本标准规定了食品中伏马菌素的免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱以及免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱测定方法。 本标准适用于谷物及其制品、婴幼儿谷类辅助食品、植物油脂中伏马菌素B1、伏马菌素B2、伏马菌素B3的测定。
本标准代替GB 5009.240-2016《食品安全国家标准 食品中伏马毒素的测定》。
本标准与GB 5009.240-2016相比，主要变化如下：
——标准名称修改为“食品安全国家标准 食品中伏马菌素的测定”；
——扩大了方法的适用范围；
——修改了各方法的线性范围；
——修改了各方法的检出限、定量限；
——修改了柱容量及柱回收率验证方法。

2023新版
中华人民共和国国家标准
GB 5009.240—2023
食品安全国家标准
食品中伏马菌素的测定
2023-09-06发布
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2024-03-06实施
2023新版
GB 5009.240—2023
本标准代替GB5009.240—2016《食品安全国家标准食品中伏马毒素的测定》。
本标准与GB5009.240一2016相比，主要变化如下：标准名称修改为《食品安全国家标准食品中伏马菌素的测定》；扩大了方法的适用范围；
修改了各方法的线性范围；
修改了各方法的检出限、定量限；修改了柱容量及柱回收率验证方法I
1范围
2023新版
食品安全国家标准
食品中伏马菌素的测定
GB5009.240—2023
本标准规定了食品中伏马菌素的免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱、高效液相色谱-串联质谱以及免疫亲和柱净化-柱前衍生高效液相色谱测定方法。本标准适用于谷物及其制品、婴幼儿谷类辅助食品、植物油脂中伏马菌素B1、伏马菌素B2、伏马菌素Bs（以下简称FBI、FB2、FB3）的测定。免疫亲和柱净化-柱后衍生高效液相色谱法第一法
2原理
试样经提取，免疫亲和柱净化，C18反相色谱柱分离，邻苯二甲醛衍生，荧光检测器检测，外标法定量。
3试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。3.1试剂
甲醇(CHOH)：色谱纯。
乙睛（CH.CN）：色谱纯，
甲酸（HCOOH）：色谱纯。
乙酸(CH:COOH)。
氢氧化钠(NaOH)。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠(Naz2HPO）。
磷酸二氢钾（KH2PO.）。
氯化钾(KCI)。
硼砂（NazBO·10H2O)。
2-巯基乙醇(C,HOS)。
邻苯二甲醛（CsH。O,OPA)。
吐温-20（C58H114O26）。
盐酸（HCI)。
试剂配制
甲酸-水溶液（0.1%）：准确移取1mL甲酸，用水稀释至1000mL，混合均匀。1
GB5009.240—2023
2023新版
3.2.2乙腈-水溶液（50十50）：分别量取500mL乙和500mL水，混合均匀。3.2.3乙睛-水溶液（20十80）：分别量取20mL乙睛和80mL水，混合均匀。3.2.4甲醇-乙酸溶液（98十2）：准确移取2mL乙酸，用甲醇稀释至100mL，混合均匀。3.2.5氢氧化钠溶液（2mol/L）：准确称取氢氧化钠8.0g，加50mL水溶解，冷却后，用水稀释至100mL，混合均匀。
3.2.6磷酸盐缓冲液（PBS)：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用980mL水溶解，用盐酸调整pH至7.4，用水稀释至1000mL，混合均匀。3.2.7吐温-20/PBS溶液（0.1%）：称取1.0g吐温-20，加入磷酸盐缓冲液并稀释至1000mL，混合均匀。
3.2.8硼砂溶液（0.05mol/L，pH10.5）：称取硼砂19.1g，溶于980mL水中，用氢氧化钠溶液调pH至10.5，用水稀释至1000mL，混合均匀。3.2.9衍生溶液：称取0.5g邻苯二甲醛，溶于20mL甲醇中，用硼砂溶液（0.05mol/L，pH10.5）稀释至500mL，加人2-巯基乙醇500μL，混匀，过滤后装入棕色瓶中，室温避光，可保存1周。3.3标准品
3.3.1伏马菌素B（C34H5gNO15，FB，CAS号：116355-83-0），纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.2伏马菌素B2（C34H5NO14，FB2，CAS号：116355-84-1），纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.3.3伏马菌素Bs（C34H5gNO14，FB3，CAS号：136379-59-4），纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.4标准溶液配制
3.4.1标准储备溶液（100μg/mL）：分别准确称取FB)、FBz和FB3各10mg（精确至0.01mg）至小烧杯中，用乙晴-水溶液（50十50)溶解，分别转移至100mL容量瓶中，以乙睛-水溶液（50十50）定容至刻度。于一18℃下避光保存，有效期6个月。3.4.2混合标准储备溶液：准确移取FB，标准储备液1.0mL、FB2和FB3标准储备液各0.5mL至同一10mL容量瓶中，加乙睛-水溶液（50十50）稀释至刻度，FB质量浓度为10μg/mL、FB2和FB质量浓度为5μg/mL。于一18℃下避光保存，有效期6个月。3.4.3混合标准工作溶液：准确移取混合标准储备溶液1.0mL至10.0mL容量瓶中，加乙睛-水溶液（50十50）稀释，定容至刻度，FB质量浓度为1μg/mL、FB2和FB质量浓度为0.5μg/mL。于4℃下避光保存，有效期6个月。
3.4.4混合标准系列工作溶液：准确移取混合标准工作溶液，用乙睛-水溶液（20十80）稀释，配制成FB质量浓度依次为20.0ng/mL、80.0ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL、480ng/mL，FB2和FB，质量浓度依次为10.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL、240ng/mL的混合标准系列工作溶液。临用现配。3.5材料
3.5.1免疫亲和柱（柱容量及柱回收率验证方法参见附录D)。注：在使用前需对每个批次的亲和柱进行柱容量及柱回收率验证。3.5.2微孔滤膜：0.45um，有机型。2
仪器和设备
4.1高效液相色谱仪，带荧光检测器。4.2柱后衍生系统。
4.3天平：感量0.01g和0.01mg。4.4均质器：转速≥2000r/min。2023新版
4.5振荡器（转速≥1000r/min)或超声波提取仪（功率≥500W）。4.61
离心机：转速≥4000r/min。
氮吹仪。
5分析步骤
试样制备
GB5009.240—2023
谷物及其制品、婴幼儿谷类辅助食品采样量不低于1kg；样品量不足1kg，取全部试样。用高速粉碎机将其粉碎，粉碎粒度应小于1mm。混合均匀后储存于洁净的容器内，密封后置于4℃下避光保存。
植物油脂采样量不低于1kg；样品量不到1kg，取全部试样。混合均匀后储存于洁净的容器内，密封后置于4℃下避光保存。
在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生伏马菌素含量的变化。5.2试样提取
5.2.1谷物及其制品、婴幼儿谷类辅助食品准确称取试样20g（精确至0.01g）于250mL三角烧瓶中，准确加入100mL乙睛-水（50十50）提取液，超声或振荡提取20min，转移20mL提取液至50mL离心管中，在4000r/min下离心10min，待净化。
5.2.2植物油脂
植物油脂提取过程按5.2.1步骤操作，提取液为下层。5.3试样净化
5.3.1婴幼儿谷类辅助食品
准确移取5.0mL提取液，加入45.0mL吐温-20/PBS溶液进行稀释，混合均匀后在4000r/min下离心10min，取上清液全部过免疫亲和柱，流速控制1mL/min～2mL/min，然后用10mLPBS缓冲液和10mL水依次淋洗免疫亲和柱，再用3mL甲醇-乙酸溶液分3次洗脱免疫亲和柱，收集合并洗脱液，55℃下氮气吹干，加入1mL乙-水溶液（20十80)溶解残渣，涡旋30s，过微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。
5.3.2谷物及其制品、植物油脂
准确移取0.5mL提取液，加人4.5mL吐温-20/PBS溶液进行稀释，混合均匀后在4000r/min下离心10min，上清液全部过免疫亲和柱，流速控制1mL/min～2mL/min，然后依次用10mLPBS缓冲液和10mL水淋洗免疫亲和柱，再用3mL甲醇-乙酸溶液分3次洗脱免疫亲和柱，收集合并洗脱液。3
GB5009.240—2023
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55℃下氮气吹干，加人1mL乙睛-水溶液（20十80)溶解残渣，涡旋30s，过微孔滤膜后，收集于进样瓶中,待测。
注：由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用。5.4
仪器参考条件
色谱柱：C18，粒径5um，4.6×250mm，或相当者。5.4.2
检测波长：激发波长335nm；发射波长440nm。流动相：A：甲酸-水溶液（0.1%）;B：甲醇。梯度洗脱，洗脱程序见表1。流动相流速：0.8mL/min。
衍生液流速：0.4mL/min。
柱温：40℃。
反应器温度：40℃。
进样量：50μL。
标准曲线的制作
流动相洗脱程序
流动相A
流动相B
将混合标准系列工作液从低浓度到高浓度分别注人高效液相色谱仪中，测定相应的峰面积。以标准溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。伏马菌素标准溶液的柱后衍生-高效液相色谱图参见附录A。
6试样溶液的测定
将待测溶液进样，得到对应的峰面积，根据标准曲线计算待测溶液中FB1、FBz、FB：的浓度。5.7
空白试验
不称取试样，按5.2和5.3的步骤做空白试验。分析结果的表述
待测样品中FBI、FBz、FB3的含量按式（1)计算。(p-po)×V×V×1000
mXV,X1000
......................(
式中：
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待测样品中FB、FB2、FB，的含量，单位为微克每千克（μg/kg）；GB5009.240—2023
待测溶液中FB、FBz、FB3的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；空白试验测得FBi、FB2、FB3的质量浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）；提取溶液的体积，单位为毫升（mL）；进样溶液的定容体积，单位为毫升（mL）)；换算系数；
样品的称样量，单位为克（g）；用于净化的提取溶液体积，单位为毫升（mL）。测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。精密度
在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的20%。其他
谷物及其制品、植物油脂，当称样量为20.0g时，FBi、FB2和FB3的检出限分别为60.0μg/kg、30.0ug/kg和30.0ug/kg，定量限分别为200μg/kg、100uμg/kg和100μg/kg。婴幼儿谷类辅助食品，当称样量为20.0g时，FB、FB，和FB的检出限分别为6.00μg/kg、3.00ug/kg和3.00μg/kg，定量限分别为20.0μg/kg、10.0μg/kg和10.0μg/kg。第二法高效液相色谱-串联质谱法9原理
试样经提取，加入同位素内标，免疫亲和柱或强阴离子交换固相萃取柱净化，C1反相色谱柱分离串联质谱仪检测，内标法定量。10试剂和材料
除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。10.1试剂
甲醇(CH:OH)：色谱纯。
乙腈（CH;CN）：色谱纯。
甲酸（HCOOH)：色谱纯。
氯化钠(NaCI)。
磷酸氢二钠（Na2HPO）。
磷酸二氢钾（KH,PO）。
氯化钾（KCI)。
吐温-20（C58H114O26）。
GB 5009.240—2023
乙酸(CHCOOH)。
10.2试剂配制
2023新版
甲酸-水溶液（0.1%）：准确移取1.0mL甲酸，用水稀释至1000mL水中，混合均匀。10.2.1
乙睛-甲醇溶液（50十50）：分别量取500mL甲醇和500mL乙腈，混合均匀。乙睛-水溶液（50+50）：分别量取500mL乙睛和500m水，混合均匀。10.2.4
乙腈-水溶液（20十80）：分别量取20mL乙腈和80mL水，混合均匀。10.2.5
甲醇-水溶液（60十20）：分别量取600mL甲醇和200mL水，混合均匀。10.2.6
甲醇-乙酸溶液（99十1）：准确移取1.0mL乙酸，用甲醇稀释至100mL，混合均匀。甲醇-乙酸溶液（98十2）：准确移取2.0mL乙酸，用甲醇稀释至100mL，混合均匀。磷酸盐缓冲液（PBS）：称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾，用980mL水溶解，用盐酸调整pH至7.4，用水稀释至1000mL，混合均匀。10.2.9吐温-20/PBS溶液（0.1%）：称量1.0g吐温-20，加入磷酸盐缓冲液并稀释至1000mL，混合均匀。
10.3标准品
伏马菌素B（FB，C34H5gNO15，CAS号：116355-83-0），纯度≥95%，或经国家认证并授予标准10.3.11
物质证书的标准物质。
10.3.2伏马菌素Bz（FB2，C34HsgNO14，CAS号：116355-84-1），纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.3伏马菌素B（FB3，C34HsgNO14，CAS号：136379-59-4），纯度≥95%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
10.3.413C34-伏马菌素B标准溶液（13C34-FB，25μg/mL）。10.3.513C34-伏马菌素Bz标准溶液（13C34-FBz，10uμg/mL）。10.3.6
13C34-伏马菌素Bs标准溶液（13C34-FB3，10μg/mL）。10.4标准溶液配制
10.4.1标准储备溶液（100μg/mL）：分别准确称取FB、FBz和FB各10mg（精确至0.01mg）至小烧杯中，用乙睛-水溶液（50十50)溶解，分别转移至100mL容量瓶中定容至刻度，FB1、FB2和FB3质量浓度分别为100μg/mL。于一18℃下避光保存，有效期6个月。10.4.2混合标准储备溶液：准确移取FB标准储备液1.0mL、FBz和FB3标准储备液各0.5mL至同一10mL容量瓶中，加乙睛-水溶液（50十50）稀释，定容至刻度，制成FB质量浓度为10μg/mL、FBz和FB质量浓度分别为5μg/mL的混合标准溶液。于一18℃下避光保存，有效期6个月。10.4.3混合标准工作溶液：准确移取混合标准储备溶液1.0mL至10mL容量瓶中，加乙睛-水溶液（50十50）稀释，定容至刻度，FB质量浓度为1.0μg/mL、FBz和FB质量浓度分别为0.5μg/mL的混合标准工作溶液。于4℃下避光保存，有效期6个月。10.5同位素内标溶液配制
10.5.1混合同位素标准储备溶液：准确移取13C34-FB（25ug/mL）、13C34-FBz（10μg/mL）和13C34-FB（10μg/mL）各1mL至同一10mL容量瓶中，加乙睛-水液（50十50）稀释，定容至刻度，13C34-FB质量浓度为2.5ug/mL、13C34-FBz和13C34-FB3质量浓度分别为1ug/mL，于一18℃以下避光保存，有效期6个月。
10.5.2混合同位素标准工作溶液：准确移取1.0mL混合同位素标准储备溶液至10mL容量瓶中，加6
2023新版
GB5009.240—2023
乙-水液（50十50）稀释，定容至刻度，13C34-FB250ng/mL、13C34-FB2和13C34-FB质量浓度分别为100ng/mL，于4℃下避光保存，有效期6个月。10.6混合标准系列工作溶液配制准确移取混合标准工作溶液，用乙睛-水溶液（20十80）稀释，加入混合同位素标准工作溶液，配制成FB质量浓度为20.0ng/mL、80.0ng/mL、160ng/mL、240ng/mL、320ng/mL、400ng/mL、480ng/mL，FBz和FBs质量浓度为10.0ng/mL、40.0ng/mL、80.0ng/mL、120ng/mL、160ng/mL、200ng/mL、240ng/mL的混合标准系列工作溶液，每个标准工作溶液中13C34-FBl、13C34-FBz和13C34-FB质量浓度分别为50.0ng/mL、20.0ng/mL和20.0ng/mL。临用现配。10.7材料
免疫亲和柱（柱容量及柱回收率验证方法参见附录D）。10.7.1
注：在使用前需对每个批次的亲和柱进行柱容量及柱回收率验证。10.7.2强阴离子交换固相萃取柱（6mL，500mg）。10.7.3
微孔滤膜：0.22um，有机型。
仪器和设备
高效液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子源。：天平：感量0.01g和0.01mg。
均质器：转速≥2000r/min。
振荡器（转速>1000r/min)或超声波提取仪：功率>500W。离心机：转速≥4000r/min。
氮吹仪。
12分析步骤
12.1试样制备
谷物及其制品、婴幼儿谷类辅助食品采样量不低于1kg；样品量不足1kg，取全部试样。用高速粉碎机将其粉碎，粉碎粒度应小于1mm。混合均匀后储存于洁净的容器内，密封后置于4℃下避光保存。
植物油脂采样量不低于1kg；样品量不到1kg，取全部试样。混合均匀后储存于洁净的容器内，密封后置于4℃下避光保存。
在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生伏马菌素含量的变化。12.2试样提取
12.2.1谷物及其制品、婴幼儿谷类辅助食品准确称取试样20g（精确至0.01g）于250mL三角烧瓶中，准确加入100mL乙腈-水（50十50）提取液，超声或振荡提取20min。转移20mL提取液至50mL离心管中，在4000r/min下离心5min，待净化。
12.2.2植物油脂
植物油脂提取过程同12.2.1，提取液在下层。7
GB5009.240—2023
12.3试样净化
12.3.1免疫亲和柱净化
12.3.1.1婴幼儿谷类辅助食品
2023新版
准确移取5.0mL提取液，加入200μL混合同位素标准工作溶液、45.0mL吐温-20/PBS溶液进行稀释，混合均匀后在4000r/min下离心10min，取全部上清液过免疫亲和柱，控制流速1mL/min～2mL/min，用10mLPBS缓冲液和10mL水依次淋洗免疫亲和柱，再用3mL甲醇-乙酸溶液（98十2）分3次洗脱免疫亲和柱，合并洗脱液。55℃下氮气吹干，加入1mL乙睛-水溶液（20十80）溶解残渣，涡旋30 s，过微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。12.3.1.2谷物及其制品、植物油脂准确移取0.5mL提取液，加入200uL混合同位素标准工作溶液、4.5mL吐温-20/PBS溶液进行稀释，混合均匀后在4000r/min下离心10min，取全部上清液过免疫亲和柱，控制流速1mL/min～2mL/min，用10mLPBS缓冲液和10mL水依次淋洗免疫亲和柱，再用3mL甲醇-乙酸溶液（98十2）分3次洗脱免疫亲和柱，合并洗脱液。55℃下氮气吹干，加入1mL乙睛-水溶液（20十80）溶解残渣，涡旋30s，过微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。12.3.2强阴离子交换固相萃取净化柱12.3.2.1婴幼儿谷类辅助食品
准确移取5.0mL提取液，加入200μL混合同位素标准工作溶液、15.0mL甲醇-水溶液（60十20）进行稀释，混合均匀后在4000r/min下离心10min，取全部上清液过强阴离子交换固相萃取柱（使用前依次用6.0mL甲醇和6.0mL水活化），控制流速1mL/min~2mL/min，用8mL甲醇水溶液（60+20）和3mL甲醇依次淋洗，10mL甲醇-乙酸溶液（99十1）洗脱，收集洗脱液。55℃下氮气吹干，加人1mL乙睛-水溶液（20十80）溶解残渣，涡旋30S，过微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测，12.3.2.2谷物及其制品、植物油脂准确移取0.5mL提取液，加入200μL混合同位素标准工作溶液，5.0mL甲醇-水溶液（60十20）进行稀释，混合均匀后在4000r/min下离心5min，取全部上清液过强阴离子交换固相萃取柱（使用前依次用6.0mL甲醇和6.0mL水活化），控制流速1mL/min~2mL/min，用8mL甲醇水溶液（60十20）和3mL甲醇依次淋洗，10mL甲醇-乙酸溶液（99十1）洗脱，收集洗脱液。55℃下氮气吹干，加入1mL乙睛-水溶液（20十80）溶解残渣，涡旋30S，过微孔滤膜后，收集于进样瓶中，待测。注1：由于不同厂商提供的免疫亲和柱操作程序可能不同，实际操作时，请参照厂商提供的操作说明和程序使用。注2：以上2种净化方式可选其一。12.4仪器参考条件
液相色谱参考条件
液相色谱参考条件如下：
色谱柱：C18，粒径1.7um，2.1mm×100mm，或相当者b）
流动相：A：甲酸-水溶液（0.1%）；B：乙晴-甲醇溶液（50十50）；c）
梯度洗脱，梯度见表2；
流速：0.35mL/min；
柱温：35℃；
进样量：10μL。
质谱参考条件
质谱参考条件如下：
离子化模式：ESI十；
2023新版
质谱扫描方式：MRM（多反应监测）；毛细管电压：3.0kV；
离子源温度：150℃；
锥孔反吹气流量：50L/h；
锥孔电压：30V；
脱溶剂气温度：350℃；
脱溶剂气流量：800L/h。
监测离子对信息见表3。
母离子
化合物
13Ca4-FB
13Ca-FB2
13Ca-FB3
标准曲线的制作
流动相洗脱程序
流动相A
伏马菌素FB、FB2、FB3的质谱参数定量子离子
碰撞能量
GB5009.240—2023
流动相B
定性子离子
碰撞能量
将伏马菌素混合标准系列工作液按浓度由低到高分别注人液相色谱-质谱仪中，获得相应的峰面积，以目标物质和各自内标的浓度比为横坐标，峰面积比值为纵坐标，绘制标准工作曲线。伏马菌素标9
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