本文件规定了合成寡核苷酸(通常最多250个碱基)的生产和质量控制的最低要求。 本文件还描述了合成寡核苷酸的一般质量指标以及质量指标评价的常用方法。

ICS 07.080
CCS A 40
中华人民共和国国家标准
GB/T43629.1—2023/IS020688-1:2020生物技术
核酸合成　第 1部分：
合成寡核苷酸的生产和质量控制要求BiotechnologyNucleic acid synthesisPart 1 : Requirements for the productionand quality control of synthesized oligonucleotides(ISO 20688-1:2020,IDT)
2023-12-28发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-12-28实施
规范性引用文件
术语和定义
寡核苷酸的设计和选择
通用质量管理要求
通用要求
寡核苷酸分级免费标准下载网bzxz
控制文件
质量管理体系
人员和培训
安全控制
资源管理
生产工艺要求
通用要求
寡核苷酸合成
质量控制检查
质量控制过程要求
通用要求
分析方法的确认与验证
鉴定与纯度
摩尔质量和/或碱基长度
退火温度
纠正措施和改进建议
9合成寡核苷酸（RNA)的附加要求附录A（资料性）
工艺过程检查表
设备和装置清单及其控制标准
附录B（资料性）
GB/T43629.1—2023/ISO20688-1:2020GB/T43629.1—2023/IS020688-1:2020附录C（资料性）摩尔质量和摩尔数的计算附录D（资料性）
）采用质量分析法验证寡核苷酸序列…·附录E（资料性）采用有证标准物质/有证标准样品对测量仪器进行校准附录F（资料性）
参考文献
T值的计算方法
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则起草。
GB/T43629.1—2023/IS020688-1:2020第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件是GB/T43629《生物技术核酸合成》的第1部分。GB/T43629已经发布了以下部分：第1部分：合成寡核苷酸的生产和质量控制要求。本文件做了下列最小限度的编辑性改动：结合我国标准的具体情况，增加了页下注。本文件等同采用ISO20688-1：2020《生物技术核酸合成第1部分：合成寡核苷酸的生产和质量控制要求》。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。本文件起草单位：中国测试技术研究院、安徽瑞拜药业有限公司、深检集团（深圳）医学检验实验室、浙江贝兰伯生物技术有限公司、成都海关技术中心、成都医学院、河北省食品检验研究院、四川省疾病预防控制中心、通用生物（安徽)股份有限公司。本文件主要起草人：周李华、马丽侠、周黎黎、徐朝花、侯晓妮、王或婕、林华、肖伟敏、蒋子敬、汤江文、陈佳平、姜展樾、樊东生、张岩、刘宗文、王欣然、张才敏、喻明军、杨国武。GB/T43629.1—2023/IS020688-1:2020引言
由核苷酸组成的单链、线性生物化合物称为“合成寡核苷酸或“寡核苷酸”，是生物技术中不可或缺的成分。例如，它们可用于聚合酶链反应（PCR)扩增引物、微阵列、实时PCR或新一代测序（NGS)捕获探针技术中，也可用于合成目标基因的插人起始材料。GB/T43629拟由以下部分构成：
第1部分：合成寡核苷酸的生产和质量控制要求。适用于长度不超过250个碱基的合成寡核苷酸。
第2部分：合成基因片段、基因及基因组的生产和质量控制的一般定义和要求。适用于长度低于10Mbp碱基对的合成基因片段、基因及基因组，包括非克隆片段（线性）和质粒中的克隆基因(环状）。
在寡核苷酸合成过程中，生产过程中的质量控制非常重要。为了确保符合最终应用的质量要求，需要对大小范围、浓度和污染物进行量化。考虑到寡核苷酸在生物活性方面的应用，其质量（尤其是序列和构象)将影响其适应性或功能，例如对同源结合位点的分子识别、化学行为等。每种终端应用的具体要求可能有所不同。
１范围
GB/T 43629.1—2023/ISO20688-1:2020生物技术核酸合成第1部分：
合成寡核首酸的生产和质量控制要求本文件规定了合成寡核苷酸（通常最多250个碱基）的生产和质量控制的最低要求本文件还描述了合成寡核苷酸的一般质量指标以及质量指标评价的常用方法。2规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
有证标准物质/有证标准样品certifiedreferencematerial;CRM附有特性量值、相关不确定度和计量溯源声明标准物质/标准样品证书，提供使用有效程序获得的一个或多个特性量值的标准物质/标准样品。［来源：ISOGuide30:2015,2.1.2，有修改3.2
performance
《合成寡核苷酸具有满足生物学试剂特定使用需求注1：合成的寡核苷酸在作为PCR引物的情况下，合成的寡核苷酸具有引物的能力。注2：合成的寡核苷酸在作为探针以用于DNA微阵列、实时PCR或NGS的情况下，合成的寡核苷酸具有与靶核酸特异性杂交的能力。
注3：通过评估寡核苷酸在其各自用途中的功能来确认其能力。3.3
purity
《合成寡核苷酸合成寡核苷酸的预期序列和/或长度与寡核苷酸总量之间的比率。注：合成寡核苷酸的纯度是对应于合成寡核苷酸的预期序列和/或长度的吸收峰面积与寡核苷酸的总峰面积的比率。通过高效液相色谱（HPLC)或毛细管电泳（CE）计算260nm处的吸光度（OD260）。纯度是根据HPLC或CE或质谱仪的结果通过面积归一化法计算的。3.4
标准物质/标准样品referencematerial;RM具有一种或多种足够均匀和稳定的特定特性的物质，其特性量值适用于测量过程中的预期用途。［来源：ISOGuide30:20152.1.1，有修改3.5
synthetic oligonucleotides
合成寡核苷酸
用化学方法合成的脱氧核糖核酸（DNA)或核糖核酸（RNA）。GB/T43629.1—2023/IS020688-1:2020注1：各种化合物（例如修饰的碱基、碱基类似物、末端标记试剂、荧光化合物等)均能引人到合成的寡核苷酸中。注2：本文件中的合成寡核苷酸是单链的、线性的，长度范围从大约10个到250个核苷酸。4寡核苷酸的设计和选择
合成寡核苷酸的质量和一致性要求依据其预期用途有差异。例如，引物和探针在聚合酶链反应(PCR)或微阵列或新一代测序（NGS)中的质量要求不同。通常，用户负责指定具体用途的寡核苷酸的质量要求用户可从生产者提供的质量等级列表中选择符合预期用途的质量等级，例如“基因组等级”或反义等级”（参见5.2）。
健全的质量管理体系和检测标准有助于提供一致的信息，以便：用户适当地选择符合预期用途的寡核苷酸；一用户和生产者能够更好地沟通，并就定制寡核苷酸的要求达成一致。5通用质量管理要求
通用要求
合成寡核苷酸的生产者（以下称为“生产者”)应建立并实施一种程序，包括描述并保存记录以下过程：
订单信息：
b）寡核苷酸的生产；
c）质量控制要求。
应制定订单接收过程中的质量方针和质量目标。用户的质量要求可能因其预期用途、实验方法的设计以及影响重复性和再现性结果因素的差异而变化。生产者应根据订单信息明确质量方针、质量目标和合成寡核苷酸的等级（如适用），根据质量等级表等方式监控是否按照相应的工艺过程进行生产（示例见附录A）。此外，应在生产过程中采取必要的措施，通过测量和分析所生产的合成寡核苷酸的质量来达到预期的结果。
5.2寡核苷酸分级
为了避免产生不必要的或者过高的质量定值要求，可考虑对寡核苷酸质量进行分级。生产者在记录寡核苷酸质量等级时，应根据预期用途确定等级。应选择和确定符合每个等级的纯化方法，见7.35.3控制文件
生产者应制定一套程序，确保对程序化信息（包括本文件要求的记录）进行受控，并应防止使用任何作废文件，严格执行质量管理体系要求。当文件信息包括记录保存在电子媒介中时，生产者应确保对电子媒介的受控。
5.4质量管理体系
生产者应建立质量管理体系。质量管理体系应建立必要的程序文件，并确保生产是根据程序文件进行的。应定期检查合成寡核苷酸的生产是否正确执行本文件规定的质量管理体系。注：对于标记的寡核苷酸，能根据标记的特性考虑其他质量指标，例如荧光强度和波长。5.5人员和培训
生产者应确保人员具备执行本文件规定的程序文件的能力，并对其进行适当监督。生产者应向人2
员提供适当的培训和能力评估。5.6安全控制
GB/T43629.1—2023/IS020688-1:2020生产者应根据适用要求制定安全计划，以确保本文件规定的寡核苷酸合成人员和纯化人员的安全。资源管理
生产者应确保生产寡核苷酸的设施和区域环境处于适当的条件下。生产者应当维护生产合成寡核苷酸的设备和仪器。生产者应对可能影响合成寡核苷酸质量的原料（包括试剂、纯水和辅助材料）进行质量控制。
附录B列出了适合生产合成寡核苷酸的设备和装置及其控制标准示例。生产工艺要求
通用要求
单序列合成寡核苷酸的生产通常包括以下过程：a）合成；
b）纯化；
质量控制检查；
干燥（如适用）；
分装。
这些过程应使用经过定期维护/校准的仪器进行，例如移液管或干燥器注1：有几种用于生产复杂的寡核苷酸库的生产工艺。例如，几个寡核苷酸组合成复杂的寡核苷酸库，或者通过基于阵列的合成产生复杂的寡核苷酸库。能根据生产方法选择、实施适当的质量控制措施，注2：确定质量属性的常规方法不一定适用于基于阵列的合成，注3：在某些情况下，单序列寡核苷酸是用兼并碱基合成的，用于非特异性退火的特定应用。在这种情况下，碱基在一个特定的位点被颠换，
2寡核苷酸合成
应使用经过定期校准和维护的测量仪器进行质量控制检查寡核苷酸合成仪应定期维护和保养。操作人员应按照程序文件进行资格认证。应保存与实验操作有关的记录。
3纯化
应根据设计寡核苷酸的风险、与用户协议的预期用途，选择适当的纯化设备和方法。纯化方法包括：反相高效液相色谱（C8，C18）纯化、阴离子交换高效液相色谱［（stronganionexchangepattern，SAX），（weakanionexchangepattern，WAX)、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、寡核苷酸纯化柱（oligonucleotidepurification cartridge，OPC）、高纯度无盐（highpuritysaltfree，HPSF）纯化和直接沉淀（脱盐）。纯化方法可根据寡核酸的预期用途选择。应保留所用方法的记录。纯化设备应由有资质的人员进行操作。与操作有关的记录应予以保存。7.4质量控制检查
应使用经过校准和维护的测量仪器进行质量控制检查。测量操作应由有资质的人员按照程序文件3
GB/T43629.1—2023/ISO20688-1:2020进行，并保留操作记录。对寡核苷酸的特性、纯度、杂质、合成量和其他与预期用途有关的重要属性应进行质量控制。
7.5干燥
干燥可采用离心蒸发、冷冻干燥或空气干燥设备进行。这些操作应由有资质的人员按照程序文件进行，并保留操作记录。7.6分装
这些操作应由有资质的人员按照程序文件执行，并保留操作记录。8质量控制过程要求
8.1通用要求
质量控制过程应确定寡核苷酸与其预期用途有关的特性、纯度、杂质、量和其他重要属性，应选择适当的方法并进行验证，以确定寡核苷酸的特性和质量，测量工作应由有资质的人员进行。8.2分析方法的确认与验证
用于进行质量控制和检测质量属性的分析方法应经过确认和验证。仪器应使用有证标准物质/有证标准样品进行校准
注：附录E描述了采用有证标准物质/有证标准样品对测量仪器进行校准的示例8.3鉴定与纯度
8.3.1碱基序列的鉴定
碱基序列可通过适当的方法确认，例如电喷雾电离（ESI)或基质辅助激光解析/电离（MALDI)作为离子源，飞行时间质谱仪（ToF）、离子阱质谱仪或四极杆质谱仪（MS)用于分子量分析或者测序。注1：附录D中描述了使用MS确认碱基序列的示例注2：MS用于确认短寡核苷酸的序列，而准确分析序列取决于合成寡核苷酸的长度。应记录确认的基本序列标识。
8.3.2纯度
生产者和使用者应就特定用途的寡核苷酸的纯度达成一致。示例：合成寡核苷酸的纯度能确定为目标寡核苷酸量与寡核苷酸总量之比。目标寡核苷酸是具有“预期长度”和/或正确序列的寡核苷酸
测定纯度的方法包括以下一种或多种方法：分析用反相或离子交换高效液相色谱法；a）
经验证的相对线性区间的毛细管电泳或平板凝胶电泳；质谱（例如，ESI或MALDI作为离子源，ToF、MS作为分子量分析仪）；c）
d）测序。
注：合成的寡核苷酸是复杂的分子，根据寡核苷酸的设计和生产工艺，会产生不同的结果，应记录测定的纯度。
8.3.3杂质
在某些应用中，杂质的测定是很重要的。4
GB/T 43629.1—2023/ISO20688-1:2020生产者和使用者应就特殊用途的寡核苷酸杂质的可接受程度或范围确定并达成一致。一般来说，杂质是指干扰预期用途的寡核苷酸的含量。应采用适当的方法测定杂质的含量。注：杂质包括但不限于有机溶剂、单核苷酸、短核酸和序列错误的核酸杂质测定方法包括以下一种或多种方法：分析用反相或离子交换高效液相色谱法；a）
经验证的相对线性区间的毛细管电泳或平板凝胶电泳；质谱（ToF或ESI）；
测序。
应记录测定的杂质。
8.4定量
8.4.1通用要求
应按照事先商定的预期用途提供足够量的合成寡核苷酸生产者应确认合成总量符合用户要求应记录协商的合成寡核苷酸的总量8.4.2浓度
寡核苷酸浓度的测量可作为生产或产品测试（检查）过程中质量控制的一部分。吸光度可用来测量溶液中寡核苷酸的浓度。通常，使用260nm处的吸光度。物质的量浓度是根据摩尔消光系数和OD值公式（C.1)计算的，摩尔消光系数的参数见附录C。由于在计算摩尔消光系数时使用了不同的假设，摩尔消光系数数据（包括使用的假设）均应被记录其他方法，如高效液相色谱法，使用寡核苷酸参考物质或有证标准物质/有证标准样品（如果适用），在证明与光密度的相关性后，也可用于测量浓度。应记录测量的浓度。
8.4.3质量
质量应以纳克（ng)或可溯源至SI单位的形式记录。质量通过公式（1)来计算：
m =OD260 × V×C × D
式中：
质量，单位为纳克（ng）；
OD260————2
-260nm处的吸光度；
液体体积，单位为毫升（mL）；换算系数，单位为纳克每毫升（ng/mL）；—稀释因子。
8.5摩尔质量和/或碱基长度
·（1）
应检测并记录合成寡核苷酸的摩尔质量和/或碱基长度。摩尔质量可用质谱（包括ESI或MALDI作为离子源，ToF、MS作为质量分析仪)直接测定，也可通过平板电泳仪或毛细管电泳仪间接测定。应由有资质的人员进行确认，并保留记录质谱法是一种测量分子量的方法。使用质谱时，合成寡核苷酸的摩尔质量可按公式（2）计算：
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