本标准规定了食品中克罗诺杆菌(Cronobacterspp.)的检验方法。 本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。
本标准代替 GB4789.40—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验》。
本标准与 GB4789.40—2016相比,主要变化如下:
———修改了标准名称;
———标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品;
———增加了 PCR鉴定方法作为选做内容;
———删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的产黄色素和苦杏仁苷项目;
———修改了培养基和试剂pH 调节方法;
———修改了预热、选择性增菌温度以及 TSA 平板的培养温度和时间;
———修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。

GB4789.40-2010
中华人民共和国国家标准
GB4789.40—2024
食品安全国家标准
食品微生物学检验
2024-02-08发布
克罗诺杆菌检验
2024-08-08实施
中华人民共和国国家卫生健康委员会国家市场蓝督管理总局
本标准代替GB4789.40一2016《食品安全国家标准杆菌)检验》。
本标准与GB4789.40一2016相比，主要变化如下一修改了标准名称；
一标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品；一增加了PCR鉴定方法作为选做内容；食品微生物学检验
一删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中的产黄色素和苦杏仁苷项目；一修改了培养基和试剂pH调节方法；一修改了预热、选择性增菌温度以及TSA平板的培养温度和时间；一修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。GB4789.40—2024
克罗诺杆菌属（阪崎肠
1范围
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌检验
本标准规定了食品中克罗诺杆菌(Cronobacterspp.)的检验方法。GB4789.40—2024
本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下。2.1恒温培养箱:36℃±1℃,41.5℃±1℃。2.2冰箱:2℃~5℃，-20℃。
2.3恒温水浴箱：41.5℃±1℃。2.4天平：感量0.1g、0.01g。
2.5振荡器。
2.6无菌吸管：1mL(具0.01mL刻度）、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。2.7无菌容器：容量100mL、200mL、2000mL。2.8无菌培养皿：直径90mm。
pH计或pH比色管或精密pH试纸。2.10
微生物生化鉴定系统。
2.11 PCR仪。
2离心机：转速≥12000r/min。
凝胶成像系统或紫外检测仪。
2.14琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪。2.15
5PCR反应管。
51.5mL离心管。
10μL接种环。
3培养基和试剂
3.1缓冲蛋白陈水(bufferedpeptonewater,BPW)：见A.1。3.2改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素(modified lauryl sulfate tryptosebroth-vancomycinmedium,mLST-Vm):见A.2。
3.3克罗诺杆菌显色培养基。
3.4胰蛋白陈大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA）：见A.3。3.5生化鉴定试剂盒。
3.6氧化酶试剂：见A.4。
3.7L-赖氨酸脱羧酶培养基：见A.5。1
GB 4789.40—2024
L-鸟氨酸脱羧酶培养基见A.6。
3.9L-精氨酸双水解酶培养基：见A.7。3.10
糖类发酵培养基：见A.8。
西蒙氏柠檬酸盐培养基：见A.9。内转录间隔区(its)PCR引物见表1,基因扩增靶标参考序列见附录B。5U/μL耐热DNA聚合酶。
2.5mmol/dNTPs:dATP、dTTP、dCTP、dGTP。25mmol/L MgCl2 。
10×PCR缓冲液：见A.10。
克罗诺杆菌质控菌株：具有菌种保藏资质单位提供的ATCC29544或等效菌株。大肠埃希氏菌质控菌株：具有菌种保藏资质单位提供的ATCC25922或等效菌株。DNA提取试剂:细菌基因组DNA提取试剂盒。商品化PCR反应预混液。
标准(高熔点)琼脂糖：分析纯。核酸染色剂。
分子质量标准：100bpDNAladder。50×TAE电泳缓冲液：见A.11。
6×DNA加样缓冲液：见A.12。
克罗诺杆菌定性检验
第一法
检验程序
克罗诺杆菌检验程序见图1。
5操作步骤
检样100g(mL)
+BPW络养基900mL
36.℃±1℃，18h±2h
前增菌液1mL+mLST-Vm10mlL
41.5C±1C,24h±2h
克罗诺杆菌显色培养基
36c±1,24h±2h
挑取可聚菌落
36c±iC.24h±2h
挑取可疑菌落
生化鉴定
克罗诺杆菌检验程序
5.1前增菌和选择性增菌
PCR鉴定（选做）
GB4789.40—2024
取检样100g（mL)置于无菌容器中，加入900mL已预热至41℃±1℃的BPW，用手缓缓地摇动至检样充分溶解后，36℃±1℃培养18h±2h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液，移取1mL转入10mLmLST-Vm肉汤中，41.5℃±1℃培养24h±2h。5.2分离
5.2.1轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，使用10μL接种环各取1环增菌培养物，分别划线接种于2个克罗诺杆菌显色培养基平板，36℃±1℃培养24h±2h，或按培养基要求条件培养。5.2.2可疑菌落按显色培养基要求进行判定，每个平板挑取至少5个可疑菌落(不足5个时挑取全部可疑菌落），分别划线接种于TSA平板，36℃±1℃培养24h±2h。5.3PCR鉴定（选做）
PCR试验环境条件和过程控制参照GB/T27403规定执行。3
GB4789.40—2024
DNA模板制备
可采用热裂解法制备模板，从每个TSA平板上挑取2个~3个克罗诺杆菌可疑菌落至500μL灭菌去离子水中，充分混匀后100℃加热10min，冰浴冷却至室温，12000r/min离心10min,取上清液作为DNA模板用于PCR鉴定。若上清液不能及时分析则于-20℃保存备用(1周以内）。注：也可用等效商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒或全自动核酸提取仪按操作要求提取DNA模板。5.3.2
PCR扩增
PCR鉴定用引物信息见表1。
表1克罗诺杆菌鉴定用内转录间隔(its)PCR引物序列目的基因
内转录间隔区(its)
PCR反应体系
引物序列
上游引物F:5'-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3下游引物R:5'-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3'PCR反应体系组成见表2。
灭菌去离子水
10×PCR缓冲液
25mmol/LMgCl2
2.5mmol/LdNTP
上游引物(10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
DNA模板
5U/μL耐热DNA聚合酶
总体积
克罗诺杆菌鉴定用PCR检测反应体系组成反应体积/μL
注：也可用商品化PCR反应预混液按要求制备反应体系片段长度/bp
终浓度
2.5mmol/L
0.2mmol/L
0.4μmol/L
0.4μmol/L
0.05U/μL
5.3.2.3反应条件：94℃预变性5min;94℃变性30s,61℃退火30s,72℃延伸30s,35个循环；72℃延伸5min，4℃下保存。
3对照设置
每次PCR鉴定时使用克罗诺杆菌标准菌株DNA模板作为阳性对照，大肠埃希氏菌标准菌株DNA模板作为阴性对照，提取过程设置灭菌去离子水作为DNA提取空白对照，PCR反应需另设灭菌去离子水作为PCR反应体系空白对照。5.3.4电泳
GB4789.40—2024
用1×TAE电泳缓冲液制备含核酸染色剂的1.5%琼脂糖电泳凝胶（核酸染色剂按照说明书要求使用）。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将适量PCR扩增产物与6×加样缓冲液混合后点样，其中第1孔加入100bpDNAladder。电压的设置根据公式一电泳槽正负极的距离（cm）×5V/cm计算并设置，电泳时间为20min~30min。使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。也可采用毛细管电泳仪等设备进行电泳。5.3.5PCR鉴定结果判定
质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小(282bp,序列信息见附录B)的扩增条带，则检测系统正常。任一种对照出现非上述正常结果，应重做试验，同时排除干扰因素。
阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小(282bp)的扩增条带，判定PCR结果为阳性。
阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小(282bp)的扩增条带，判定PCR结果为阴性。
5.4确证试验
选做5.3时，自PCR结果阳性的TSA平板上挑取菌落进行生化鉴定，PCR结果阴性的TSA平板不再进行生化鉴定。
未选做5.3时，直接将5.2.2的可疑菌落接种TSA平板后进行生化鉴定。可以首先鉴定克罗诺杆菌显色培养基平板上最具特征性的菌落接种的TSA平板上的菌落。如果是阳性，则不需要测试其他TSA平板上的菌落。如果是阴性，则选取其他TSA平板上的菌落进行鉴定，直到全部为阴性或发现阳性菌落为止。为确保结果的准确性，对TSA平板上的菌落进行鉴定时，应使用新鲜的传代菌落。克罗诺杆菌的主要生化特征见表3。上述鉴定也可选择商品化生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行。
表3克罗诺杆菌的主要生化特征
生化试验
氧化酶
L-赖氨酸脱羧酶
L-鸟氨酸脱羧酶
L-精氨酸双水解酶
柠檬酸水解
D-山梨醇
L-鼠李糖
D-蔗糖
D-蜜二糖
注：+>99%阳性；->99%阴性；（+)90%~99%阳性；（-)90%~99%阴性。特征
GB4789.40—2024
结果与报告
根据菌落特征、确证试验(生化鉴定)和/或PCR鉴定结果,报告100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌。
第二法
7操作步骤
7.1样品的稀释
克罗诺杆菌定量检验
取检样100g（mL）、10g(mL)、1g(mL)各3份，分别置无菌容器中，分别加入900mL、90mL9mL已预热至41℃±1℃的BPW，用手缓缓地摇动至检样充分溶解，制成1：10样品匀液，36℃±1℃培养18h±2h。轻轻摇动混匀培养过的前增菌液，分别移取1mL转入10mLmLST-Vm肉汤，41.5℃±1℃培养24h±2h。
2分离、鉴定
同5.2、5.3和5.4。
结果与报告
综合菌落特征、确证试验(生化鉴定)或PCR鉴定结果，根据检出克罗诺杆菌的阳性管数，查MPN检索表，报告100g(mL)样品中克罗诺杆菌的MPN值(见附录C中表C.1）。6
附录A
培养基和试剂
缓冲蛋白陈水（bufferedpeptonewater,BPW)A.1.1成分
蛋白陈
氯化钠
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)
磷酸二氢钾
蒸馏水
1000ml
GB4789.40—2024
加热搅拌至溶解，必要时调节pH,121℃高压灭菌15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为7.2±0.2。
改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmeA.2
dium,mLST-Vm)
改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈(mLST)肉汤A.2.1
A.2.1.1成分
氯化钠
胰蛋白陈
磷酸二氢钾
磷酸氢二钾
十二烷基硫酸钠
蒸馏水
1000mL
加热搅拌至溶解，必要时调节pH。分装至无菌试管中，每管10mL,121℃高压灭菌15min。灭菌后培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。万古霉素溶液
1成分
万古霉素
蒸馏水
2制法
10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水中，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃~55℃保存
15d。
GB4789.40—2024
A.2.3改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤-万古霉素（modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycinmedium,mLST-Vm)
每10mLmLST加入万古霉素溶液0.1mL混合液中万古霉素的终浓度为10μg/mL。注：mLST-Vm需在24h之内使用。A.3胰蛋白陈大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA)A.3.1成分
胰蛋白陈
植物蛋白陈
氯化钠
蒸馏水
A.3.2制法
1000mL
加热搅拌至溶解，必要时调节pH,121℃高压15min,灭菌后的培养基25℃时的pH应为7.3±0.2。A.4氧化酶试剂
A.4.1成分
N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐蒸馏水
A.4.2制法
少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。A.4.3试验方法
用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在用氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶试验阳性。注：实验中切勿使用镍/铬材料。A.5L-赖氨酸脱羧酶培养基
A.5.1成分
L-赖氨酸盐酸盐（L-lysinemonohydrochloride）酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫wwW.bzxz.Net
蒸馏水
2制法
1000ml
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL,上面滴加一层液体石蜡，121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。8
A.5.3试验方法
GB4789.40—2024
挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基液面下。36℃±1℃培养24h±2h,观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色，阴性者为黄色,空白对照管为紫色。A.6L-鸟氨酸脱羧酶培养基
A.6.1成分
L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithinemonohydrochloride)酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
蒸馏水
A.6.2制法
1000ml
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL,上面滴加一层液体石蜡，121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。A.6.3试验方法
挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基液面下。36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色,空白对照管为紫色。A.7L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1成分
L-精氨酸盐酸盐（L-argininemonohydrochloride）酵母浸膏
葡萄糖
溴甲酚紫
蒸馏水
A.7.2制法
1000ml
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL,上面滴加一层液体石蜡，121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。A.7.3试验方法
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基液面下。36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色，阴性者为黄色,空白对照管为紫色。A.8糖类发酵培养基
A.8.1基础培养基
A.8.1.1成分
酪蛋白(酶消化)
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