SN/T 1135.2-2016
基本信息
标准号:
SN/T 1135.2-2016
中文名称:马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法
标准类别:商检行业标准(SN)
标准状态:现行
出版语种:简体中文
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相关标签:
马铃薯
病毒
检疫
鉴定
方法
标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 1135.2-2016.Detection and identification of Potato yellow dwarf virus.
1范围
SN/T 1135.2规定了马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定的基本原则和方法。
SN/T 1135.2适用于所有进境种薯,商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯黄化矮缩病毒的检疫鉴定以及马铃薯黄化矮缩病毒引起病害的田间调查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法
SN/T 2122进 出境植物及植物产品检疫抽样
3马铃薯黄化矮缩病毒基本信息
中文名:马铃薯黄化矮缩病毒
学名: Potato yellow dwarf virus
缩写:PYDV .
分类地位:弹状病毒科( Rhabdoviridae) ,细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)。
马铃薯黄化矮缩病毒的其他信息参见附录A。
4方法原理
马铃薯黄化矮缩病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。
5仪器设备、用具及试剂
5.1 仪器设备
电子分析天平(0.0001g)、小型离心机、台式冷冻离心机恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、电泳系统、pH计凝胶成像系统、4 °C冰箱、超净工作台、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T1135.2—2016
代替SN/T1135.22003
马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法Detection and identification of Potato yellow dwarf virus2016-12-12发布
涂原直真伪
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2017-07-01实施
SN/T1135系列标准共分为13部分:前言
第1部分:马铃薯癌肿病检疫鉴定方法;第2部分:马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法;第3部分:马铃薯帚顶病毒检疫鉴定方法;第4部分:马铃薯黑粉病菌检疫鉴定方法;第5部分:马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法;第6部分:马铃薯腐病菌检疫鉴定方法:第7部分:马铃薯A病毒检疫鉴定方法;第8部分:马铃薯坏疽病菌检疫鉴定方法;第9部分:马铃薯青枯病菌检疫鉴定方法:第10部分:马铃薯V病毒检疫鉴定方法;第11部分:马铃薯皮斑病菌检疫鉴定方法;第12部分:马铃薯M病毒检疫鉴定方法;第13部分:马铃薯Y病毒检疫鉴定方法。本部分为SN/T1135的第2部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分代替SN/T1135.2—2003《马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法》。本部分与SN/T1135.2—2003相比,主要技术性差异如下:删除了“术语和定义”一章;
-增加了“马铃薯黄化矮缩病毒基本信息”章;删除了“现场检疫与抽样”一节;一增加了“检测方法”二节;
增加了RT-PCR检测方法。
SN/T1135.2—2016
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位:中国检验检疫科学研究院。本部分主要起草人:李明福、张永江、丁小兰、刘忠梅、赵竹、王秀芬、李桂芬、陈燕芳、曾庆才、刘善斌。
本标准所代替标准的历次版本发布情况为:SN/T1135.2—2003。
1范围
马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法SN/T1135.2-—2016
SN/T1135的本部分规定了马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定的基本原则和方法。本部分适用于所有进境种薯、商品用薯、组培苗和脱毒苗等马铃薯种质中马铃薯黄化矮缩病毒的检疫鉴定以及马铃薯黄化矮缩病毒引起病害的田间调查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注H期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3马铃薯黄化矮缩病毒基本信息
中文名:马铃薯黄化矮缩病毒
学名:Potatoyellorwdwarf virus缩写:PYDV
分类地位:弹状病毒科(Rhabdoviridae),细胞核弹状病毒属(Nucleorhabdouirus)。马铃薯黄化矮缩病毒的其他信息参见附录A。4方法原理
马铃薯黄化矮缩病毒的血清学特性、分子生物学特性和生物学特性是检疫鉴定的主要依据。5仪器设备、用具及试剂
5.1仪器设备
电子分析天平(0.0001g)、小型离心机、台式冷冻离心机、恒温水浴锅、酶标仪、普通PCR仪、电泳系统、pH计、凝胶成像系统、1℃冰箱、超净工作台、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、涡旋振荡器、微波炉、电子透射显微镜等。5.2用具
可调式微量移液器(2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL、5000μL)及相应的无RNase吸头,无RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签等。5.3
有特殊说明除外,所有实验用试剂均为分析纯。SN/T1135.2—2016
双抗体酶联免疫吸附测定、RT-PCR检测试剂分别见附录B和附录C。6样品制备
抽样按照SN/T2122的规定进行。将马铃薯块茎种植在隔离温室中,于25℃生长并进行症状观察。待长出3片~-4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号。采集的叶片进行双抗体酶联免疫吸附测定、RT-PCR、电镜检测或生物学测定。7检测方法
双抗体酶联免疫吸附测定
见附录B。
7.2RT-PCR检测
见附录C
7.3免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察,参照附录A病毒粒体形态判定免疫电镜检测结果。7.4
生物学测定
见附录D。
8结果判定
7.1、7.2、7.3和7.4中的两种检测结果为阳性,即可判定检出马铃薯黄化矮缩病毒。9样品保存与记录结果
样品保存
经检验确定携带马铃薯黄化矮缩病毒的样品应在合适的条件下保存,马铃薯病薯块及叶片样品在一20℃或一80℃冰箱中保存,试管苗保存于组培室中,做好标记和登记工作。保存期满后,需经灭活处理。
9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录要包括:样品的来源、种类、时间,实验的时间、地点,方法和结果等,并要有经手人和实验人员的签宁。双抗体酶联免疫吸附测定检测应有酶联板反应的原始数据,RT-PCR检测应有电泳结果图片,电镜检测应有病毒粒体照片,生物学测定应有鉴别寄主的症状照片。2
TiKAoNiKAca
A.1寄主范围
附录A
(资料性附录)
马铃薯黄化矮缩病毒背景资料
SN/T1135.2—2016
白然寄主主要为马铃薯(Solanumtuberosum)、牛眼雏菊(Chrysanthemumleucunthemum),终车轴草(Trioliumincarnatum)。实验寄主包括十字花科、唇形科、豆科、藝科和玄参科等双子叶植物60余种。
A.2分布
该病毒主要分布在美国、加拿大。A.3病害症状
马铃薯病株矮缩,黄化;植株叶小,通常卷曲、皱缩,参见图A.1;茎的生长点早期坏死;上部的茎常开裂,开裂处可看到茎节的髓部及皮层有锈色斑点,块茎小而少,块茎和茎部的距离很近。图A.1感染PYDV的马铃薯植株
A.4传播途径
叶蝉传播及汁液接种传播;病薯块或组培苗可通过运输远距离传播。A.5粒体形态
病毒粒体有包膜,杆菌状或子弹状,通常较直,直径45nm100nm,长度130nm~300nm(如3
TYKAoNiTAca
SN/T1135.2—2016
图A.2)。
A.6基因组特征
图A.2PYDV病毒粒体
该病毒为单分体基因组,核酸为单链负义RNA,12kb~14kb。TKAONKAca
B.1试剂
包被缓冲液(pH9.6)
碳酸钠(NazCO)此内容来自标准下载网
碳酸氢钠(NaHCO)
叠氮化钠(NaN,)
附录B
(规范性附录)
双抗体酶联吸附测定(DAS-ELISA)1.59g
用蒸馏水溶解并定容至1L,4℃储存。B.1.2
PBST缓冲液(pII7.4)
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾(KH,PO)
磷酸氢二钠(NaHPO412H,O)
氧化钾(KCI)
Tween-20
用蒸馏水溶解并定容至1L。
样品抽提缓冲液
亚硫酸钠(Na2SO)
聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)
叠氮化钠(NaN.)
用PBST缓冲液溶解并定容至1L.4℃储存。酶标抗体缓冲液(pH7.4)
BSA(牛血清蛋白)
PVP(分子量24000~40000)
叠氨化钠(NaN)
用PBST缓冲液溶解并定容至1L,4℃储存。5底物
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)
6底物缓冲液
二乙醇胺
氯化镁(MgCl)
叠氮化钠(NaN,)
溶于0.8L蒸馏水中,用HCI调pH至9.8,再加蒸馏水到1L,4℃贮存。SN/T1135.2—2016
KAOMIKAca
SN/T1135.2—2016
实验步骤
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释,加人酶联板的孔中,100μL/孔,加盖,37℃孵育2h,清空孔中溶液,PBST洗涤3次,每次3min。
B.2.2样品制备
待测样品按1:10(g/ml)加人样品抽提缓冲液,用研钵研磨成浆,7500g离心10min,上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行,空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔(或48孔)酶联板,包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100uL/孔,每个样品设一个重复。4℃冰箱孵育过夜,酶联板用PBST洗涤3次。
B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度,并加入到酶联板中,100μL/孔,加盖,37℃下孵育4h,酶联板用自来水彻底冲洗,再用蒸馏水洗涤1次,PBST洗涤3次,每次3min。B.2.5加底物
将底物pNPP加到底物缓冲液使终浓度为寸1mg/mL(现配现用),按100L/孔,加人到酶联板中,室温避光孵育。
B.2.6读数
用酶标仪在30min、1h和2于405nm处读OD值。注:实际检测时,解育温度、PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3
结果判定
B.3.1对照孔的OD40s值(缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔)应该在质量控制范围内,即:缓冲液孔和阴性对照孔的OD5值小于0.15,当阴性对照孔的OD值小于0.05时,按0.05计算;阳性对照(Da值/阴性对照()D4os值大于5;同一样品的重复性一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后,结果原则上可判断如下:样品OD4s/阴性对照OD405>2,判为阳性;样品OD405/阴性对照值接近阈值,判为可疑样品,需重新做一次,或者用其他方法进行验证;样品OD40s/阴性对照OD405<2,判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求,则不能进行结果判断TTKAONKAca
C.1试剂
C.1.150×TAE电泳缓冲液
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸
Na,EDTA·2H,0
附录C
(规范性附录)
RT-PCR检测
加蒸馏水至1L,用时加蒸馏水稀释至1XTAEC.1.26×加样缓冲液
溴酚蓝
燕糖水溶液
40%(质量液度)
E游引物PYDVF:5CGCTCAGTTCGTGCAGTTGT3下游引物PYDV-R:5*-TCTGATTCTAGTCCACGCTGC-3预计扩增片段为196bp。
C.3实验步骤
C.3.1核酸提取
SN/T1135.2—2016
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉未状,迅速将其移人灭菌的1.5ml离心管中,加人1mLTrizol,
剧烈震荡混匀:4℃,12000r/min离心5min,取上清液移人新的离心管中,除去不溶成分:在室温下,静置5min后加入200μL三氯甲烷,剧烈振荡15s,在室温下放置omin;4℃,12000r/min离心
15min,取上清液水相放入新的离心管中,加人与上清液水相等体积异丙醇,颠倒混匀,在一20℃下,放置30min以上;4℃,12000r/min离心10min,RNA在侧壁或管底沉淀;弃上清液,加人1mL70%的冷乙醇,12000r/min离心2min,弃乙醇,重复3次;沉淀放于超净台无菌风吹干15min~20min,干燥后加人20μL~30μL的RNasefreewater.溶解沉淀,缓慢摇匀后,置于一80℃保存备用。注:也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作。C.3.2RT-PCR扩增
cDNA的合成:在0.2mLPCR管中,加人总RNA3μL,1L下游引物(10μmoL/L),1μl.10mmol/IdNTP,9μLRNasefreeH,O,70C,5min,冰上放置5min,加人4μL5XM-MLVRTBuffer,1μLMMLV反转录酶(200U/uL),1uLRNasinRNA酶抑制剂,42℃水浴1h,合成cDNA。PCR扩增:在0.2mI.PCR管中,加入2.5μL10XPCR缓冲液,1uLcDNA,0.5L10mmol/LdNTP,1.0uL上、下游引物(10μmoL/L).0.5μLExTag聚合酶(5U/uL),用无菌水补足到25μL设置阳性对照、阴性对照及空白对照。7
SN/T1135.2—2016
反应条件:94℃,5min92℃205.56℃1min,72℃,1min,30cycles;72℃,10minC.3.3
3琼脂糖凝胶电泳
用电泳缓冲液配制1.5%的琼脂糖凝胶,将5uLPCR扩增产物与1uL6×加样缓冲液混合,然后将其和DNA分子量标记物分别加人到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统观察并保留结果。
结果判定
1阳性对照在196bp处有扩增条带,阴性对照和空白对照无特异性扩增,待测样品出现与阳性对C.4.1
照一致的扩增条带,可判定为阳性2结果达到质控要求,且样品在196bp处无扩增条带,判定结果为阴性。C.4.2
D.1接种
(规范性附录)
生物学测定
SN/T1135.2—2016
病叶加1:1(质量:体积)的磷酸盐缓冲液(0.1moL/L.pH7.2)于研钵中充分研碎,在待接种植物叶片表面均匀洒上硅藻土,用手指蘸取研磨好的汁液轻轻涂抹于叶片表面,自来水冲洗叶表。做好标签,置于隔离温室中。每天观察记载寄主反应寄主症状
心叶烟(Nicotianaglutinosa)、黄花烟(Nicotianarustica):局部亮黄色褪绿坏死、明脉、叶畸形花叶。
绛车轴草(Trifoliumincarnatum):明脉。9
SN/T1135.2-2016
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
马铃薯黄化矮缩病毒检疫鉴定方法SV/T1135.2—2016
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)总编室:(010)68533533
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16印张1字数22千字2018年1月第一版2018年1月第一次印刷印数1-500
书号:155066·2-32387
定价18.00元
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