SN/T 1135.13-2015
基本信息
标准号： SN/T 1135.13-2015
中文名称：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1135.13-2015.Detection and identification of Potato virus Y.
1范围
SN/T 1135.13规定了马铃薯Y病毒(PotatovirusY)的检疫鉴定方法。
SN/T 1135.13适用于可能带有马铃薯Y病毒的马铃薯植株、繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB7331马铃薯种薯产地检疫规程
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯Y病毒基本信息
学名:Potato virus Y
缩写:PVY
异名: Potato severe mosaic virus, Potato acropetal necrosis virus, Solanum virus 2, Tobacco vein-banding virus ，Potato leafdrop streak virus,Tobacco veinal necrosis virus ,Potato virus 20。
分类地位:马铃薯Y病毒科( Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。
传播途径:马铃薯种薯传毒，机械接种可传毒,多种蚜虫以非持久性方式传播该病毒。远距离传播通过种薯贸易完成。
马铃薯Y病毒的其他信息参见附录A。
1范围
SN/T 1135.13规定了马铃薯Y病毒(PotatovirusY)的检疫鉴定方法。
SN/T 1135.13适用于可能带有马铃薯Y病毒的马铃薯植株、繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB7331马铃薯种薯产地检疫规程
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯Y病毒基本信息
学名:Potato virus Y
缩写:PVY
异名: Potato severe mosaic virus, Potato acropetal necrosis virus, Solanum virus 2, Tobacco vein-banding virus ，Potato leafdrop streak virus,Tobacco veinal necrosis virus ,Potato virus 20。
分类地位:马铃薯Y病毒科( Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)。
传播途径:马铃薯种薯传毒，机械接种可传毒,多种蚜虫以非持久性方式传播该病毒。远距离传播通过种薯贸易完成。
马铃薯Y病毒的其他信息参见附录A。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 1135.132015
马铃薯Y病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Potato virus Y2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
SN/T1135共分为13部分：
第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯带顶病毒检疫鉴定方法；第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法：第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯腐病菌检疫鉴定方法：第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法：第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法：第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法；第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法；第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第13部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1135.13—2015下载标准就来标准下载网
本部分起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本部分主要起草人：刘洪义、刘忠梅、张永江、李桂芬、王宏毅、魏梅生、周志强、张洪祥、杨立群。1范围
马铃薯Y病毒检疫鉴定方法
SN/T1135.13—2015
SN/T1135的本部分规定了马铃薯Y病毒（PotatouirusY)的检疫鉴定方法。本部分适用于可能带有马铃薯Y病毒的马铃薯植株繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB7331马铃薯种薯产地检疫规程SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯Y病毒基本信息
学名：Potato virusY
缩写：PVY
异名:Potato severemosaic virus,Potato acropetal necrosis virus,Solanum virus 2,Tobacco vein-banding virus,Potato leafdrop streak virus,Tobacco veinal necrosis virus,Potato virus 20。分类地位，马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyuirus）。传播途径：马铃薯种薯传毒，机械接种可传毒，多种蚜虫以非持久性方式传播该病毒。远距离传播通过种薯贸易完成，
马铃薯Y病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
PVY的基因组特征、免疫原性和在寄主植物上的症状特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVY及主要株系的基因组特征建立RT-PCR、实时荧光RT-PCR（Real-timePCR）检测方法：依据PVY及主要株系的免疫原性建立酶联免疫吸附（ELISA）方法、胶体金免疫试纸条方法和免疫电镜方法：依据PVY及主要株系在不同寄主植物上的症状特征建立鉴别寄主诊断法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有PVY及主要株系。
5仪器设备、用具及试剂
5.1仪器设备
酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、电子天平、涡旋振荡器、组织捣碎机、恒温培养箱等。5.2用具
可调移液器（0.1μ~2.5，2μL~20μL，10μL~100μL，20μ~200μL，100μL1000μL）和SN/T1135.13—2015
可调移液器头、离心管、研钵、微型磨杆。5.3试剂
双抗体夹心酶联免疫吸附测定所需试剂见附录B，免疫层析试纸条检测所需试剂见附录CRTPCR检测所需试剂见附录D.实时荧光RT-PCR检测所需试剂见附录E。6样品的抽取及制备
6.1抽样
马铃薯贸易商品或科研用薯材料或国际间种质交流材料等现场抽样按照SN/T2122的规定执行，田间调查采样按照GB7331的规定执行6.2脱毒苗、微型薯、块茎等样品的制备将脱毒苗、微型薯、块茎播于非土介质或火菌土中，于25左右生长并进行症状观察：待长出3片1片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。6.3茄科等寄主植物种子样品的制备将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播丁灭菌王中：于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组7实验室鉴定
7.1酶联免疫吸附测定
见附录B。如选用合格的试剂盒，按试剂盒说明操作7.2
2胶体金免疫层析试纸条检测
见附录C。如选用不同生产商的合格产品，按其操作说明操作7.3RT-PCR检测
见附录D。
7.4实时荧光RT-PCR检测
见附录E。
5免疫电镜检测
按照SN/T1840的规定执行。
6鉴别寄主检测
见附录F。
8结果判定
0株为1组)并编号，
8.1无可疑症状的样品，经PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选一种）或分了检测（7.3、7.4任选一2
-riKAoNrKAca
SN/T1135.13—2015
种）后，任意一项结果为阴性时，则判断样品不带有PVY，有可疑症状的样品，经PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选一种）和分子检测（7.3、7.4任选种）后，两项结果均为阴性时则判断样品不带有PVY。
8.2PVY特异性的血清学检测结果（7.1、7.2任选一种）、分子检测结果（7.3、7.4任选一种）、免疫电镜检测结果（7.5)中任意两项为阳性时，则判断样品带有PVY。8.3PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选种）、分子检测（7.3、7.4任选一种）任一结果为阳性：并经鉴别寄主检测（7.6）在烟草上产生叶脉坏死症状，则判断样品带有PVY并属于N株系群。9样品保存
结果记录与资料保存
完整的实验记录要包括：样品的米源，种类，时间，实验检测时间，地点方法和结果，并有实验人员的签字：生物学测定结果图片、RT-PCR检测电泳结果图片、实时荧光RT-PCR检测结果图片。9.2样品保存
样品直接放于-80℃冰箱或冷冻手燥后放于80℃冰箱保存1年，保存的样品要做好标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经或活处理S
TKAoNiKAca
SN/T1135.13—2015
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯Y病毒相关资料
马铃薯Y病毒的自然奇主非常广泛，包括多达9个科的植物，其中涉及重要的作物如辣椒（Ca力stcumspp.），马铃薯（Solanumtuberosumssp.tuberosum）、烟草（Nicotianaspp.），番茄（L.ycopersiconesculentum），还涉及一些园艺作物（Dahlia和Petuniaspp）及很多杂草（Daturaspp.，PhysalissppSolanumdulcamara和S.nigrum）。在新西兰己记录了新的自然侵染寄主：南方山莞要（Cotulaaustralis）和荠菜（Capxellabursa-pastoris）。已报道的人！接种可侵染的实验寄主包括31个科72个属的495种植物，其中包括科（Solanaceac)14个属287种植物（这其中含141种茄属植物和70种烟草属植物）、克科28种、豆科25种、藜科20种、菊科11种。
A.2株系
历更上，直到目前大家普遍接受的株系划分方法，是根据该病毒在烟草Nicotianatabacum（cvsWhiteBurleyandSamsunNN]、洋酸浆（Physalisfloridana）及不同马铃薯品种上的症状表现，将马铃薯Y病毒划分为普通株系（PVYO）、烟草脉坏死株系（PVYN）、PVYC三个主要株系群，随着研究的深人，有学者依据该病毒与具有不同基因型背景的马铃薯品种互作的病理效应，并结合在烟草上的症状将PVY分为O、N、C、Z、E等多个不同株系类群，其中类群N又可分为PVYN、PVYNTN、PVYNW等多个株系。
A.3地理分布
马铃薯Y病毒在世界马铃薯种植区范围内广泛分布。在马铃薯作物上PVYO株系世界范围内发生。PVYN株系已经在南美、欧洲、非洲、亚洲以及新西兰有报道，但在加拿大和美国却是检疫性有害生物，在那里局部发生。据目前所知PVY株系在欧洲、北美洲、印度、南非、澳大利亚、新西兰和厄瓜多尔有发生。PVYNTN株系在世界大多数马铃薯种植区已鉴定，包括美国、H本、秘鲁。PVYNW株系在波兰已成为流行株系，并在其他国家已经报道，包括法国、西班牙、德国和俄罗斯。PVY.株系在加拿大（Manitoba）和美国（Minnesota，Montana，NorthDakota）有报道A.4基因组特征
病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长680nm~900nm，直径11nm~13nm。为单分子线形正义ssRNA，长约9.7kb,编码的多聚蛋白切割产生10个蛋白。A.5寄主症状
PVY侵染马铃薯引起的症状表现与病毒株系、栽培品种品系及环境条件有关，而且与是初侵染（介4
-iiAoNrkAca
SN/T1135.13—2015
体蚜虫接种）还是再侵染（种薯感染）有关，地上植株的症状包括轻微到严重的叶片斑驳，常伴有皱缩畸形。较下部的叶片常发生黄化和坏死（叶脉坏死和坏死斑点）。症状还包括中间叶片的坏死干枯并下垂（垂叶），可见垂叶依附于植株的主茎。再侵染植株矮化脆弱，叶片扭曲皱缩。很多品种的块茎可能发生坏死症状，1984年发现的马铃薯块茎坏死环斑病，是由PVYNTN株系引起的，现已在世界范围内扩散。PVY常引起烟草，番茄，辣椒的轻微斑驳，然而常可以观察到很多不同症状，而且很多株系引起坏死。烟草叶脉坏死病是由PVYN株系引起的，以前认为该株系是烟草叶脉坏死病毒。PVY在辣椒上常引起叶片斑驳、沿脉变色和皱缩，有时叶片畸形脱落，植株矮化枯死。在茄子上，PVY株系引起系统花叶，较低部的叶片可产生坏死环。-TiKAONIKAca
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B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
使用质量有保证厂商生产的酶联板B.1.2
包被抗体
特异性的马铃薯Y病毒或其株系抗体酶标抗体
来系抗体
碱性磷酸酯酶标记的马铃薯病毒或其株B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠(pNPI
样品抽提缓冲液（pII7.4）
亚硫酸钠（NaSO）
PVP(MW24 000--40 000)
叠氮钠（NaN，）
4℃储存。
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na.COa）
碳酸氢钠（NaHCO,）
叠氮钠（NaN）
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
B.1.7PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4)氯化钠（NaCI）
磷酸氢二钠（NaHPO）
磷酸二氢钾（KH.PO）
氯化钾(KCI)
叶温-20（Tween-20）
蒸馏水定容至1L。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）PBST
-TTKAONKAca
BSA（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉PVP(MW2400040.000)
4℃储存。
B.1.9底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgCl）
叠氮钠（NaN.）
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用
B.2程序
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，液，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：
用人酶联板的
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1L,4℃储存。
中100μL/孔，加盖，37℃孵育2h，清空孔中溶本积）加人抽提缓冲液.用研钵研磨成浆，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样
加人制备好的检测样品、阳性对照阳性对照.100
样品设一重复。加盖后于4℃冰箱孵育过夜或37℃孵育4h，酷联板用自来水彻底冲中洗再用蒸蜜才
水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作液度
37℃孵育4h，酶联板用自来水间底冲洗.再用蒸馅水洗涤1次B.2.5加底物
加入到酶联板中，100uL/孔，加盖，PBST洗涤3次，每次3min
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min、1h，2h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。
B.3结果判断
B.3.1对照孔的OD40s值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15，当阴性对照孔的OD值0.05时，按0.05计算；阳性对SN/T1135.13—2015
照OD40s值/阴性对照OD4s值5～10；同一样品的重复性基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ODas值/阴性对照ODa值>2，判为阳性；样品OD4as值/阴性对照OD4os值接近阈值，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法验证；样品OD0值/阴性对照OD435值2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。8
C.1试剂
附录C
（规范性附录）
免疫层析试纸条检测
样品抽提缓冲液，配制方法参见附录B.1.5。C.2检测样品的制备
SN/T1135.13—2015
测试的样品按1：10（质量：体积）加缓冲液，经研磨后，低速离心取上清液（未离心的样品在测试时，一些大颗粒物质的存在，易影响液流的上行，从而使得检测效果不佳），每一样品取约250L1.5mL的离心管中，以能走完试纸条为宜，测试样品体积过多，可稀释胶体金，使得测试效果不好。C.3操作步骤
测试前将试纸条恢复至室温。
将试纸条含胶体金复合物的一端插人到样品中，样品液不要超过胶体金试纸条上的MAX线。测试观察的时间以10min～20min为好。对于病毒浓度低的样品时间可适当延长。C.4结果判断
质控点（线）显粉红色，测试点（线）也显粉红色，检测结果为阳性C.4.1
质控点（线）显粉红色，测试点（线）未显色，检测结果为阴性。C.4.2
质控点（线）和测试点（线）均未显色，说明试纸条失效，检测结果无效。C.4.3
C.5贮存
试纸条应在2℃8℃冰箱内密封干燥保存。C.6试纸条有效性的判断方法
C.6.1用阳性对照进行测试.测试点（线）显色，质控点（线）也显色，说明整个系统工作正常。C.6.2用阳性对照进行测试，测试点（线）显色，而质控点（线）末显色，说明羊抗免失效C.6.3用阳性对照进行测试，测试点（线）未显色，而质控点（线）显色，说明测试点（线）的特异性抗体失效。测试纸条失效不能用。
C.6.4用阳性对照进行测试，若测试点（线）未显色，质控点（线）也未显色，说明整个测试纸条失效，不能用。
SN/T1135.13—2015
TrizoL裂解液
D.1.250×TAE
冰醋酸
Na,EDTA·2H.0
附录D
（规范性附录）
RT-PCR检测
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1D.1.36×加样缓冲液
漠酚蓝
熊糖水溶液
实验步骤
总RNA提取
称取0.5植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀
（25：24：1），500uL，上下颠倒混℃.12000g
的1.5mL离心管中，加入1mL的
人灭日
离心10
上清液，加入饱和苯酚氯仿-异戊醇.12000g
离心1
抽提步骤1次：加0.6倍体积的异内醇.巅倒混勾双工清液；重复饱和茶酚-氯仿-异戊醇ma.取
12000g
洗涤沉淀，4℃.7500g离心2
m弃乙醇沉淀
手室温
下充分
中，一20℃保存备用。也可采用其他有效的IRNA提取
D.2.2RT-PCR反应
反转录合成cDNA
检测引物见表D,1
上游引物
下游引物
反转录体系见表D.2
心10min，弃上清液：加75%的乙醇燥后，溶于30μLddIIO(DEPC处理）RT-PCR检测的引物
PVY-a-F420:5°-CGATACAAGACTGATGYCCAGAT-3Pvy-a-R12C05*-TAYTGTTGRGCACAGGTRGGG-3
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马铃薯Y病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Potato virus Y2015-12-04发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-07-01实施
SN/T1135共分为13部分：
第1部分：马铃薯癌肿病检疫鉴定方法；第2部分：马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法；第3部分：马铃薯带顶病毒检疫鉴定方法；第4部分：马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法：第5部分：马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法；第6部分：马铃薯腐病菌检疫鉴定方法：第7部分：马铃薯A病毒检疫鉴定方法；第8部分：马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法：第9部分：马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法；第10部分：马铃薯V病毒检疫鉴定方法：第11部分：马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法；第12部分：马铃薯M病毒检疫鉴定方法；第13部分：马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第13部分。本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T1135.13—2015下载标准就来标准下载网
本部分起草单位：中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。本部分主要起草人：刘洪义、刘忠梅、张永江、李桂芬、王宏毅、魏梅生、周志强、张洪祥、杨立群。1范围
马铃薯Y病毒检疫鉴定方法
SN/T1135.13—2015
SN/T1135的本部分规定了马铃薯Y病毒（PotatouirusY)的检疫鉴定方法。本部分适用于可能带有马铃薯Y病毒的马铃薯植株繁殖材料及其他寄主植物的检疫鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本义件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB7331马铃薯种薯产地检疫规程SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯Y病毒基本信息
学名：Potato virusY
缩写：PVY
异名:Potato severemosaic virus,Potato acropetal necrosis virus,Solanum virus 2,Tobacco vein-banding virus,Potato leafdrop streak virus,Tobacco veinal necrosis virus,Potato virus 20。分类地位，马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyuirus）。传播途径：马铃薯种薯传毒，机械接种可传毒，多种蚜虫以非持久性方式传播该病毒。远距离传播通过种薯贸易完成，
马铃薯Y病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
PVY的基因组特征、免疫原性和在寄主植物上的症状特征是该病毒检疫鉴定的依据。依据PVY及主要株系的基因组特征建立RT-PCR、实时荧光RT-PCR（Real-timePCR）检测方法：依据PVY及主要株系的免疫原性建立酶联免疫吸附（ELISA）方法、胶体金免疫试纸条方法和免疫电镜方法：依据PVY及主要株系在不同寄主植物上的症状特征建立鉴别寄主诊断法；通过这些方法的有效组合，判断样品是否带有PVY及主要株系。
5仪器设备、用具及试剂
5.1仪器设备
酶标仪、PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、生物安全柜、小型离心机、台式冷冻离心机、水浴锅、凝胶成像系统、制冰机、超低温冰箱、常规冰箱、电子天平、涡旋振荡器、组织捣碎机、恒温培养箱等。5.2用具
可调移液器（0.1μ~2.5，2μL~20μL，10μL~100μL，20μ~200μL，100μL1000μL）和SN/T1135.13—2015
可调移液器头、离心管、研钵、微型磨杆。5.3试剂
双抗体夹心酶联免疫吸附测定所需试剂见附录B，免疫层析试纸条检测所需试剂见附录CRTPCR检测所需试剂见附录D.实时荧光RT-PCR检测所需试剂见附录E。6样品的抽取及制备
6.1抽样
马铃薯贸易商品或科研用薯材料或国际间种质交流材料等现场抽样按照SN/T2122的规定执行，田间调查采样按照GB7331的规定执行6.2脱毒苗、微型薯、块茎等样品的制备将脱毒苗、微型薯、块茎播于非土介质或火菌土中，于25左右生长并进行症状观察：待长出3片1片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。6.3茄科等寄主植物种子样品的制备将种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播丁灭菌王中：于25℃左右生长并进行症状观察。待长出3片4片真叶后将表现症状的植株单独编号，未表现症状的植株分组7实验室鉴定
7.1酶联免疫吸附测定
见附录B。如选用合格的试剂盒，按试剂盒说明操作7.2
2胶体金免疫层析试纸条检测
见附录C。如选用不同生产商的合格产品，按其操作说明操作7.3RT-PCR检测
见附录D。
7.4实时荧光RT-PCR检测
见附录E。
5免疫电镜检测
按照SN/T1840的规定执行。
6鉴别寄主检测
见附录F。
8结果判定
0株为1组)并编号，
8.1无可疑症状的样品，经PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选一种）或分了检测（7.3、7.4任选一2
-riKAoNrKAca
SN/T1135.13—2015
种）后，任意一项结果为阴性时，则判断样品不带有PVY，有可疑症状的样品，经PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选一种）和分子检测（7.3、7.4任选种）后，两项结果均为阴性时则判断样品不带有PVY。
8.2PVY特异性的血清学检测结果（7.1、7.2任选一种）、分子检测结果（7.3、7.4任选一种）、免疫电镜检测结果（7.5)中任意两项为阳性时，则判断样品带有PVY。8.3PVY特异性的血清学检测（7.1、7.2任选种）、分子检测（7.3、7.4任选一种）任一结果为阳性：并经鉴别寄主检测（7.6）在烟草上产生叶脉坏死症状，则判断样品带有PVY并属于N株系群。9样品保存
结果记录与资料保存
完整的实验记录要包括：样品的米源，种类，时间，实验检测时间，地点方法和结果，并有实验人员的签字：生物学测定结果图片、RT-PCR检测电泳结果图片、实时荧光RT-PCR检测结果图片。9.2样品保存
样品直接放于-80℃冰箱或冷冻手燥后放于80℃冰箱保存1年，保存的样品要做好标记和登记工作，以备复验、谈判和仲裁。保存期满后，需经或活处理S
TKAoNiKAca
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A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
马铃薯Y病毒相关资料
马铃薯Y病毒的自然奇主非常广泛，包括多达9个科的植物，其中涉及重要的作物如辣椒（Ca力stcumspp.），马铃薯（Solanumtuberosumssp.tuberosum）、烟草（Nicotianaspp.），番茄（L.ycopersiconesculentum），还涉及一些园艺作物（Dahlia和Petuniaspp）及很多杂草（Daturaspp.，PhysalissppSolanumdulcamara和S.nigrum）。在新西兰己记录了新的自然侵染寄主：南方山莞要（Cotulaaustralis）和荠菜（Capxellabursa-pastoris）。已报道的人！接种可侵染的实验寄主包括31个科72个属的495种植物，其中包括科（Solanaceac)14个属287种植物（这其中含141种茄属植物和70种烟草属植物）、克科28种、豆科25种、藜科20种、菊科11种。
A.2株系
历更上，直到目前大家普遍接受的株系划分方法，是根据该病毒在烟草Nicotianatabacum（cvsWhiteBurleyandSamsunNN]、洋酸浆（Physalisfloridana）及不同马铃薯品种上的症状表现，将马铃薯Y病毒划分为普通株系（PVYO）、烟草脉坏死株系（PVYN）、PVYC三个主要株系群，随着研究的深人，有学者依据该病毒与具有不同基因型背景的马铃薯品种互作的病理效应，并结合在烟草上的症状将PVY分为O、N、C、Z、E等多个不同株系类群，其中类群N又可分为PVYN、PVYNTN、PVYNW等多个株系。
A.3地理分布
马铃薯Y病毒在世界马铃薯种植区范围内广泛分布。在马铃薯作物上PVYO株系世界范围内发生。PVYN株系已经在南美、欧洲、非洲、亚洲以及新西兰有报道，但在加拿大和美国却是检疫性有害生物，在那里局部发生。据目前所知PVY株系在欧洲、北美洲、印度、南非、澳大利亚、新西兰和厄瓜多尔有发生。PVYNTN株系在世界大多数马铃薯种植区已鉴定，包括美国、H本、秘鲁。PVYNW株系在波兰已成为流行株系，并在其他国家已经报道，包括法国、西班牙、德国和俄罗斯。PVY.株系在加拿大（Manitoba）和美国（Minnesota，Montana，NorthDakota）有报道A.4基因组特征
病毒粒子为弯曲线状，无包膜，长680nm~900nm，直径11nm~13nm。为单分子线形正义ssRNA，长约9.7kb,编码的多聚蛋白切割产生10个蛋白。A.5寄主症状
PVY侵染马铃薯引起的症状表现与病毒株系、栽培品种品系及环境条件有关，而且与是初侵染（介4
-iiAoNrkAca
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体蚜虫接种）还是再侵染（种薯感染）有关，地上植株的症状包括轻微到严重的叶片斑驳，常伴有皱缩畸形。较下部的叶片常发生黄化和坏死（叶脉坏死和坏死斑点）。症状还包括中间叶片的坏死干枯并下垂（垂叶），可见垂叶依附于植株的主茎。再侵染植株矮化脆弱，叶片扭曲皱缩。很多品种的块茎可能发生坏死症状，1984年发现的马铃薯块茎坏死环斑病，是由PVYNTN株系引起的，现已在世界范围内扩散。PVY常引起烟草，番茄，辣椒的轻微斑驳，然而常可以观察到很多不同症状，而且很多株系引起坏死。烟草叶脉坏死病是由PVYN株系引起的，以前认为该株系是烟草叶脉坏死病毒。PVY在辣椒上常引起叶片斑驳、沿脉变色和皱缩，有时叶片畸形脱落，植株矮化枯死。在茄子上，PVY株系引起系统花叶，较低部的叶片可产生坏死环。-TiKAONIKAca
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B.1试材
酶联板的要求
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
使用质量有保证厂商生产的酶联板B.1.2
包被抗体
特异性的马铃薯Y病毒或其株系抗体酶标抗体
来系抗体
碱性磷酸酯酶标记的马铃薯病毒或其株B.1.4底物
对硝基苯磷酸二钠(pNPI
样品抽提缓冲液（pII7.4）
亚硫酸钠（NaSO）
PVP(MW24 000--40 000)
叠氮钠（NaN，）
4℃储存。
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na.COa）
碳酸氢钠（NaHCO,）
叠氮钠（NaN）
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
B.1.7PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4)氯化钠（NaCI）
磷酸氢二钠（NaHPO）
磷酸二氢钾（KH.PO）
氯化钾(KCI)
叶温-20（Tween-20）
蒸馏水定容至1L。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）PBST
-TTKAONKAca
BSA（牛血清白蛋白）或脱脂奶粉PVP(MW2400040.000)
4℃储存。
B.1.9底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）氯化镁（MgCl）
叠氮钠（NaN.）
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用
B.2程序
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，液，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：
用人酶联板的
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1L,4℃储存。
中100μL/孔，加盖，37℃孵育2h，清空孔中溶本积）加人抽提缓冲液.用研钵研磨成浆，2000r/min离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行。B.2.3加样
加人制备好的检测样品、阳性对照阳性对照.100
样品设一重复。加盖后于4℃冰箱孵育过夜或37℃孵育4h，酷联板用自来水彻底冲中洗再用蒸蜜才
水洗涤1次，PBST洗涤3次，每次3min。
B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作液度
37℃孵育4h，酶联板用自来水间底冲洗.再用蒸馅水洗涤1次B.2.5加底物
加入到酶联板中，100uL/孔，加盖，PBST洗涤3次，每次3min
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
在不同的时间内如30min、1h，2h或更长时间，用酶联仪在405nm处读OD值，或用肉眼观察显色情况。
B.3结果判断
B.3.1对照孔的OD40s值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：缓冲液孔和阴性对照孔的OD值<0.15，当阴性对照孔的OD值0.05时，按0.05计算；阳性对SN/T1135.13—2015
照OD40s值/阴性对照OD4s值5～10；同一样品的重复性基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：样品ODas值/阴性对照ODa值>2，判为阳性；样品OD4as值/阴性对照OD4os值接近阈值，判为可疑样品，应重新做一次，或用其他方法验证；样品OD0值/阴性对照OD435值2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判断。8
C.1试剂
附录C
（规范性附录）
免疫层析试纸条检测
样品抽提缓冲液，配制方法参见附录B.1.5。C.2检测样品的制备
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测试的样品按1：10（质量：体积）加缓冲液，经研磨后，低速离心取上清液（未离心的样品在测试时，一些大颗粒物质的存在，易影响液流的上行，从而使得检测效果不佳），每一样品取约250L1.5mL的离心管中，以能走完试纸条为宜，测试样品体积过多，可稀释胶体金，使得测试效果不好。C.3操作步骤
测试前将试纸条恢复至室温。
将试纸条含胶体金复合物的一端插人到样品中，样品液不要超过胶体金试纸条上的MAX线。测试观察的时间以10min～20min为好。对于病毒浓度低的样品时间可适当延长。C.4结果判断
质控点（线）显粉红色，测试点（线）也显粉红色，检测结果为阳性C.4.1
质控点（线）显粉红色，测试点（线）未显色，检测结果为阴性。C.4.2
质控点（线）和测试点（线）均未显色，说明试纸条失效，检测结果无效。C.4.3
C.5贮存
试纸条应在2℃8℃冰箱内密封干燥保存。C.6试纸条有效性的判断方法
C.6.1用阳性对照进行测试.测试点（线）显色，质控点（线）也显色，说明整个系统工作正常。C.6.2用阳性对照进行测试，测试点（线）显色，而质控点（线）末显色，说明羊抗免失效C.6.3用阳性对照进行测试，测试点（线）未显色，而质控点（线）显色，说明测试点（线）的特异性抗体失效。测试纸条失效不能用。
C.6.4用阳性对照进行测试，若测试点（线）未显色，质控点（线）也未显色，说明整个测试纸条失效，不能用。
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TrizoL裂解液
D.1.250×TAE
冰醋酸
Na,EDTA·2H.0
附录D
（规范性附录）
RT-PCR检测
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1D.1.36×加样缓冲液
漠酚蓝
熊糖水溶液
实验步骤
总RNA提取
称取0.5植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀
（25：24：1），500uL，上下颠倒混℃.12000g
的1.5mL离心管中，加入1mL的
人灭日
离心10
上清液，加入饱和苯酚氯仿-异戊醇.12000g
离心1
抽提步骤1次：加0.6倍体积的异内醇.巅倒混勾双工清液；重复饱和茶酚-氯仿-异戊醇ma.取
12000g
洗涤沉淀，4℃.7500g离心2
m弃乙醇沉淀
手室温
下充分
中，一20℃保存备用。也可采用其他有效的IRNA提取
D.2.2RT-PCR反应
反转录合成cDNA
检测引物见表D,1
上游引物
下游引物
反转录体系见表D.2
心10min，弃上清液：加75%的乙醇燥后，溶于30μLddIIO(DEPC处理）RT-PCR检测的引物
PVY-a-F420:5°-CGATACAAGACTGATGYCCAGAT-3Pvy-a-R12C05*-TAYTGTTGRGCACAGGTRGGG-3
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