本标准规定了哺乳动物骨髓染色体畸变试验的基本技术要求。本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素对大、小鼠骨髓细胞细胞的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂(含营养化剂)、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。 GB 15193.6-2003 骨髓细胞染色体畸变试验 GB15193.6-2003 标准下载解压密码：www.bzxz.net

ICS 07.100
中华人民共和国国家标准
GB15193.6—2003
代替GB15193.6—1994
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验Mammalian bone marrow cell chromosomeaberration test
2003-09-24发布
中华人民共和国卫生部
中国国家标准化管理委员会
2004-05-01实施
GB15193.6—2003
本标准全文强制。
本标准代替GB15193.6-1994《骨髓细胞染色体畸变试验》。本标准与GB15193.6—1994相比的主要修改如下：将标准名称“骨髓细胞染色体畸变试验”改为“哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验”；在“范围”中增加了受试物的具体内容：食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等；增加不适用范围；将原操作步骤中“5.1动物处理\标题下的有关内容分列为“试验动物”“剂量及分组”和“操作步骤”三章；
一增加章题“试验动物”，将“取健康成年大、小鼠”改为“常用健康年轻的成年大鼠或小鼠”；-增加章题“剂量及分组”，并将高剂量组的设计方法增加一条“急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）求不出I.Dss时，高剂量组则按以下顺序：a）10g/kg体重；b）人的可能摄人量的100倍；或c）一次最大灌胃剂量进行设计，增加参考阳性对照物“丝裂霉素C(1.5mg/kg体重～2.0mg/kg体重），或环磷酰胺（40mg/kg体重）；-将原“5.1.2\剂量设计以外的内容放在增加的“操作步骤”标题下，并在此标题下增加受试物配制”的有关内容；
增加结果判定”内容。
自本标准实施之日起，GB15193.6—1994同时废止，本标准由中华大民共和卫生部提出并归口。本标准起草单位：中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、哈尔滨医科大学、杭州市卫生防疫站。
本标准主要起草人：韩驰、唐玲光、袁振华。本标准于1994年首次发布，本次为第一次修订。50
1范围
哺乳动物骨髓细胞染色体畸变试验本标推规定了哺乳动物骨髓染色体畸变试验的基本技术要求GB15193.6——2003
本标准适用于评价食品生产、加工、保藏、运输和销售过程中所涉及的可能对健康造成危害的化学、生物和物理因素对大、小鼠骨髓细胞的遗传毒性，检验对象包括食品添加剂（含营养强化剂）、食品新资源及其成分、新资源食品、辐照食品、食品容器与包装材料、食品工具、设备、洗涤剂、消毒剂、农药残留、兽药残留、食品工业用微生物等。本标准不适用于有证据表明受试物或反应代谢产物达不到靶组织（target tissue)一一骨髓的情况，2原理
染色体是细胞核中具有特殊结构和遗传功能的小体，当化学物质作用于细胞周期G1期和S期时，诱发染色体型畸变，而作用于G2期时则诱发染色体单体型畸变。给试验的大、小鼠腹腔注人秋水仙素，抑制细胞分裂时纺锤体的形成，以便增加中期分裂相细胞的比例，并使染色体丝缩短、分散，轮廓清晰。在显微镜下观察染色体数目和形态。3仪器与试剂
全部试剂除注明外均为分析纯，试验用水为蒸馏水。3.10.1%秋水仙素：置于棕色瓶中，冰箱保存。3.22.2%柠檬酸钠。
3.3pH7.4磷酸盐缓冲液。
3.3.11/15mol/L磷酸氢二钠溶液：磷酸氢二钠（NaHPO.)9.47g溶于1000mL蒸馏水中。3.3.21/15mol/L磷酸二氢钾溶液：磷酸二.氢钾（KHzPO)49.07g溶于1000mL蒸馏水中。3.3.3将磷酸氢二钠溶液80ml.与磷酸二氢钾溶液20mL混合，用pH计测定并调节pH至7.4。3.40. 075 ol/L 氯化钾溶液。
3.5甲醇（分析纯）：冰乙酸（分析纯)以3：1混合，临用时现配。3.6Giemsa 溶液。
3.6.1Giemsa储备液：取Giemsa染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨，逐渐加甲醇至375mi。溶解后再加125mL纯甘油，于37℃溢箱保温48h.在此期间摇动数次，放置1周~2周过滤备用。3.6.2Giemsa应用液：取1mL储备液加人10mLpH7.4磷酸缓冲液。3.7仪器与设备：实验室常用设备、恒温水浴锅（37℃士5℃）、离心机、生物显微镜4实验动物
常用健康年轻的成年大鼠或小鼠。每组用两种性别的动物至少各5只。动物购买后适应环境至少3天。
5剂量及分组
受试物应设三个剂量组，最高剂量组原则上为动物出现严重中毒表现和/或个别动物出现死亡的剂量，一般可取1/2 LDso,低剂量组应不表现出性，分别取1/4和1/8 LDs作为中、低剂量。急性毒性试验给予受试物最大剂量（最大使用浓度和最大灌胃容量）动物无死亡而求不出LDso时，高剂量组则按以51
GB 15193.6—2003
下顺序：a）10g/kg体重；b）人的可能摄人量的100倍；或c）一次最大灌胃剂量进行设计，再下设中、低剂量组。另设溶剂对照组和阳性对照组，阳性物可用丝裂霉素C(1.5mg/kg体重～2.0mg/kg体重）或环磷酰胺（40 mg/kg体重）经口或腹腔注射（首选经口）给予。6操作步骤
6.1受试物配制
一般用蒸馏水作溶剂，如受试物不溶于水，可用食用油、医用淀粉、羧甲基纤维素配成乳浊液或悬浊液。受试物应于灌胃前新鲜配制，除非有资料表明以溶液（或悬浊液、乳浊液等)保存具有稳定性。6.2实验动物的处理
经口给予受试物2次～4次，每次间隔24h，在未次给受试物后18h～24h取材。必要时可先用一个剂量的3只动物，于给受试物后6、24、48h分别处死动物取材，以选择处死动物的最适时间。在一次给受试物时也可每个剂量组用15只动物，于6、24、48h后分别各处死5只动物取材。处死动物前2h～4h，按4mg/kg体重腹腔注人秋水仙素。大鼠断头处死，小鼠颈椎脱白。6.3标本制备
6.3.1取材
取股骨，去附着的肌肉，剪去两端骨,用带针头的注射器吸取2mL～4mL2.2%柠檬酸钠溶液，将骨髓洗人10 mL离心管中，反复冲洗数次直至股骨断面由红色变粉色，然后以1000 r/min~1500r/min离心10min，弃去上清液。6.3.2制片
离心后的沉淀物加入4mL0.075mol/L氯化钾溶液，混匀后在37℃水浴或恒温箱中放置10min～20min，再以1000r/min1500r/min离心，弃去上清液。将新配制的甲醇-冰乙酸固定液4 mL沿管壁加入受试物中，10 min～15 min 后，用吸管将细胞团块打碎继续固定10min～15min，以1000r/min离心10min弃去上清液，再加固定液4mL静置20min后离心，弃去上清液，用吸管混匀制成0.5ml～l.0mL细胞悬液。先将洗净的载玻片保存于冰水中备用。自冰水中取出载玻片，倾斜30℃放置，立即吸取细胞悬液在玻片的1/3处滴3滴，轻吹细胞悬液扩散平铺于玻片上。每个标本制2张～3张玻片，空气中自然干燥。
临用时取Giemsa储备液1mL，磷酸盐缓冲液10mL，置染色缸中，将涂片浸于染液中染色15min左右，取出玻片用水冲洗，空气中自然干燥。6.4阅片
6.4.1阅片要求
在低倍镜下检查制片质量，制片应为全部染色体较集中，而各个染色体分散、互不重叠、长短收缩适中、两条单体分开、清楚地显示出着丝点位置、染色体呈红紫色。用油镜进行细胞中期染色体分析。每只动物分析100个中期相细胞，每个剂量组不少于1000个中期相细胞。6.4.2观察项目bzxz.net
6.4.2.1染色体数目的改变
6.4.2.1.1非整倍体：亚二倍体或超二倍体。6.4.2.1.2多倍体：染色体成倍增加。6.4.2.1.3内复制：包膜内的特殊形式的多倍化现象。6.4.2.2染色体结构的改变
6.4.2.2.1断裂：损伤长度大于染色体的宽度。6.4.2.2.2微小体：较断片小而呈圆形。6.4.2.2.3有着丝点环：带有着丝点部分，两端形成环状结构并伴有一双无着丝点断片。52
6.4.2.2.4无着丝点环：成环状结构。5单体互换：形成三辐体、四辐体或多种形状的图像。6. 4.2. 2. 5
5双微小体：成对的染色质小体。6. 4. 2. 2. 6
裂隙：损伤的长度小于染色单体的宽度。6. 4. 2. 2. 7
6. 4. 2. 2. 8
非特定性型变化：如粉碎化、着丝点细长化、粘着等。数据处理
统计学处理用X2检验。
结果判定
GB15193.6—2003
试验组与对照组相比，试验结果染色体畸变率有明显的剂量反应关系并有统计学意义时，即可确认为阳性结果。若统计学上差异有显著性，但无剂量反应关系时，则应进行重复试验。结果能重复者可确定为阳性。
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