GB/T 43650-2024
基本信息
标准号:
GB/T 43650-2024
中文名称:野生动物及其制品DNA物种鉴定技术规程
标准类别:国家标准(GB)
英文名称:Technical procedures for DNA species identification of wild animals and their products
标准状态:现行
发布日期:2024-03-15
实施日期:2024-07-01
出版语种:简体中文
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下载大小:4921401
相关标签:
野生动物
制品
DNA
物种
鉴定
技术规程
标准分类号
标准ICS号:农业>>农业和林业>>65.020.01农业和林业综合
中标分类号:农业、林业>>林业>>B60林业基础标准与通用方法
关联标准
出版信息
出版社:中国标准出版社
页数:28页
标准价格:49.0
相关单位信息
起草人:白素英、马跃、王震、李波、张伟、孙磊、徐艳春、张利峰、王剑、刘微、杨天天、兰天明、李晓平、危金普、郭小森、李宁、金煜、张宇、孙红瑜、马云龙、金香香、刘闯、刘昌景、胡诗佳、李云飞、张新成、唐闳凯
起草单位:东北林业大学、东北林业大学司法鉴定所、深圳华大生命科学研究院、中国海关科学技术研究中心、黑龙江省公安厅、哈尔滨检验检测认证集团有限公司、深圳华大法医科技有限公司、广东华大法医物证司法鉴定所、黑龙江省野生动物研究所、华南动物物种环境损害司法鉴定中心等
归口单位:全国野生动物保护管理与经营利用标准化技术委员会(SAC/TC 369)
提出单位:国家林业和草原局
发布部门:国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会
标准简介
本文件规定了对野生动物及其制品的来源进行DNA物种鉴定时样品采集与储存、DNA鉴定程序的构成、DNA鉴定程序、结果表述、追溯方法、污染预防与处理、实验室区域设置等主要技术要求。
本文件适用于野生动物及其制品来源物种的DNA检验鉴定。
标准内容
ICS65.020.01
CCS B 60
中华人民共和国国家标准
GB/T436502024
野生动物及其制品DNA物种鉴定
技术规程
Technical procedures for DNA species identification of wild animals andtheirproducts
2024-03-15发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2024-07-01实施
1范围
2规范性引用文件
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
3.2缩略语
4样品采集与储存
4.1样品采集
4.2抽样
取样与储存
5DNA鉴定程序的构成
DNA鉴定程序.www.bzxz.net
样品前处理
DNA提取
DNA纯化
DNA质量评估
检测方法
结果表述,
追溯方法
污染预防与处理
实验室区域设置
仪器和试剂要求
实验室清洁
安全防护
废弃物处理
附录A(资料性)电泳检测程序
常规电泳检测法
A.2芯片电泳检测法
A.3其他电泳检测法
附录B(资料性)通用引物序列信息B.1Cytb基因通用引物
B.2COI基因通用引物
GB/T 43650—2024
GB/T43650—2024
12SrRNA
B.4 16S rRNA
基因通用引物
基因通用引物,
附录C(资料性)通用引物PCR反应体系与反应程序c.1
反应体系
反应程序
附录D(资料性)特异性PCR的引物、反应程序与反应体系c.1
高鼻羚羊(Saigatatarica)特异引物C.2雪豹(Pantherauncia)特异引物C.3豹(Pantherapardus)特异引物C.4虎(Panthera tigris )特异引物C.5黑熊(Ursusthibetanus)特异引物附录E(资料性)qPCR反应体系与反应程序E.1反应体系
反应程序,
附录F(资料性)dPCR反应体系与反应程序F.1
反应体系.
反应程序
参考文献
本文件按照GB/T
起草。
GB/T43650—2024
1.1-2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由国家林业和草原局提出。本文件由全国野生动物保护管理与经营利用标准化技术委员会(SAC/TC369)归口。本文件起草单位:东北林业大学、东北林业大学司法鉴定所、深圳华太生命科学研究院、中国海关科学技术研究中心、黑龙江省公安厅哈尔滨检验检测认证集团有限公司、深圳华大法医科技有限公司、广东华大法医物证司法鉴定所、黑龙江省野生动物研究所、华南动物物种环境损害司法鉴定中心、南宁海关技术中心、南京警察学院、合肥海关技术中心、广西壮族自治区公安厅、东营市公安局。本文件主要起草人,白素英、马跃、王震、李波、张伟、孙磊、徐艳春、张利峰、王剑刘微.杨天天、兰天明、李晓平、危金、郭小森、李宁金煜。张宇、孙红瑜,马云龙,金香香、刘闯、刘昌景、胡请佳、云飞、张新成、唐闳凯。
1范围
野生动物及其制品DNA物种鉴定
技术规程
GB/T 43650—2024
本文件规定了对野生动物及其制品的米源进行DNA物种鉴定时样品采集与储存、DNA鉴定程序的构成、DNA鉴定程序、结果表述、追溯方法、污染预防与处理、实验室区域设置等主要技术要求,本文件适用于野生动物及其制品来源物种的DNA检验鉴定2规范性引用文件
下列文件的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件:不组日期的引文件、其最新版本(包括所有的修收单)适用于本文件。
GB194s9实验室生物安个要
GB/T19495.2转基因品险实验术要求绿立溶个漫番产品
个凌蒂糍酸噜的机度和指纯南则紫光光度法GB3739图永
GA/T383法庭科学DAA实验空检验规LY/T2501野生动物及品的防中鉴定规范NY/T51-216
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
兽医诊期样品采集保存导喻技术观范下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
DNA条形码DNAbarcode
选定的标准区域的、用于物种鉴定的一段相对较短的保守DNA片段3.1.2
DNA物种鉴定DNA speciesidentification利用DNA检验技术对野生动物及其制品进行分类地位(科、属、种)的判定。3.1.3
序列比对alignment
利用计算机算法和程序,确定两个或多个核苷酸序列的相似性以至于同源性。3.1.4
引物primers
人工合成的两段互补寡核苷酸片段,一段与靶区域5'端DNA模板链互补;另一段与靶区域3'端DNA模板链互补。
GB/T 43650—2024
荧光探针fluorescentprobe
5'端和3'端分别标记荧光基团和淬灭基团,并与日的DNA序列碱基互补的一段DNA片段。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BOLD:生命条形码数据系统(barcode of life data system)Ct值:循环阈值(cyclethreshold,或Cq值)Cytb:细胞色素b(cytochromeb)
dPCR:数字PCR(digital PCR)
PCR:聚合酶链式反应(polymerasechainreaction)qPCR:实时荧光定量PCR(real-timefluorescencequantitativePCR)RFLP:限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism)4样品采集与储存
4.1样品采集
4.1.1样品分成两等份,作为检样和储存样。4.1.2规范标记编号,记录采集时问、地点、类型等内容,保证样品可追溯。4.1.3样品分别采集、分别包装,注意工具清洁或消毒,防止交叉污染。4.2抽样
4.2.1形态特征完整、可分类识别的同类多个检材,按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行。
4.2.2具有部分形态特征、可简单分类的多个检材,先分类,再按照GB/乙31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行;或按照GB/Z31233中的分层抽样规定执行。4.2.3不具有可识别的形态特征的大批量检材,先按照GB/Z31233中的简单随机抽样或等距抽样规定执行,结果出现多个物种时,再按照GB/Z31233中的分层抽样规定执行。物种的个体数量可按鉴定结果所占比例核算。
4.3取样与储存
4.3.1整体
昆虫等小型无脊椎动物可整体取样,取适量或整体粉碎,收集到离心管或密封袋等储存介质中,干燥常温、冷藏或-20℃保存。
4.3.2组织和内脏
应先去除易污染的表层,宜采取新鲜洁净的组织或内脏5mm3以上,收集到离心管或密封袋等储存介质中,冷藏暂存,宜尽快在一20℃以下保存4.3.3皮张与蛇蜕等
取1cm以上收集到离心管或密封袋等储存介质中,干燥常温、冷藏或-20℃保存。2
4.3.4骨骼与牙齿
GB/T43650—2024
整体送检或清洗后取不少于0.2g骨粉或牙粉(组织残留时宜取组织),收集到离心管或密封袋等储存介质中,干燥常温、冷藏或-20℃保存。4.3.5皮肤衍生物
4351角、喙、爪、鳞、龟甲等
整体送检或清洗后取不少于0.2g粉末等收集到离心管或密封袋等储存介质中,干燥常温、冷藏或-20℃保存。
4.3.5.2毛、羽等
收集1根以上置于离心管或密封袋等储存介质中,干燥常温、冷藏或-20℃保存。注:皮肤衍生物是指由皮肤衍生而成的特殊器官,如毛、羽、喙、爪、蹄、角、鳞、鳍、盾片、骨板、龟甲等。4.3.6血液(血痕)
宜选新鲜全血采集于EDTA抗凝管或采血卡。血痕宜用采样拭子等采集。抗凝管和采样拭子等冷藏或-20℃保存;采血卡晾干,常温、冷藏或-20℃保存。4.3.7尿液
用清洁容器或密封袋等收集1mL~5mL,密封,冷藏或-20℃保存。4.3.8粪便
用消毒的镊子或勺等取整颗或在表层和内层各取不低于0.2g,收集到离心管或密封袋等储存介质中,可加干燥剂或保存液,常温、冷藏或-20℃保存。4.3.9分泌物
睡液等用消毒的纱布、棉花或拭子等采集,晾干密封常温保存;或者直接密封,冷藏或-20℃保存;收集足量其他分泌物到离心管或密封袋等储存介质中,冷藏保存,宜尽快于-20℃保存。注:分泌物是指由腺体和组织器官分泌的物质。4.4运输
4.4.1样品宜尽快送检。干燥样品常温运输,鲜软组织等易腐败的样品应冷藏(特殊时干冰冷冻)运输。
4.4.2每个样品应分别包装,在样本袋或容器外标记清楚,再将各样品放到统一包装袋或盒中。4.4.3抗凝管等玻璃容器,放入盒内,加垫缓冲材料固定,防止晃动、破裂。4.4.4包装应防水、防漏、密封性良好。4.4.5疑似疫病(如禽流感等)动物样品,应先消毒处理后,包装按照NY/T541一2016中7.2的规定执行。
GB/T43650—2024
5DNA鉴定程序的构成
DNA鉴定程序包括5个操作步骤,检材无形态鉴别特征时,有4大类方法可选;检材具有部分形态鉴别特征或理化鉴别指标等时,可与之结合进行综合判断,程序流程图如图1所示。1.样品前处理(见6.1),
2.DNA提取(见6.2)
3.DNA纯化(见6.3)
4.DNA质量评估(见6.4)
无形态鉴别特征
5.检测方法(见6.5)
5.1PCR法(见6.5.1)
5.2等温扩增法(见6.5.2)
5.3基因组测序法(见6.5.3)
5.4其他DNA方法(见6.5.4)
具有部分形态鉴别特征等
5.5综合判断(见6.5.5)
图1DNA鉴定程序流程图
DNA鉴定程序
6.1样品前处理
6.1.1骨、角等
用75%乙醇或去离子水等清洗表面2次~3次,粉碎(必要时脱钙)处理。6.1.2皮张、蛇蜕等
新鲜皮张等去除表层,剪碎或研磨。干燥皮张等应先用75%乙醇或去离子水等清洗2次~3次,缓冲液浸泡去除表层,再剪碎或研磨。6.1.3肌肉等组织
新鲜干净组织直接剪碎或研磨。干燥组织应先用缓冲液浸泡、去除表层,再剪碎或研磨。4
6.1.4毛、羽等
用75%乙醇、去离子水等充分清洗、剪碎。6.2DNA提取
6.2.1提取要求
GB/T 436502024
依据检材类型和DNA物种鉴定日标,确定DNA提取方法,应设置空白对照并严防交叉污染。6.2.2苯酚氯仿提取法
适用于组织、血液等样品量充足的检材,按照GA/T383的相关规定执行。6.2.3盐析提取法
适用于组织、血液等样品量充足,且需要大片段DNA进行全基因组测序的检材。6.2.4吸附柱试剂盒
适用于组织、血液等样品量充足的检材,毛、羽等微量检材以及粪便等检材,应严格按照说明书操作。
6.2.5磁珠法试剂盒
适用于毛、羽等微量检材以及粪便等检材,应严格按照说明书操作。6.2.6全自动工作站法
适用于大批量样品,应严格按照仪器说明书操作。6.2.7其他提取方法
使用等效DNA提取试剂盒,或验证的新方法。6.3DNA纯化
可选择高质量纯化试剂盒或同行验证的纯化方法,6.4DNA质量评估
6.4.1分光光度法
按照GB/T34796方法,测定DNA浓度,并判定DNA纯度。6.4.2电泳法
评估DNA片段大小,判断DNA完整性(见附录A)。6.4.3qPCR法
检测样品日标基因的Ct值,分析DNA含量。6.4.4荧光计法
检测与DNA结合荧光染料的荧光强度,定量日标DNA的浓度GB/T43650—2024
6.5检测方法
6.5.1 PCR法
6.5.1.1通用引物测序法
6.5.1.1.1设置对照
应严格设置阴性对照(不加DNA的空白对照)与阳性对照(已知物种的DNA样品,必要时)。6.5.1.1.2扩增与测序
确定日标区域(如DNA条形码、Cytb基因等),选择通用引物(见附录B),按照反应体系和反应程序(见附录C)进行PCR扩增,电泳检测见附录A,有扩增产物且与预期大小一致,则纯化(按纯化试剂盒操作)或直接测序(混合样品克隆测序)。如无扩增产物,分析原因重新试验。6.5.1.1.3序列分析
使用BLAST或CLUSTAL等软件,将测序所得有效DNA序列与候选物种的标准序列进行序列比对,得到序列一致性结果;或在数据库中进行序列比对,选取一致性最高的序列及其他近缘物种的同源序列,构建系统进化树。
注:多个数据库综合比对,包括但不限于白建标准数据库、国家动物核酸数据库以及各专项数据库、国际的BOLD和GenBank数据库等.注意甄别其数据的正确性。6.5.1.1.4结果判定
具体结果判定如下:
a)与单一物种一致性最高,且≥99%,判定与已知物种一致,判定该检材“来源于×××(物种)”或“检出×××(物种)DNA成分”;b)与两个及以上物种一致性最高,且≥99%,应加测基因,或判定该检材“来源于×××(物种)或×××(物种)...”或“检出×××(物种)或×××(物种)DNA成分”;c)与单一物种一致性最高,且在90%~99%之问,应加测基因,如仍未达到99%,应谨慎判定;或进化树中,位于同一单系分支且置信值达80%以上的物种即为检材所属物种,判定该检材d)
“来源于×××(物种)”或“检出×××(物种)DNA成分”;因为检材质量原因,未获得有效DNA,或缺乏比对的标准序列,判定“无法判定”或“无法确定e)
具体物种”。
6.5.1.2特异引物扩增法
6.5.1.2.1设置对照
应严格设置阳性对照(已知物种的DNA样品,即检材疑似物种的DNA样品)和阴性对照(近缘物种的DNA和以无菌去离子水代替DNA模板的空白对照)。6.5.1.2.2特异扩增
选择日标区域(如DNA条形码、Cytb基因等),并选择根据物种特异位点设计的物种特异性引物,确定反应体系和反应程序(见附录D),进行PCR扩增,扩增产物进行电泳检测(见附录A)。6.5.1.2.3结果判定
具体结果判定如下:
GB/T 43650—2024
a)检材与阳性对照有扩增产物,产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大小一致,且阴性对照无扩增产物,则表示结果阳性,判定该检材“来源于×××(物种)”或“检出×××(物种)DNA成分”。若存在疑问可测序验证。b)
阳性对照有扩增产物,且产物的大小与DNA分子量标准比对时与预期大小一致,检材和阴性对照均无扩增产物;或者检材扩增产物与预期大小不一致,则表示结果阴性,判定为“未检出×××(物种)DNA成分”。阴性结果谨慎判别,可更换方法验证。检材、阳性对照和阴性对照均有扩增产物且产物的大小与DNA分子量标准比对时,与预期大c)
小一致,则表示试验污染,应分析原因,重新试验。检材、阳性对照和阴性对照均无扩增产物,表示扩增失败,应分析原因,重新试验d)因为检材质量原因无法获得有效DNA,判定“无法判定”或“无法确定具体物种”。qPCR探针法
6.5.1.3.1设置对照
应严格设置刷性对照(已知物种的DNA样品,即检材疑似物种的DNA样品》、阴性对照(非疑似物种的DNA)和宣白对照(提取时设置的提取空自对照和以无菌去离子水代攀DNA莫板前PCR空白对照)。
6.5.1.3.2qPCR扩增
根据选择的自标区域(
形码、基因等择物种特异性引物和荧光探针确定反应体系和反应程序(见附录F,进行PCR扩增6.5.1.3.3结果分析
PCR皮应结束后,应设需无效基我面一其线范围选择在于个个循环,如果有强阳性样本,应根据实际情况调整基线范围。阅佰设留原画陕虑线丽好船过正需空自对照扩增曲线无规则的噪声线)的最高点。且C值不出现任何数值为准以下条件有一条不满足时,试验视为无效,应重做qPCR扩增:a)提取空白对照无特导性扩增曲线:PCR空白对照无特异性扩增曲线:b)
阴性对照无特异性扩增曲线;
阳性对照Ct值<35。
6.5.1.3.4结果判断
具体结果判定如下。
待测样品DNA物种特异性扩增的Ct值<35并有明显扩增曲线,阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常(含内参基因时,检测结果也为阳性),判定该样品“检出×××(物种)DNA成分”或“来源于×××(物种)”。若存在疑问可测序验证。待测样品DNA物种特异性扩增的Ct值>40,阳性对照、阴性对照和空白对照扩增正常(含内b)
参基因时,检测结果也为阳性),判定该样品“未检出×××(物种)DNA成分”。阴性结果谨慎判别,可更换方法验证。
待测样品DNA成分的物种特异性扩增的Ct值介于35~40之间,阳性对照、阴性对照和空白c)
对照扩增正常(含内参基因时,检测结果也为阳性),可加倍DNA模板量,重复试验,如果Ct值减小并拥有明显扩增曲线,阳性对照、阴性对照和空白对照依然扩增正常(含内参基因时,检7
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