCR method 2013-03-01发布 2013-09-16实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：邵碧英、林志武、陈文炳、缪婷玉、彭娟、柯家骥。 1 范围 本标准规定了纺织品中山羊绒、绵羊毛鉴别的PCR法和实时荧光PCR法。 本标准适用于纺织品中山羊绒、绵羊毛PCR法和实时荧光PCR法的定性鉴别。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T19495.2 转基因产品检测实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction；PCR） 一种模拟天然DNA复制的体外扩增法。在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以4种单核苷酸（dNTP）为底物，通过“变性—退火—延伸”的循环反应，使极少量DNA的特定片段在短短几小时内扩增上百万倍。 3.2 实时荧光PCR（real-time fluorescence PCR） 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量或定性分析的方法。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp：碱基对（base pair） Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） DTT：二硫苏糖醇 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） 5 原理 用试剂盒法提取样品DNA。针对山羊、绵羊的线粒体DNA序列设计引物和探针，通过单一PCR和实时荧光PCR技术，对DNA中的山羊成分、绵羊成分分别进行特异性扩增，根据实验结果判定该样品中是否含有山羊绒、绵羊毛。 6 试剂 6.1 实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。 6.2 组织和毛发提取试剂盒（与DNA IQTM系统结合使用）：参见附录A中A.1。 注：给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同效果，则可使用这些等效产品。 6.3 2×Taq PCR Master Mix 含0.1 U/μL Taq DNA聚合酶、500 μmol/L dNTP、20 mmol/L Tris-HCl（pH8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2及其他稳定剂和增强剂，-20 ℃保存。 6.4 Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）（2×） 见附录A.2。 6.5 95%或100%乙醇。 6.6 琼脂糖。 6.7 溴化乙锭。 6.8 DNA Marker。 6.9 TE溶液（pH8.0）。 6.10 5×TBE缓冲液。 7 仪器与设备 7.1 冰箱：4 ℃～-20 ℃。 7.2 天平：感量0.001 g。 7.3 分析研磨机。 7.4 剪刀。 7.5 微孔干浴器或水浴锅。 7.6 瞬时离心机。 7.7 涡旋仪。 7.8 1.5 mL磁分离架。 7.9 微量可调移液器及枪头：10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL。 7.10 1.5 mL离心管。 7.11 PCR薄壁管。 7.12 实时荧光PCR光学反应管。 7.13 超净工作台。 7.14 PCR仪。 7.15 实时荧光定量PCR仪。 7.16 电泳装置。 7.17 凝胶成像仪。 8 取样 纱线：从不同的管纱、筒纱或绞纱上随机取样，共取约1 g纱样。 织物：从不同位置剪取，共取约1 g织物。 9 制样 用剪刀将样品剪碎，经分析研磨机打散、混匀。