本文件规定了法庭科学领域DNA实验室检验的基本要求。 本文件适用于法庭科学领域从事法医物证检验的实验室。

ICS07.140
CCSA92
中华人民共和国国家标准
GB/T43635—2024
法庭科学
DNA实验室检验规范
ForensicsciencesSpecificationsforexamination ofDNA laboratory2024-03-15发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-10-01实施
GB/T43635—2024
第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由中华人民共和国公安部提出。本文件由全国刑事技术标准化技术委员会(SAC/TC179)归口。本文件起草单位公安部鉴定中心、国家毒品实验室广东分中心、浙江省公安厅、苏州市公安局中国政法大学、北京生物医药研究所、最高人民检察院检察技术信息研究中心、中国人民解放军军事科学院军事医学研究院。
本文件主要起草人：叶健、白雪、赵兴春、刘超、吴微微、张广峰、陈静、李民、周如华、陈松、张建、李彩霞、袁丽、戴文申、高冲、王升启。I
1范围
DNA实验室检验规范
法庭科学
本文件规定了法庭科学领域DNA实验室检验的基本要求。本文件适用于法庭科学领域从事法医物证检验的实验室。2
规范性引用文件
GB/T43635—2024
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27025检测和校准实验室能力的通用要求GB/T43633法庭科学DNA实验室建设规范GA/T765
人血红蛋白检测金标试剂条法
GA/T766人精液PSA检测金标试剂条法GA/T1163人类DNA荧光标记STR分型结果的分析及应用4法庭科学DNA实验室质量控制规范GA/T1704
GA/T1972
法医物证检验术语
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
GA/T1972界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
预试验
preliminarytest
筛选可疑体液(斑)的试验。
确证试验
confirmatorytest
检验体液(斑)中特有成分的试验。3.1.3
聚合酶链式反应
polymerasechainreaction;PCR
个酶促的特定DNA片段体外扩增过程。3.1.4
线粒体DNA
mitochondrialDNA;mtDNA
存在于人类细胞的线粒体中的闭环双链DNA。注：人类线粒体DNA约16.5Kb;不遵循孟德尔遗传定律，表现为母系遗传，通过卵细胞将其中的遗传信息传递给后代；无有丝分裂和减数分裂的周期变化；遗传物质位于细胞器内，不受核移植的影响；单个细胞中mtDNA拷1
GB/T43635—2024
贝数多；存在异质性现象。
3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CTAB:十六烷基三甲基溴化胺（CetylTrimethylAmmoniumBromide）DNA:脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcidDTT:二硫苏糖醇(Dithiothreitol)EDTA：乙二胺四乙酸（EthylenediaminetetraaceticAcid）SDS:十二烷基磺酸钠(SodiumDodecylSulfate)STR：短串联重复序列（ShortTandemRepeats）TRIS-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（TRISHydrochloride）RNA:核糖核酸(RibonucleicAcid)4总体要求
4.1实验室人员、环境、方法、设备和试剂均应符合GB/T43633(法庭科学DNA实验室建设规范）的要求。
4.2法医生物检材、样本的受理、流转、保管、处置均应符合GB/T43633(法庭科学DNA实验室建设规范)的要求。
4.3实验室应进行内部和外部质量控制以确保结果的有效性，质量控制应符合GA/T1704中相关的结构要求、资源要求、过程要求和管理要求。4.4检验过程中应有效防止DNA污染，包括：防止DNA提取和PCR反应时发生的检材/样本间的交叉污染；防止外界环境和人员的污染。过程中涉及的DNA检验用产品具体要求可参照GB/T41844执行。
4.5检验过程中应采取安全有效的防护措施保护检验人员,并应做好危害性废弃物的管理。4.6检验过程中所使用的水均应为符合GB/T6682规定的一级水。除非另有规定，所采用试剂均为分析纯级别。
5检验流程
5.1检验流程一般包括预试验、确证试验、DNA提取与纯化、DNA定量、人类DNA性别及STR多态性分析等，应根据不同的检材/样本类型和委托目的选择所需的检验流程。5.2DNA提取可采用全自动提取工作站，具体步骤应参照工作站的操作说明书进行。PCR扩增采用商品化试剂盒的，应按相应的试剂盒操作，使用前应验收。6预试验
6.1血痕预试验
6.1.1四甲基联苯胺试验
6.1.1.1试剂
试剂配方见附录A的A.1。
6.1.1.2方法
GB/T43635—2024
取滤纸轻轻擦拭斑迹，按顺序滴加冰醋酸、四甲基联苯胺无水乙醇饱和液、3%过氧化氢溶液，立即出现翠蓝色为阳性反应。
6.1.2鲁米诺试验
6.1.2.1试剂
主要试剂包括：
鲁米诺粉末；
b）过氧化钠粉末。
6.1.2.2方法
将鲁米诺粉末0.1g溶于100mL纯水，然后加入过氧化钠粉末0.5g混匀，喷洒斑迹，立即出现蓝色荧光为阳性反应。
6.2其他预试验
参照试剂盒说明书操作。
7确证试验
7.1人血液(斑)确证试验
按照GA/T765进行试验。
2人精液(斑)确证试验
7.2.1精子检出法
酸性品红美蓝染色法（Baecchi染色法）7.2.1.1.1 试剂
主要试剂包括：
1%酸性品红溶液(用1%盐酸配制）；a）
1%亚甲蓝溶液；
1%盐酸；
d）二甲苯。
2方法
7.2.1.1.2
取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，离心取沉渣涂于载玻片上，干燥后分别用1%酸性品红溶液染色2min~3min后去除染液，滴加1%亚甲蓝溶液染色2min~3min后去除染液，1%盐酸漂洗，干燥后二甲苯透明，镜检。精子头部被染成红色、尾部被染成蓝色。3
GB/T43635—2024
7.2.1.2苏木素伊红染色法(H.E染色法）7.2.1.2.1试剂
主要试剂如下。
苏木素溶液：苏木素0.9g溶于10mL无水乙醇；明矾(硫酸铝钾）或硫酸铝铵20g,加蒸馏水a）
200mL加热溶解。上述2种溶液混合加热煮沸后，徐徐加入氯化汞0.5g，再加热煮沸后快速冷却。使用时每100mL加入冰醋酸4mL。伊红溶液：伊红0.5g溶于80%乙醇100mL中。b)1
c）分化液：在80%乙醇中加入盐酸，配制成0.5%~1%的盐酸酒精溶液。d）二甲苯。
7.2.1.2.2方法
取少量可疑斑迹用适量生理盐水浸泡后，离心取沉渣涂于载玻片上，干燥后用苏木素溶液浸染5min~10min,清水漂洗；滴加分化液分化5s~10s;水洗后再用伊红溶液浸染2min~3min,清水漂洗，干燥后二甲苯透明，镜检。精子头部被染成红色、尾部被染成蓝色。7.2.2人精液PSA检测金标试剂条法按照GA/T766进行试验。
7.3其他确证试验
参照试剂说明书操作。
8DNA提取与纯化
8.1DNA提取与纯化可使用包括但不限于下列方法(具体操作方法见附录B）：a）有机溶剂法：通过酚-氯仿混合液去除蛋白质类有机物质，保留DNA于水相溶液中；b)）
Chelex(聚苯乙烯二乙烯基苯树脂)法：通过Chelex螯合镁、钙离子等，使降解DNA的核酸酶失去活性；
硅珠法：在高浓度的硫氰酸胍存在的条件下，通过二氧化硅微粒特异捕获DNA磁珠法：在胍盐存在条件下,利用可吸附DNA的硅材料包被磁性颗粒,特异性吸附DNAd)
CTAB法：通过非离子型去污剂CTAB破坏细胞壁和细胞膜及硬组织，并与DNA形成复合物，分离DNA与蛋白质及多糖类物质；f)
硅胶膜吸附法：通过硅胶膜吸附细胞裂解液裂解后释放出DNA,并经蛋白酶消化、漂洗液清洗除去蛋白质、脂质以及多糖等杂质。8.2当使用其他商品化产品的核酸提取和纯化方法，以及自行开发的核酸提取和纯化方法时，应按照GB/T27025要求进行方法确认。
8.38.1和8.2的DNA提取与纯化方法适用于人源性和非人源性生物检材和样本，RNA的提取和纯化可参照执行。
9DNA定量
9.1实时荧光定量PCR方法
9.1.1利用一系列已知浓度的DNA样品制备标准曲线。2配制待测样品反应体系。
9.1.3在实时荧光定量PCR仪中进行检测试验。GB/T43635—2024
9.1.4分析试验结果，通过样品的阈值循环数(Ct值)和标准曲线计算得出待测样品的浓度。9.2其他定量方法
参照仪器说明书操作。
O人类DNA性别及STR多态性分析
10.1器材和试剂
主要器材和试剂包括
毛细管电泳遗传分析仪及配套试剂；b)
扩增仪；
移液器；
人类DNA性别及STR复合扩增试剂盒。10.2方法
10.2.1样品准备
设置阳性对照和阴性对照。
PCR扩增
DNA扩增
以提取DNA为模板的扩增反应体系及循环参数，参照试剂盒说明书操作，如有变更应进行方法确认。
10.2.2.2直接扩增
需要直接扩增的检材或样本，参照试剂盒说明书操作。10.2.3PCR反应产物的荧光检测
使用毛细管电泳遗传分析仪进行检测，PCR产物的电泳分离与荧光检测参照试剂盒说明书操作。10.2.4结果分析
按照GA/T1163进行结果分析。
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11人类线粒体DNA测序
11.1器材及试剂
主要器材和试剂包括：
a）毛细管电泳遗传分析仪及配套试剂；b）扩增仪；
移液器；
PCR试剂:引物(D-Loop高变区I或高变区Ⅱ)L1、H1、L2、H2(L2、H2的碱基序列范围比L1、H1小,并包含在L1、H1的范围内)、dNTP、Taq酶、PCR缓冲液；e
PCR产物纯化试剂盒；
f）测序试剂盒。
11.2方法
11.2.1样本DNA的扩增
11.2.1.1第一步扩增时,采用25μL体系，取适量模板DNA,加入dNTP、引物L1和H1、PCR缓冲液、Taq酶(DNA聚合酶），离心后进行PCR反应(反应参数根据具体引物的长度设定）。11.2.1.2第二步扩增时,采用50μL体系，取少量第一步扩增产物，加入dNTP、引物L2和H2、PCR缓冲液、Taq酶，离心后进行PCR反应(反应参数根据具体引物的长度设定）。11.2.1.3骨骼、毛干的测序从第一步开始，血液等富含DNA检材的测序从第二步开始。11.2.2扩增产物的纯化
参照试剂盒说明书操作。
11.2.3测序反应
以引物L2和H2作为测序引物，参照试剂盒说明书操作。11.2.4荧光测序
使用毛细管电泳遗传分析仪进行测序，参照仪器说明书操作。11.3结果分析
11.3.1电泳结果分析
运用分析软件进行自动分析，以修订的Anderson线粒体DNA序列为标准序列，测得样本的碱基序列与其比对，得到该样本线粒体DNA高变区段碱基序列的特征，结合电泳图谱复核结果。11.3.2遗传学分析
线粒体DNA的非编码区D环(D-loop)碱基序列为单倍型,进行遗传学数量分析时应依照单倍型基因频率统计,按照公式(1)和公式(2)进行计算。人类线粒体DNA的D-loop含有变异率较高的高变区（HighVariableRegions，HVR），本文件针对该区域进行测序。其他的DNA测序可参照执行。P=X2
.......( 1)
式中：
P一群体中任意两个体线粒体DNA多态区序列相同的可能性X一线粒体DNA单倍型在群体中的频率。h= (1-≥x 2)n/(n-1)
式中：
h一单倍型多样性;
X一线粒体DNA单倍型在群体中的频率；n一检测的样品数量。
使用其他商品化检测试剂盒的检验参照试剂盒说明书操作。
全自动DNA检测方法
GB/T43635—2024
.....(2)
DNA提取与纯化、定量、扩增和检测等全流程自动化操作参照设备和试剂说明书。按照GB/T27025要求进行方法确认。14
检验记录与结果报告
实验室应准确、清晰、完整地记录试验流程和结果，并依据检验结果出具鉴定文书。7
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A.1四甲基联苯胺试剂
四甲基联苯胺试剂主要包括：
附录A
(资料性)
常用试剂推荐配方
四甲基联苯胺无水乙醇饱和液(50mL)加冰醋酸5滴~6滴；3%过氧化氢(30%过氧化氢1mL加纯水9mL)。b)
2EDTA提取液(pH8.0）
EDTA提取液主要包括：
a)75 mmol/L NaCl;
24 mmol/ L EDTA。
用NaOH颗粒调整pH8.0。
3TNE缓冲液
TNE缓冲液主要包括：
10 mmol/LTRIS-HCI(pH 8.0) ;
1mmol/LEDTA提取液（pH8.0）；100 mmol/L NaCl。
TE缓冲液
TE缓冲液主要包括
10mmol/LTRIS-HCI(pH8.0);
1mmol/LEDTA提取液（pH8.0）。A.5
5×精子提取液
5×精子提取液主要包括
50 mmol/LTRIS-HCl;
50mmol/LEDTA提取液（pH8.0）；500 mmol/L NaCl;
10%SDS溶液；
0.5 mol/LDTT。
硅珠法吸附液
硅珠法吸附液主要包括：
12g硫氰酸胍10mL0.1mol/L;
TRIS-HCI(pH 6.4) ;bZxz.net
0.8mL0.5mol/LEDTA提取液（pH8.0）；0.5mLTritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚）。硅珠法漂洗液
硅珠法漂洗液主要包括：
12g硫氰酸胍10mL0.1mol/L;
TRIS-HCI(pH 6.4) 。
A.8硅珠悬液
硅珠悬液主要包括
0.06g二氧化硅；
1mL纯水。
CTAB提取缓冲液
CTAB提取缓冲液主要包括
20gCTAB1mol/LTRIS-HCI(pH 8.0)100mL;a）
0.5mol/LEDTA提取液(pH8.0)40mL:NaCl81.82 g。
定容至1L,使用前加入4mL2-琉基乙醇。GB/T43635—2024
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