本文件规定了空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法的试验条件、试验步骤、质量控制及鉴定。本文件适用于空气中细菌、真菌、病毒等病原微生物的宏基因组测序鉴定及监测。

ICS07.080
CCS A 40
中华人民共和国国家标准
GB/T43628—2023
空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法Method for identification of airborne pathogenic microorganism based onmetagenomics sequencing
2023-12-28 发布
国家市场监督管理总局
国家标准花管理委员会
2024-07-01实施
规范性引用文件
术语和定义
缩略语
仪器设备
试验步骤
质量控制
空气病原微生物鉴定
附录A（资料性）
附录B（资料性）
附录C（资料性）
附录D(资料性)
参考文献
核酸提取方法
测序流程
参考基因组数据库和病原微生物选取鼠疫杆菌及SARS病毒测序数据比对分析示例·GB/T43628—2023
GB/T43628—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位：中国计量科学研究院、深圳华大生命科学研究院、中国测试技术研究院生物研究所、北京慧荣和科技有限公司、南京市计量监督检测院。本文件主要起草人：王晶、裴娜、李曼莉、傅博强、周李华、李俊桦、张永卓、梁天柱、郑劲林、叶德萍、朱蕊。
CB/T 43628—2023
日常环境、公共场所、医疗卫生环境以及生物安全实验室的空气中病原微生物的检测与健康安全环境保护密切相关。病原微生物可通过生物气溶胶在空气中传播从面引起传染病的流行。空气中病原微生物的准确鉴别，对于传染病颈防与控制以及环境的监寒与保护具有重要的意义，由于空气中病原微生物具有谱系多样性、物种复杂性、较快的变异性等特点，使得具有高通量、快速、准确等特点的宏基因组测序方法在空气中病原微生物的监中具有技术优针对空气中病愿微生物中因组测序察中准化的需求，本文件对空气中重要病原微生物的检测及鉴定方法，在空气级生物气收采样、前处理方法、文库制备、测序、致据结果分析等关键环节进行了规定，满足空气病原微生物宏基因组测序方法的规范使用，以提升我国在病原微生物监测上的能力，
1范围
空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法GB/T43628—2023
本文件规定了空气中病原微生物宏基因组测序鉴定方法的试验条件、试验步骤、质量控制及鉴定。本文件适用于空气中细菌、真菌、病毒等病原微生物的宏基因组测序鉴定及监测。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T6682
：分析实验室用水规格和试验方法GB/T18204.3公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物GB19489实验室生物安全通用要求GB/T30989高通量基因测序技术规程GB/T39990颗粒生物气溶胶采样器：技术条件
GB/T40974
核酸样本质量评价方法
GB41918生物安全柜
病原微生物实验室生物安全标识WS589
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
病原微生物pathogenicmicroorganism侵人生物体引起感染甚至传染病的微生物，包括细菌、真菌、病毒等。3.2
宏基因组
metagenome
特定环境中全部微生物遗传物质的总和，包含了可培养的和不可培养的微生物的基因组。［来源：JJF1265—2022，4.54]］3.3
测序sequencing
对核酸分子中核苷酸碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶)排列顺序和组分的测定。注：序列通常从5'端到3端表示，［来源：ISO20397-2：2021，3.19]3.4
文库library
通过生物来源的、人工合成的或克隆技术等所得到的一个核苷酸亚分子群，如基因组文库和互补DNA文库。
GB/T 43628—2023
缩路语
下列缩略语适用于本文件。
cDNA;互补 DNA(complementary deoxyribonucleie acid)DNA：脱氧核精核酸（deoxyribonueleicacid)PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RNA：核糖梭酸(ribonueleicacid）原理
利用气游胶采样册集空气溶胶样本，对样本中的微生物进行核酸提取，文库制备及宏基因组测序，得到微生物的禁被序列，并进行过程质量控制。使用序列分析软件来测序获得的核酸序列与微生物参考基困组数提库序享信息进行比对分析，获得数据库中比对到的微生物情息，根据设定的间值对样本中微生物进行基定
6试剂
生物学试中
刊应为分子
采样试齐
一级水的亚
则的试
与采件器配套使！
应无膜
核酸提取训剂
采用商业
化的意殿提取试剂
文库构建理剂
采用商业化测平台的就陈试剂盒。测序试剂
采用商业化测序平台的测序试剂标准物质/标准样品
河应发
及以上实用水应符合
金卫工电水更生磷配盐暖中溶液等。子50g
取感量不低
采用的标难物质/标难样品宽选择国家有证标准物质/有证标准样品、质量控制物质。标准物质/标准样品应包含核酸准确量催、标称特性和微生物的谱系信息。7
仪器设备
气落胶采样器：流量达50L/min过滤式采样器）、不小于300L/min（离心式采样器或大流量采样7.1
器），采样流量示值误差应不超过5%，采样效率不小于70%。7.2离心机：最大离心力不小于12000g，7.3
荧光定量PCR仪：温度设置范围为0℃～99℃。7.4涡旋振荡仪。
7.5测序仪：测序通量不小于1Gb。7.6一80℃超低温冰箱。
7.7水浴锅或金属浴：温度范围为20℃100℃。GB/T43628—2023
7.8核酸蛋白定量仪：荧光原理，最低检测样品体积为1μL，DNA最低浓度为10pg/μL。7.9生物分析仪：DNA的分离范围为25bp～12000bp;DNA和总RNA的分析灵敏度分别为1 ng/μL(DNA)、10 μg/μL(总 RNA)。7.10Ⅱ级以上生物安全柜：应符合GB41918的要求。8试验步骤
8.1样本采集
8.1.1采样点设置
按照GB/T18204.3中的要求进行采样布点。8.1.2采样方法
将气溶胶采样器（以下简称采样器）放在距离地面1.2m～1.5m的位置，采样器使用按照说明书要求进行。采样前采样容器/采样膜应无菌。使用离心式采样器或大流量采样器以不小于300L/min的流量采集10min～60min到采样液中，或使用过滤式采样器以不小于50L/min的流量采集40min～60min到滤膜上，采集后的样本转移和保存应注意防止采样以外的微生物污染。将采样液转移到离心管中，或将采样滤膜用无菌水溶解在离心管中，离心管应无菌、无核酸残留。将所获得离心管中的采样液保存于一80℃超低温冰箱中。如需运输，应在低于一20℃条件下保存，建议使用干冰运输，时间不超过24h。
8.2核酸提取
宜采用痕量核酸提取试剂盒进行采集样本微生物核酸的提取，详细提取方法及步骤按照试剂盒说明书或参考附录A。
进行RNA的提取时，应在生物安全柜中并注意在人少时进行，防止空气中RNA酶的污染，所用设备和耗材应无RNA酶污染，并在使用前用紫外灯照射。提取核酸后，需加人标准物质/标准样品进行质量控制。满足实验要求的DNA样本应置于一20℃以下条件保存，一般不超过7天，超过7天应保存于一80℃超低温冰箱中；RNA样本应置于一80℃条件保存。核酸样本使用时，取样不应超过3次，避免样本反复冻融。8.3RNA逆转录
按照RNA逆转录试剂盒的说明书进行操作，将RNA逆转录成cDNA，充分降解RNA后，合成双链cDNA。免费标准bzxz.net
8.4文库制备
根据样本种类及测序仪要求选择合适的建库试剂盒，按照建库试剂盒说明书对符合要求的核酸进行文库制备。同时为了得到高质量的测序结果，需要对PCR扩增产物和文库分别进行质量检测。文库浓度和文库片段长度需达到文库质量检测合格的条件，满足测序的需要。3
GB/T43628—2023
8.5测序
按照测序的标准化流程进行。测序读长在50bp～300bp范围内时，参照GB/T30989，见附录B。将达到质量检测合格的待测序文库，选择合适的测序读长，并对每个样本添加标签，分别进行测序反应，得到测序序列。
9质量控制
9.1实验室工作条件
9.1.1实验室的工作条件应符合GB/T30989的规定。9.1.2实验室的设施设备、实验室人员的要求、实验活动的管理、样本的运输与管理、消毒与灭菌、废弃物的处置、应急预案与意外事故的处置等应符合GB19489的规定。9.1.3实验室应按照WS589的要求，在实验室相应区域设置正确的标识。9.2核酸提取质量控制
在核酸提取过程中，同时使用空白采样液作为阴性对照、具有代表性的非致病性微生物标准物质/标准样品作为阳性对照同时进行提取。按照GB/T40974的要求对提取的核酸进行检测与质量控制,并选择加人内参物质(如斑马鱼基因组核酸)后的核酸浓度需达到10ng/μL～1μg/μL。9.3建库质量控制
建库时加人标准物质/标准样品作为质量控制标准。9.4数据质量控制
测序数据量宜大于1Gb。选择合适的数据质量控制软件，对测序数据进行质量控制。质量控制内容包括但不限于去除重复序列、低质量数据、接头序列等。合格测序数据应满足以下条件。—测序读长在50bp～300bp范围内时，碱基质量值大于或等于20（即Q20：碱基识别错误率不大于1%）的占比在90%以上；测序读长大于1kb时，碱基质量值大于或等于7（即Q7：碱基识别错误率不大于20%）的占比为100%。一接头序列污染比例不超过1%。一—过滤低质量序列、接头序列后的剩余序列长度大于35bp。10空气病原微生物鉴定
10.1病原微生物参考基因组的数据库选取病原微生物参考基因组数据库是与试验数据比对的参比数据集，可利用在线公共数据库（验证）或者自行构建，参考附录C
若自行构建病原微生物参考基因组数据库，应进行数据信息的挑选、整理、分类，过滤公共数据库的潜在错误（包括注释错误及其他数据库错误），收录信息应能覆盖空气中的主要病原微生物（种类包括细菌、病毒及真菌），确保每条收录的序列数据准确完整，同时定期进行自建数据库的信息维护和更新。从空气中分离的未知微生物的基因组序列，若在公共数据库中不存在时，可采用大规模并行测序后的数据纳人自行构建的数据库中，作为参考基因组。4
10.2病原微生物基因组序列比对及鉴定GB/T43628—2023
使用序列分析软件快速准确地分类比对宏基因组序列，将样本的序列比对到病原微生物参考10.2.1
基因组数据库的序列上，将比对结果按照序列的数量进行排序。序列分析软件对测序数据比对分析参考附录D中的示例。
统计阴性样本、微生物阳性对照样本和待测样本的测序深度、基因组覆盖度及各种病原微生物10.2.2
的占比，根据试验结果设定的值，确定本批次实验的有效性，鉴定空气中病原微生物。5
GB/T43628—2023
A.1宏基因组DNA提取
附录A
(资料性）
核酸提取方法
宏基因组DNA提取可使用磁珠法或等效的核酸提取试剂盒。核酸提取试剂盒应实现微生物细胞壁破裂、核酸释放、分离、纯化等。磁珠法提取微生物DNA的具体步骤描述如下。a）取1mL采样液，12000g离心5min收集微生物，吸弃900μL上清液。加入100μL溶菌酶消化液(20mg/mL)及5μLRNA酶。加人20μL蛋白酶K（20mg/mL），再加人300uL裂解液，振荡混匀后将离心管放置于恒温混b）
匀仪上，转速控制在800r/min～1000r/min，温度控制在65℃，孵育15min～30min直至液体变澄清。
加人350μL异丙醇，振荡混匀后再加人20μL磁珠，振荡混匀，室温静置5min，中间混匀c）
1次～2次。
将离心管放置磁力架上静置2min，磁珠完全吸附后，小心吸弃上清液体。e）
将离心管从磁力架上取下，加人500μL含无水乙醇的洗涤液，振荡混匀，室温静置2min。0
将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸弃上清液体。g）
将离心管从磁力架上取下，加入600μL含无水乙醇的洗涤液，室温静置1min。h）
将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，小心吸弃上清液体。1)
重复步骤a)～h)一次，尽可能吸弃离心管中残留的液体。将离心管放置磁力架上，开盖室温干燥10min，确保乙醇挥发干净。k）
将离心管从磁力架上取下，加人100μL洗脱，振荡混匀置于56℃金属浴中，孵育5min，期间旋涡振荡2次3次，取出旋涡振荡15s。1)
将离心管放置磁力架上，静置1min，待磁珠完全吸附后，小心吸取45μL～95uLDNA溶液转移至一个新的收集管中，做好标记并于一80℃保存。A.2宏基因组RNA提取
采用微生物RNA提取试剂盒进行痕量RNA的提取。详细操作步骤按照试剂盒说明书进行。6
测序文库的制备
(资料性)
测序流程
GB/T43628-2023
将待测序的核酸(DNA、cDNA或RNA）片段制备或两端连有接头（含有与扩增及测序引物互补的序列》、中间有短序列标签结构的标签文库增，得到含有待测核酸样品的测房文库。B.2
待测核酸样品的表面周定
将待测序文库中的待测实酸样品固定于测序介质中。碱基循环激序
测序错引物，待测序标签库列的结合文库；然后对基固文库进行大规模平行扩寺请核两样品上携来的美整谢导新用的副序得#技健进行洁合通过待
标记信号的采集
加人店物楼手酸，通进
合醇的竹
使得结专个持测核酸定列上
的测序错1物进行单碱基
延伸，并利自信者
收集仪器
出的官号。
记物被激发
循环刺序
信号采集精束后重复8.3
程中的你号或延佛后结合在更件销引物上的底的核音酸上的标分析采集的信号输出基序列
通过信号分析软件对采业得到的信号进行分析，得到物理通量、有收通量、序读长、测序深度和平均授益深度等基因测序运行多数并最终得出待测标签序列的需基序列信息。若所待测核酸样品的核苷酸序列已有参考序列（原重测序），还能扭当型盘度，并酒过与参考序列的比对，得到待测核酸样品的核苷酸序列的SNP信息
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