SN/T 2367-2009.Procedures for the detection of seed-transmitted pathogens in importing and exporting seeds.
1范围
SN/T 2367规定了植物种子传播的病原真菌、细菌、病毒(包括类病毒)和线虫等病原微生物的检疫鉴定的程序和一般方法。
3术语和定义
3.1种传病原seed-transmitted pathogens
附着或寄生于种子外部、内部，或混杂于种子中,以种子作为载体或媒介传播为害新生植物体,引起新生
植物体局部或系统侵染病害的植物病原物。种传病原包括植物病原真菌、细菌、病毒(含类病毒)和线虫。PaulNeergaar(1979)试图将种子只是传带病原物而不会引起植物病害的一类病原物称为种带病
害(seed-borne diseases),而将还会引起植物病害的称为种传病害(seed-transmitted diseases)。由于两者难于区分,本标准统一采用种 传病害。
3原理
3.1 病原真菌
3.1.1以病菌的子实体或病组织混杂在种子中间，如小麦、大麦和黑麦等禾本科种子中的黑粉菌菌癭、麦角;水稻种子中稻曲病的菌核等。病原菌与种子一起休眠后萌发,进行局部或器官专化性侵染。子实体和病组织可以用肉眼检查。
3. 1.2 以繁殖体(无性或有性的孢子)或菌丝体附着在种子的表面,当种子萌发时进行局部或系统侵染。可以采用分离培养或洗涤方法进行检验。
3.1.3以菌丝体潜伏在种子的种皮或颖壳内或种皮与颖壳之间,随着种子的萌发而萌发,引起局部侵.染或系统侵染。可以采用萌发、分离培养的方法进行检验。
3.1.4 以菌丝体侵人种子的内部,特别是早期侵人,潜伏在种皮以内的组织中。肉眼可以观察到种子:的表面的不同程度症状;由于是内部感染,需要用分离培养或萌发的方法进行检验。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T 2367—2009
进出境植物种子种传病原检测操作规程Procedures for the detection of seed-transmitted pathogensin importing and exporting seeds2009-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2010-03-16实施
规范性引用文件
术语和定义
主要仪器设备与试剂
备工作
现场检查与取样
直接检查
植物病原真菌
植物病原细菌
植物病毒
植物病原线虫
样品保存·
附录A（资料性附录）
附录B(资料性附录)
附录（（资料性附录）
附录D（资料性附录)
附录E(资料性附录)
附录F (资料性附录)
附录G（资料性附录）
附录 II (资料性附录)
附录I（资料性附录）
附录」（资料性附录）
主要种传病原真菌及其检验方法主要种传病原细菌及其寄主
主要种传病毒及其寄士
主要种传病原线虫及其寄主
主要试剂及配制方法
主要培养基及配制方法
血清学检测方法
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
分子生物学检测方法.
致病性测定方法
指示植物
SN/T 2367--2009
SN/T2367--2009
本标准的附录A、附录B、附录C、附录D、附录E、附录F、附录G、附录H、附录1和附录J均为资料性附录。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标推主要起草人：林石明、廖富荣、余芳平、陈青、陈红运、土宏毅、吴媛本标推系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1范围
进出境植物种子种传病原检测操作规程SN/T2367—2009
本标准规定了植物种子传播的病原真菌、细菌、病毒（包括类病毒）和线虫等病原微生物的检疫鉴定的程序和一般方法。
本标准适用于植物学概念的真种子和作为繁殖材料的果实（如：颖果、瘦果、核果、坚果等）；不适用于植物营养器官的块根、块茎、鳞球些、地工或地上基以及嫩被和吸收枝等农业概念的“种子”，以及人工人造种子
经过化学或物理处理的种子（好种衣剂处理可以参随本标准2规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准
多款。凡是注日期的引用文件，其随后所有本标谁，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究的修改单（不包括勘误的内容）或修订版构不适用于是是不注日期的用文件其最新版本适用于本标准。是否可使用这些文件的最新版本。GB/T18085小麦矮握黑穗病菌检疫鉴定方法植物检疫手册（国家质量监督检验检疫总局.2007）3术语和定义
种子seed
各类植物繁殖材料的总称，包
A植物学概念的种子：由植物程
称真种子；
义，即
花器的胚珠
B植物学概念的果实：由植物哥株的子房
或“子粒”，如多数禾本科作物的颖果，回日的坚果和核果等；
C作为繁殖材料的植物营养器
如马曼
蔗的地上茎，杨柳的嫩枝，以及莲的吸收枝本标准所指种子为A、B所述
种传病原seed-transmittedpathogens请而来的
经过维雄配子的有性结合所产生，也器的其他
部分发
菊科蔬鼎
纳块茎，日
育而来的外果皮，也称为“子实”双悬果，甜菜的小坚果，果树林木的换根，葱蒜类的鳞茎，慈姑的球茎，甘附着或寄生于种子外部、内部，或混杂于种子中，以种子作为载体或媒介传播为害新生植物体，引起新生植物体局部或系统侵染病害的植物病原物。种传病原包括植物病原真菌、细菌、病毒（含类病毒）和线虫PaulNeergaar(1979)试图将种子只是传带病原物而不会引起植物病害的一类病原物称为种带病害（seed-bornediseases），而将还会引起植物病害的称为种传病害（seed-transmitteddiseases）。由于两者难于区分，本标准统一采用种传病害。4原理
4.1病原真菌
4.1.1以病菌的子实体或病组织混杂在种子中间，如小麦、大麦和黑麦等禾本科种子中的黑粉菌菌瘦、1
SN/T 2367—2009
麦角：水稻种子中稻曲病的菌核等，病原菌与种子一起休眠后萌发·逊行局部或器盲专化性役染。了实体和病组织可以用肉眼检查。
4.1.2以繁殖体《无性或有性的孢子）或菌丝体附差在种子的表面.当种子萌发时逊行局部或系统侵染。可以采用分离培养或洗涤方法进行检验。4.1.3以菌丝体潜伏在种子的种皮或赖壳内或种皮与颖壳之问,随着种于的萌发而萌发，引起局部侵染或察统侵染。可以采用萌发，分离培养的力法行检验。4.1.4以菌丝体慢人种子的内部.将别是早期侵人潜伏在种皮以内的组红中，肉眼可以观察到种子的表面的不同程度症状；由于是内部感染，需要用分高培养或萌发的方法迹行检验，4.1.5以菌丝体潜伏在种肝内。在种子发育期简间侵人种瓶，并以休眠菌丝体的形我潜伏在种胚内，科子外表与正常的种子没有太大差别.播种后也会萌发.但是产生系统性侵染，如小麦的散黑粉菌。这类病害检验难度比较大，需要逊行整胚检验或化学梁色检验，或若试精检验，4.1.6参见附录A开展种传病原真菌的检验，如需要,植物病原真菌进行分离，培养、纯化，根据形态学特征、生物学特性以及必要时的致病性测定等行整定，4. 2病原细菌
4.2.1细菌附着在种子表面。有些细菌在干燥条件下可以长期潜伏，保持休眠状态随着种了荫发而侵染。
4.2.2细菌潜伏在种子内部。有些细菌通过维管束由胚座，或出种子的珠孔仅入种子内部、潜伏在颖壳、胚乳或胚等，播种后扩散到维管束引起系统侵染。4.2.3参见附录B开展种传病原细菌的检测。如需要，植物病原细菌的检验进行分离、坑养.纯化,主要足根据形态学特征、生物学特性、生理生化试验和必要时的致病性测定，以及血清学和分于生物学方法等逃行检测鉴定。
4.3植物病毒（包括类病垂】
4.3.1种子外表传带病毒：病毒的颗粒污染子的外表，如烟节花叶病毒。不同病辞的体外保毒期不同,有些可以长达近自年，有些只有几个星期。4.3.2种胚外部传带病毒：如甘熊花叶病毒。4.3.3种内部传带病毒：种传病毒多数属于胚味染和花粉传染类型。4.3.4种传病毒的带毒率和存活期，不同的病毒在不同的寄主植物、不同品种，不同生产季节和不同的产地等存在较大的差异。开展检测过程中需要不断收集该方面的资料，总结分析检测结果。参见附录C开展种传病毒的检测。植物病毒的检测鉴定主要采用生物学、血清学和分子生物学方法进行捡测鉴定，以及电子显微镜的形态特征等。由于病毒在种子的分布情况与种植后小苗地发病情况具有较大的差异。有虽然在种子的表皮污染有病毒的粒子，但尼，在种子种植后并不能发病。为此，为了确定种传病毒的活性，需要选择正确的检测方法。4.4植物病原线虫
4.4.1附着于种子外表。线虫的幼虫或成虫附着在种于的外表，或存活在土块中，或生虫嬉混杂在种子中。
4、4.2潜伏在种子内部。
4.4.3植物病原线虫的检验需要根据种于带线虫的方式，采用肉眼检查、过筛检验、比重检验和谢斗分离检验等，并主要根据形态特征进行种类鉴定（参见附录I）。5主要仪器设备与试剂
5.1仪器
一一离心机（台式离心机，冷冻离心机、高速离心机）；—显微镜（20×--1000X或带底光源的体显微镜，8×～100×）：2
-培养箱（5士2℃～50士2℃，带定时器，近紫外光或黑光灯光源）；冰籍（—20+2℃）;
-烘于箱；
同旋式振荡器；
天平；
高压火菌器；
冰冻切片机：
超净下作台：
-酶标仪；
-PCR仪；免费标准下载网bzxz
电泳仪；
凝胶成像系统，
恒温水浴钢。
5.2器具和器皿
种子研磨器具《机）；
手持扩大镜；
移液器；
培养胆（直径9. 0 ～12 );
吸水纸或滤纸（直径8.0cm~11cm)；筛网（孔径1mim）。
5.3试剂
染色剂、浮载剂、表面消毒剂及生化试剂等(参见附录E)。5.4我照物质
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植物病原真菌、细菌和植物病毒的检测鉴定，应采用参照菌株或其他适宜的性、阴性质控物。所采用的参照菌株或质控物应该是来自权威的机构，并经过必要的验证。6准备工作
在接受任务之后，开始检疫前需要对种子的种类进行正确的判定，查询该寄主植物种传病害的种类、带菌（毒)率和存活期等相关资料(参见附录A至附录D），以及相关的文献资料；尽可能查阅原产地的病害发生情况，确定检验方案(包括检测项目和检测方法等）。7现场检查与取样
仔细检查有无土块，病残体、虫瘦、菌婆等真菌的子实体、杂草籽和害虫；有无发霉、腐烂、病斑、疱斑、肿块、开裂、变色、畸形或发育不正带的种了。注意分辨由子牛理性原因（如：缺素、温度、湿度、甚至毒素等)所引起的异常种了的区别。重点抽取具有典型或有可疑症状的种子.或按种子千粒重随机打取样品足够实验室检测所需要的种子数量。样品的托取比例见《植物检疫手册》。迹行简明而准确的描述和记录·必要时还应照相和（或）录像。8直接检弯
8.1感官检验
用低倍放大镜或直接肉眼检查外表有明显症状的种子、可见的病原物子实体。检查病残体、菌瘦、菌梭和虫燃等；种子有无发霉、腐烂、病斑、疮斑、肿块、开裂、变色、畸形或发育不正常等情况；种了中是杏有害虫、土块、杂草籽等。
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8.2过筛检验
利用病原物与种子的形状、大小的区别，通过网筛将病原体筛出，再挑栋或放大镜检查根据种子的大小，采用筛目不同的（2～3）层套筛，进行旋转连续筛理数分钟（采用电动筛选器效果更好）。筛理后，将各层筛上的试样倒入白色瓷盘内，摊成薄层，放大镜或肉眼检查，挑栋出病原物的子实体。
8.3解剖检验
如果检查到病残体、虫瘦或菌瘦等组织结构，徒手切片或冰冻切片或石蜡切片，制片检查。必要时染色检查。记录形态特征，测量大小，并进行鉴定。8.4种衣剂的处理
经过种衣处理的种子由于抑制或掩盖目标菌的生长，影响检测结果。培养前需要用无菌水、酒精或其他的表面活性剂清洗种子表面的衣药，来用以下的方法如萌发培养或试植检验方法（见8.3）。9植物病原真菌
9.1洗涤检验
称取50g或适量的种子，加无菌水1003min，充弃上清液，加适量席尔氏液（其配制方法见本方法仅限于种子批数量相对较大的样品
真菌，可以采用此方法进行检验。9.2胚胎计数法（或染色检验法）根据千粒重，称取种子（如小麦利器中振荡5min，取洗涤液在1000r/m离心派图
18085)镜检沉淀物。
研手具有典型形态特征的抱子、孢子梗等结构的病原00粒），设2个重复。将样品倒人透后，再将样品倒人适宜容器中，用温水洗涤，1L新配置的5%氢氧化钠溶液中，20℃下放置24h，完全汽从果皮下分离出胚芽。将所收集胚芽放在把胚芽移人等量的甘油和水中进鲜无水乳酚油的烧杯中，煮沸乳酸油·在洲
把胚芽转移到新鲜的微温甘
（如小麦散黑粉菌为金褐色菌丝蓝
粉菌感染）。
本方法可以用于检验胚芽组
感染胚芽的各类真菌的菌丝体的9.3萌发培养检验
大孔径的筛网收集胚乳和种皮碎片。mm孔得
全的筛网内，用单
风厨中，把胚芽移到装有75mL新步分开压芽和种皮，在通
在带底
光源解
尚3u，菌丝体古
镜检套胚芽
据整个屑
如黑粉菌、内生
菌等病
可见到一些具有特征性的菌丝体果细胞壁变色，它们可能被散黑的检验。在检验过程中应该注意9.3.1吸水纸法
每个培养血铺三张吸水纸（根据培养皿的直径选择吸水纸，通常直径为9.0cm也可采取不同颜色的吸水纸以便观察），用无菌蒸馏水浸透，后倒去多余的水。在无菌条件下，根据种子的大小，每个培养皿均勾地摆放适量的种子（10，25，50或100粒，种子之间距离约1cm～2cm），培养血在光管下约25cm处，不要重叠。
在20℃～25℃恒温下（可根据种子和病原菌设计温度，如20℃2℃），光暗交替处理（12h交替）或黑暗条件下，保湿培养1d～7d，解剖镜检查种子上真菌生长情况，高倍显微镜子实体并鉴定。检查培养物，观察子实体（分生孢子，分生孢子梗、分生孢子器、分生孢子盘等），记录侵染的部位、侵染百分率；菌落的密度、颜色等，进行鉴定。必要时，还需采用适宜的培养基进行分离、纯化培养。以下方法是吸水纸法的改进。
2.4-D吸水纸法：种子事先用0.2%新鲜配置的2，4-D钠盐溶液浸泡处理，抑制种子萌发。其余方法同上。
冷冻吸水纸法：培养1d～3d后，转移培养皿到冰箱一20℃士2℃下培养24h。冰冻后，在20℃±4
2℃下，12h光暗交替或黑暗条件下培养5d~7d。其余方法同上。9.3.2琼脂平板法
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将种子浸泡在30%的双氧水中30min（3份的双氧水与1份的种子），期间搅拌种子1次～2次。倒去双氧水，并加无菌水搅拌5min。在无菌条件下，倒去无菌水，用无菌吸水纸吸十种子表面的水。检测带菌率则不进行表面消毒，直接用种子进行分离培养。无菌条件下，在水琼脂培养基或麦芽汁琼脂培养基培养Ⅲ上，均勾摆放种子。在20℃士2℃下，黑暗/近紫外光交替培养10d(培养血在光管下约25cm处，不要重叠）。之后，用解镜下检查培养物用高倍显微镜下检查分生孢子等子实体结构。每3d检查一次，将有变色污点的种子取出，记录侵染的部位、侵染百分率、菌落的形态、颜色等。必要时，还需纯化培养，或单孢子分离。其他培养基的制备方法参见附录E9.4小苗症状检查
9.4.1沙土培养法
挑取异常的种子，播种于蒸热清按合适间隔地播种后，覆盖约3cm上或细沙中，将种子
2周后检查异
的基质，置于室温下（或25℃，12h交替光照）。带的幼苗，进行病原菌的分离：病毒检验则进行血清学试验（参见附录G)和（或）分子生物学（参见附录H)的方法进行检测和电镜检查。9.4.2试管琼脂法
对于比较小的种子，可以将种子插种于直径0mm、内装10mL的水琼脂试管中，每管种子2粒或多粒，在25C（或适宜的温度）下语养接121h自光灯光照处理保持湿度，试管用铝箔覆盖）。当幼苗长出覆盖物时移出，进行病原菌的分离病毒的血清学试验租域D分子生物学的方法进行检测。
9.5鉴定
9.5.1形态鉴定
根据病原真菌的生长情况、培养的随落特征9.5.2血清学鉴定
殖体的类型
达小进行鉴定。
使用检测鉴定试剂盒对植物病原真菌种）进行鉴定参见附录G)。
的种类属或）
9.5.3分子生物学鉴定
引物，并进行分子生物学检测鉴定（参见附录H）。将所分离的病原真菌，设计特异性9.5.4致病性测定
致病性弱，具有致病性差异的生物型，型种或变种，以及生理小种的植物病原真菌的鉴定则需要进行致病性测定（参见附录1）。
9.6结果判定
具有典型特征性孢子等子实体结构或载范体结构的，可根据形态特征进行鉴定无典型特征性形态特征的，结合形态特征、培养性状和致病性等，血清学和（或）分子生物学进行鉴定。10
植物病原细菌
10.1样品制备
根据种子的千粒重，称取检测所需的种子倒人新的、干净的塑料袋中。用研钵或在适宜的容器内粉碎，或用种子粉碎机粉碎。
防止种子之间的交叉感染，应戴手套或用70%酒精擦拭或喷酒消毒所有接触表面、容器、手等。接触样品和处理样品前均需消毒。10.2检验方法
10.2.1提取
根据所检测的种子数量，每1000粒种子，或粉碎的种子，将把灭菌的10mL无菌的生理盐水和吐温-20溶液倒人烧瓶中，预冷2℃~4℃处理5min10min，加人种子，悬浮。室温20℃~25℃下，在5
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振荡器t.以100 1/min～125r/rnin振荡2 h～3 h,10.2.2配制十倍系列稀释液
静置种子洗涤提取液.收集.l清液(母液）。无菌条件下,取 1.0 ml(或0.5mI)均液加9.0 ml(或4.5tmL0.85%无菌生理盐水，配制成10-的稀释液。按此方法，根据需要，配制10、10-3，101等十倍系列稀释液，并标记浓度。每次稀释前均筛充分混均种子提取液或稀释液中。每次都应该使用新的吸头。稀释后应该最好在30min内尽快使用；否则，应该保存在4℃下保存备用。10.2.3涂布培养
培养基参见附录F。从最高倍数（最低浓度)开始，依次吸取0,1 ml.种子提取液的稀释液和母被，加到表面干燥的选择性或平选择性培养血上，用弯曲的无菌玻棒均匀涂布。在吸取过程中，每个培养血应使用新吸头和玻。如果是从最低滚度到最高浓度（没有稀释），一个吸头和一根玻棒就够了。
待到培养基完全吸收稀释液后，将培养皿倒过来。如有必要，可在生物安全柜或超净工作台用无菌气流吹·干。
在28℃～30 ℃下培养,3d~~1d后观察平板。10.2.4质控物
需要设置阳性和阴性对照（参照菌株），以及无菌对照（无菌生理盐水和吐温-20溶液。其稀释和培养方法同上。参照菌株的稀释倍数约为10CFU/mI.~1O（FUJ/mL。每个处理至少设置2个重复。10.2.5检查平板
检查阳性对照和尤菌对照，与典型的参照菌株的菌落比较，检查是否有相似的可疑菌落。如果没有.则用培养1d～3即可；如果有，则用YIX，培养基进行划区纯化培养。计算可疑菌落和其他菌落的数目。
10.2.6纯化与鉴定
用记号笔在培养血底部划线，从中心起分为6个区。取单个菌落“之”字形划线纯化。每个菌株间预留足够空问，以防菌落融分在起。为了避免菌株间的交叉污染·每个菌落都要用新区，每个检测样最少需要纯化6个菌蒋，
在28℃~30℃下培养24h~48h，记录每个菌落的情况。如果怀疑菌落不纯，需要再次划线纯化，与参照菌株比较，挑取可疑菌落在YDC培养基培养繁殖，以备作致病性测定和其他整定之用。10.3鉴定
10.3.1细菌自动监定仪的鉴定
月动鉴定系统按原理分为基于微生物的表型分析或微生物的基因型检测。分离纯化的菌落，设置阴性和阳性质控物，按照所使用的“仪器操作说明”进行种类鉴定。10.3.2血清学检测鉴定
使用检测鉴定试剂盒对植物病原细菌的种（或属)进行鉴定（参见录G）。10. 3. 3分子生物学检测鉴定
将所分离的病源细菌，设计特异性引物.并进行分子生物学检测鉴定（参见附录H)。10.3.4致病性测定
植物病原细菌的致病性测定主要是针对那些致病性比较弱，又有多种生理生化分化的生物型、型种或变种，以及生理小种的鉴定（参见附录)。10.4结果判定
根据在培养基的荫落特征，致病性测定的结果，结合生理生化特性和/或血清学特性和/或分子生物学特性进行鉴延。
10.5关键控制点
阳性对照或参照菌株所配制的稀释平板应能够产生具典型特征的单个菌落。6
稀释乎板的菌萍数量应与稀释倍数相一致（每级的稀释倍数约以」俯率减少）。无菌对照的稀释平板应该没有产生菌落。致病性测定都成设阳性或参照菌株对照.并川产生典型的症状，SN/T 2367--2009
选择性或半选择性培养基中的抗生素的活性应该有质量保证。由丁生产批号的不同而有变化，便用前应该进行必要的验证,并据此调节抗生素的浓度11植物病毒
11.1样品制备
11. 1. 1 样品数量
感染病毒的种子有时会表现外部另常症状，如种子变小或变人、不饱满，皱缩、畸形；种子破裂、坏死，种皮变色等，但是多数情况下病种子着起米正常的。不同植物种类的种子、病毒、传带病毒的几相差很大；根据所传带的植物病毒种类，病毒传带比例和存活期等，确定所需要检测的种子量。对于种子传带病毒的比例较低的，检测的种子数量最少应有1000粒（大粒与特大粒种子除外），根据种子的大小将样品分成若干份检测样品，每份25粒·～100粒。11.1.2种子提取
将种子分成若于份，每份25粒~100粒，放入适宜于研磨的容器中按一定比例，在每份拌品中加人10ml.～2)tml.提取缓冲液（参见附录E)中研磨，直到将种子粉碎确均勾。研磨工具可以是研钵或研蘑机。种子提取液用于接种指示植物（参见附录J）、血清学检测（参见附录G)或分子生物学检测鉴定（参见陷录H)等。种子提取液应在3h内使用,否则应在4℃下保存。11.1.3小苗培育
将种子经过加热保凝催芽或古接播种于小盆钵。培育牟产生真叶，就可以进行生物学、血清学分了生物学的检测等。
应选择适宜的裁培介质，如采用砂、珍珠岩或土壤；裁培介质均需要高压灭菌处理。虽然多数的栽培介质可循环使用，礼是经过一段时问之后，需要更换。11.1.4组织提取
称取幼嫩植物组织（叶片、嫩茎等），分成君下份，每份50mg～100mg，放入适宜十研磨的容器中：加人适宜的提取缓冲液（参见附录E)，研磨或在榨汁机［榨汁，组织提取液用于接种指示梢物（参见附录J）、血清学检测（参见附录G)或分子生物学检测鉴定（参见附录II)等。
11.2检测方法
11.2.1生物学方法
11.2.1.1接种
根据病的种类，选择适它的指示植物（参见附录J）。选2片~1片最新完全展开的叶片，轻轻地弹去叶片上灰尘，将金刚砂撒在叶片表面，用棉签蕴取种子提取液，轻轻地摩擦叶面。在接种的纽织提取液中加人硅藻土进行接种。
接种精物应培养于18℃~22t的温室或生长箱中。接种后2min-~3min内，用水轻轻冲洗叶片，避免伤害接种叶片。
同样方法接种阳性（参照物质）和阴性对照（提取缓冲液）至少两株，11.2.1.2诱导系统侵染
接种植株在控制条件下（根据植物与所检测的病毒显症条件选摔温度和光照）至少培育14d。11.2.2电子显微镜检查
样品用适宜的缓冲液中研磨、提取（见11.1），采用免疫电子显微镜进行观察。病毒抗体用PBS或SN/T23672009
TBS缓冲液（pH7.4）稀释1000倍（不同种类和批次的抗体稀释倍数可能不同）。室温下，将表面盖有Formvar膜的铜网在几滴病毒抗体溶液（10μL~20μL）中浸没5min：铜网用20滴TBS或PBS缓冲液冲洗，用滤纸吸干多余缓冲液（但不能过分干燥）；铜网在植物提取液（10μL～20μL）中浸没15min以上（病毒浓度低则需2h12h）；用PBS或TBS缓冲液冲洗铜网，吸十多余缓冲液；在病毒抗血清溶液（用磷酸缓冲液50×~100×稀释TRSV抗血清）中再浸没15min；用蒸馏水清洗铜网后加1%~2%乙酸铀酰染色，在4万倍透射电镜下检查。11.3鉴定
11.3.1生物学方法
参照所检测的病毒在寄主植物和指示植物上所引起的典型症状，检查接种植物的症状。初步判定所检测到的病毒种类。
11.3.2形态特征
根据电子显微镜所观察到的病毒粒子形态，对照病毒的典型特征，初步判定所检测到的病毒种类。11.3.3血清学检测鉴定
使用检测鉴定试剂盒对提取物进行血清学检测监定(参见附11.3.4分子生物学检测鉴定
设计特异性引物对提取物进行分子生物学检测鉴定参见附录H)。
11.3.5侵染力测定
植物种传病毒的侵染力测定，以及带毒率等定量检验是利用指示植物对某些病毒的特异性反应，参见生物学方法（见11.2.1)。
11.4结果判定
根据血清学特性、（或)生物学特性、（或）分子生物学特性（或）电镜检查的结果进行鉴定11.5关键控制点
虽然多数的指示植物通常能够产生症状，而且可能其他病毒也会产的症状
但并不是都会产
起的类似症状。必要时，采用
生相同症状，注意区别其他病毒或其他原因（如药害、灼伤鉴）所引ELISA方法验证所产生的症状。
有些指示植物还可用于繁殖病毒，以便于血清学或免疫电子显微镜或电镜观察等检测鉴定。12植物病原线虫
12.1漏斗检验法
备好的漏斗内，漏斗的底部连接胶管和夹或适当加以研磨，放入
将种子用双层纱布或吸水纸包好子（或其他设置），然后加水使种子浸没，在2025℃下浸24h。收集漏斗底部的溶液，生物体视显微镜检查；或2000r/min离心5min后取下部沉淀液检查线虫主要用于检验种子外表所传带的线虫，如水稻干尖线虫（Aphelenchoidesbesseyi），以及外表没有症状的种子也可能携带大量的线虫。起绒草茎线虫（Ditylenchusspp.）的4龄幼虫和成虫不仅寄生在种皮上，种子内部或子叶中，还混杂于种子的残体内。严重感染的种皮开裂，子叶上出现坏死病斑。有时大量的线虫在种子表面形成聚集出团，特别是在种脐的沟缝中。12.2浸泡分离法
将虫瘦在湿润的滤纸上培养1h～12h后，充分吸涨的虫瘦，与正常的颖果比较，颜色变深、变软。用解剖针打开之后，就会释放出大量白色的幼虫。在20×～40×解剖镜下检查，测量长度和宽度。或称取150g或适量的种子，在400ml.的自来水中浸泡过夜。搅动种子，将浸泡水倒在烧杯里；杯中再加人100mL的水，静置4h，倒去上清液，取沉淀物检查。六月禾科（禾本科）的粒线虫病（Anguinaspp.），产生暗褐色至紫褐色或黑色的，圆形或卵形甚至雪茄状，约4mm～5mm长的虫瘦；其颖片、外程和内荐均比正常的长数倍。8
12.3鉴定
根据所分离到的线虫的形态特征和(或)分子生物学特性进行种类鉴定。样品保存
植物种子应在干燥、低温、蔽光的条件下保存。SN/T 2367—2009
所分离纯化的病原真菌、细菌的菌种可以在室温或低温下保存；或在矿物油.土壤，灭菌蒸馅水等材料中保存或在冷冻、液氮中保存。所分离的病毒可以保存在隔离检疫温室内，可以按照要求进行重复接种延续保存：或采集典型症状的叶片在超低温冰箱内保存、或经氯化钙脱水后，在超低温冰箱内保存。所分离的植物病原线虫杀死后，则于团定液中保存;或制作成玻片保存。
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