GB/Z 42840-2023
基本信息
标准号:
GB/Z 42840-2023
中文名称:纳米技术 利用金黄色葡萄球菌释放的胞壁酸检测银纳米颗粒的效力
标准类别:国家标准(GB)
英文名称:Nanotechonologies—Determination of silver nanoparticles potency by release of muramic acid from Staphylococcus aureus
标准状态:现行
发布日期:2023-08-06
实施日期:2023-08-06
出版语种:简体中文
下载格式:.pdf .zip
下载大小:2996145
相关标签:
纳米技术
利用
金黄色
葡萄球菌
释放
检测
纳米
颗粒
标准分类号
标准ICS号:数学、自然科学>>07.030物理学、化学
中标分类号:综合>>基础学科>>A43化学
关联标准
采标情况:ISO/TS 16550:2014,IDT
出版信息
出版社:中国标准出版社
页数:20页
标准价格:38.0
相关单位信息
起草人:刘健、许海燕、温涛
起草单位:中国医学科学院基础医学研究所
归口单位:全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC 279)
提出单位:中国科学院
发布部门:国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会
标准简介
本文件描述了一种利用气相色谱-质谱法(GC-MS)定量评价银纳米颗粒引起金黄色葡萄球菌细胞壁降解及胞壁酸释放效力的方法。
标准内容
ICS 07.030
CCS A 43
中华人民共和国国家标准化指导性技术文件GB/Z42840—2023/IS0/TS16550:2014纳米技术
利用金黄色葡萄球菌释放的
胞壁酸检测银纳米颗粒的效力
Nanotechonologies-Determination of silver nanoparticles potency by release ofmuramicacidfromStaphylococcus aureus(ISO/TS 16550:2014,IDT)
2023-08-06发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-08-06实施
GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:2014前言
规范性引用文件
术语和定义
符号和缩略语
MA检测的样品制备
细菌生长和AgNP处理
细胞壁水解
细胞壁衍生化
气相色谱-质谱
数据分析和结果阐释
银纳米颗粒样品的检测方法
附录A(资料性)
附录B(资料性)
气相色谱-质谱法
附录C(资料性)银纳米颗粒参比物质的实验室制备方法·附录D(资料性)
附录E(资料性)
参考文献
银纳米颗粒悬液制备
对照条件的处理;阳性对照、阴性对照、细菌适应性对照10
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则起草。
GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:2014第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定本文件等同采用ISO/TS16550:2014《纳米技术利用金黄色葡萄球菌释放的胞壁酸检测银纳米颗粒的效力》,文件类型由ISO的技术规范调整为我国的指导性技术文件。本文件增加了“规范性引用文件”一章本文件做了下列最小限度的编辑性改动:将第7章“三个平行样的标准偏差为士0.0128”调到该章的表2中。本文件由中国科学院提出。
本文件由全国纳米技术标准化技术委员会(SAC/TC279)归口。本文件起草单位:中国医学科学院基础医学研究所。本文件主要起草人:刘健、许海燕、温涛。GB/Z42840—2023/IS0/TS16550:2014引言
银纳米颗粒(AgNP)的抗菌活性已被越来越多地应用于生物医药领域及众多消费品中,如医疗器械涂层材料、骨科或齿科植人材料,创伤修复用局部辅料、纺织品甚至洗衣机等[9]。企业生产着多种具有不同物理特性的银纳米颗粒作为抗菌剂,但极少关注其副作用。此外,纳米颗粒在不同环境中的生物利用度可能会增加[2T3},从而会对土壤有益微生物、植物、动物和人类造成影响和风险。因此,银纳米颗粒的效力宜根据其最终的生物活性进行评估和分类。本文件未涉及对银纳米材料特性的评估I
1范围
GB/Z42840—2023/IS0/TS16550:2014纳米技术利用金黄色葡萄球菌释放的胞壁酸检测银纳米颗粒的效力
本文件描述了一种利用气相色谱-质谱法(GC-MS)定量评价银纳米颗粒引起金黄色葡萄球菌细胞壁降解及胞壁酸释放效力的方法。规范性引用文件
本文件没有规范性引用文件。
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
抗菌活性
antibacterical activity
化合物或物质杀灭细菌(条菌性)或抑制细菌生长(抑菌性)的性质。3.2
dynamic lightscattering;DLS
动态光散射
光子相关光谱法photoncorrelationspectroscopy能用于检测悬液中小颗粒或溶液中聚合物的粒径分布情况的一种物理技术。3.3
气相色谱-质谱法
gaschromatography-mass spectrometry;GC-Ms结合气相色谱法和质谱分析法定性和定量分析待测样品中挥发性化合物的技术(见附录A)。3.4
革兰氏阳性菌
Grampositivebacteria
在革兰氏染色法中,能被染色/不被有机溶剂脱色的细菌。3.5
internalstandard
加入到样品中帮助定性鉴别和/或定量测定样品成分的已知浓度化合物(见附录B)。来源:ISO20752:20143.2
艮limit of detection;LOD
检出限
由协作试验或其他的适当验证所证明的,能被可靠检出但不要求能被定量的测试样品中被测物的最低量或浓度。
[[来源:ISO8196-1:2009,3.4.3]]GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:20143.7
定量限limit of quantification;LOQ由协作试验或其他验证所证明的,在方法所规定的实验条件下能够在可接受的精密度和准确度水平下被定量检测的测试样品中目标物的最低浓度。[来源:ISO15216-1:2017,3.18]3.8
线性动态范围
linear dynamic range; LDR
Y对X的回归曲线呈直线的范围
注:Y对X的线性回归系数为回归线方程中X的系数(斜率)。3.9
muramic acid
胞壁酸
在化学结构上由乳酸与葡萄糖胺以醚键连接形成的一种糖酰胺,在肽聚糖中以N-乙酰衍生物形式天然存在[12]。
注1:3-O-α-羧乙基-D-葡萄糖胺。注2:见图1b)。
GlcNAc
-GlcNAc
MurNAc
MurNAc
GleNAc
GlcNAc-
MurNAc
MurNAcL-Ala
GlcNAc
D-Lys D-Ala
a)肽聚糖的结构
GlcNAc-
图1肽聚糖及胞壁酸的结构
唐peptidoglycan;PGN
肽聚糖
胞壁质murein
2-氨基-3-O-(1-羧乙基)-2-脱氧-D-葡萄糖b)胞壁酸的结构
由糖和氨基酸组成的聚合物,在细菌细胞膜外形成网状层,构成细胞壁。注:肽聚糖是几乎所有细菌细胞壁中所特有和必需的一种成分,在革兰氏阳性菌细胞壁中大量存在,见图1a)[12]。3.11
银纳米颗粒效力silvernanoparticlepotency银纳米颗粒与细菌细胞壁的反应能力,通过胞壁酸释放间接检测。3.12
金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus;S.aureus兼性厌氧革兰氏阳性球菌,凝血酶阳性,在显微镜下呈葡萄串状,能在以甘露醇为唯一碳源的高盐培养基中生长,产生黄色色素。3.13
量trace
微克每毫升(μg/mL)量级或更低的浓度。2
透射电子显微镜transmissionelectronmicroscopy;TEMGB/Z42840—2023/ISO/TS16550:2014利用穿过样品并与之发生相互作用的电子束产生样品放大图像或衍射花样的仪器L来源:GB/T30543一2014,3.8,有修改普ultravioletvisible spectroscopy;UV-Vis紫外可见光谱
在紫外-可见光谱区的吸收光谱或反射光谱。注:这意味着它使用可见光及其毗邻范围[近紫外和近红外(NIR)的光3.16
X射线衍射法X-raydiffraction;XRD通过分析X射线轰击样品产生的衍射花样获得样品晶体结构信息的方法。[来源:GB/T30544.6—2016,5.2.1]4符号和缩略语
下列符号和缩略语适用于本文件。AgNP:银纳米颗粒(SilverNanoparticle)MA:胞壁酸(MuramicAcid)
MHB:米勒-海顿肉汤(MuellerHintonBroth)ODsoo:600nm处光密度(OpticalDensityat600nm)SIM:选择性离子检测(SelectedIonMonitoring)5原理
肽聚糖(PGN)是细菌细胞壁特有且必需的一种成分L12」,其主要结构特征是由短肽交联的线状聚糖链。在金黄色葡萄球菌中,聚糖链由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸残基通过β-1-4键交替连接组成;肽链由L-丙氨酸、D-谷氨酰胺、L-赖氨酸、D-丙氨酸组成[图1a)J[12I[13]。研究表明AgNP能破坏细菌细胞壁,产生PGN片段,导致培养基中胞壁酸浓度上升[12I[14]。AgNP是胶体AgNP的活性成分,在不同的商品中,AgNP可能具有不同大小、表面特征、形状、zeta电位、浓度。AgNP的活性取决于以上特征,这些特征能表现出协同或拮抗的交互作用[14]。区别每种特征所造成的影响需要制备大量的样品并使用多种设备。监测MA的浓度是反映这些特征影响AgNP效力的一项指标[14I151[16][17[18]。本文件采用一种非常灵敏的方法检测单一分析物一一胞壁酸,作为细胞壁降解这一单一作用模式的间接测量法。该方法的灵敏度允许在最低抑菌浓度(MIC)以下对胞壁酸进行定量[19J[20]。但是,通过胞壁酸的释放检测AgNP的作用并不反映其杀伤细胞或阻滞细胞生长的能力。此外,该方法依靠单一实验室合成的参比样品来建立一个被广泛接受的剂量响应曲线用于后续使用。纳米颗粒具有颗粒-化学物质二象性,即颗粒也是通过溶解过程释放化学物质的储存库。本文件中描述的方案不提供关于银纳米颗粒广谱杀菌作用的信息。由对金黄色葡萄球菌的作用效果并不能预测对其他革兰氏阳性菌的作用效果,也不适用于革兰氏阴性菌,因为两种类型的细胞壁存在巨大的结构差异,肽聚糖的比例也完全不同。因此,本文件不是关于纳米颗粒对细菌作用的全面考察。基于这些考虑,实验室制备的银纳米颗粒和系统验证参比材料的表征数据见附录C3
GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:20146MA检测的样品制备
细菌生长和AgNP处理
6.1.1检测方法原理
金黄色葡萄球菌ATCC25923培养于新鲜肉汤培养基中,当OD600达到约0.45~0.5(即细菌培养至接近1×10CFU/mL~2×10°CFU/mL或处于对数生长中期)时,加人AgNP,37℃振荡(180r/min~200r/min)孵育18h。收集培养基,通过离心和过滤处理培养液,利用旋转蒸发器和冷冻干燥机进行干燥。下一步将采用本文件所描述的方法检测胞壁酸的浓度。本实验中使用的培养物中需含有高滴度的活菌。在每次实验中,至少宜通过已有的细菌生长曲线参照数据或通过在一段时间范围内测定OD600值来确定具有高滴度的活菌(OD600约在0.45~0.5)。6.1.2方法
6.1.2.1材料
检测材料包括:
金黄色葡萄球菌ATCC25923;
MHB培养基。
检测条件
通过以下步骤进行检测。
通过在营养琼脂(NA)平板上挑取单一细菌集落来制备细菌的新鲜培养液。用于检测银纳米颗粒浓度的每个样品宜分装到3个烧瓶(150mL~200mL)中,每瓶装有2)
25mL无菌MHB培养基,
细菌接种至锥形瓶前,宜先在MHB培养基中预培养2h~3h。在含5mLMHB培养基的试3)
管中接种单个菌落,37℃振荡培养使浊度等同于1号麦克法兰比浊管。要得到20mL细菌悬液,需将0.1mL的预培养液加人到含20mLMHB培养基的无菌100mL锥形瓶中,并在37℃培养,使OD00达到0.45~0.5(约1X10°CFU/mL~2×10°CFU/mL),或使细菌处于对数生长中期。这个建议的OD值是基于实验中根据OD60读数和相应的CFU计数绘制的生长曲线得到的。在无菌条件下,制备的细菌悬液应按照表1使用4)
不宜使用处于静止生长期的细菌。培养温度宜为37℃,振荡速度为180r/min~200r/min。5)
溶剂/溶媒
使用粉末状AgNP时,溶剂/溶媒不宜与待测物质和细菌发生化学反应。宜尽可能首先考虑使用水溶性溶剂/溶媒(见附录D)。6.1.2.4暴露浓度
至少采用5种不同剂量的测试样品(见表1)。6.1.2.5步骤
基于6.1.2.2,金黄色葡萄球菌ATCC25923培养于MHB培养基中,在AgNP处理之前,接种4
GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:20140.1mL预培养菌液至20mLMHB培养基中,在37℃、180r/min~200r/min条件下振荡培养,使OD60达到约0.45~0.5。Www.bzxZ.net
6.1.2.6测试样品处理
宜使用不同浓度的实验室制备的AgNP参比物(见附录C)和工作AgNP与菌液进行孵育。表1说明了在最终体积为5mL的体系中各种处理条件所对应的AgNP胶体悬液、培养基、和细菌悬液的体积。对于粉末样品,见附录D。
表1AgNP处理浓度
样品号
AgNPb/mL
细菌悬液/mL
培养基/g
蒸馏水/mL
阳性/阴性对照条件见附录E。
bAgNP胶体/粉末悬浊液(见附录D)。2
1号样品中,配置培养基的MHB粉末用量与厂家推荐的配置常规(1X)MHB培养基用量相同。在其他样品中,应确保所有最终体积为5mL的体系中含有等量的营养物质。为达到上述目的,0.0525g培养基粉末宜溶解于不同体积的蒸馏水(D.W.)中,并在使用前进行高压蒸汽灭菌。各样品蒸馏水用量分别为:1:2.5mL:2:2.45mL.3:2.25mL,4:2.0mL,5:1.25mL,如表1所示6.1.2.7孵育
在实验中,将锥形瓶在37℃下振荡(180r/min~200r/min)孵育18h。孵育结束后,将培养液在10000g、4℃条件下离心20min,上清用3μm孔径滤器[聚四氟乙烯(PTFE),亲水性]过滤。利用旋转蒸发装置将滤液浓缩至5mL后,采用冷冻干燥装置在一50℃条件下彻底干燥,之后样品于一20℃保存用于后续检测。
6.2细胞壁水解
将1mg冻干样品加人30mL的6mol/LHCl溶液中,在氮气保护下115℃回流加热21h。冷却后,将水解产物过滤,利用旋转蒸发仪在40℃、真空条件下彻底干燥。所得产物溶解于20mLH,O中,用0.4mol/LKOH将pH调节至6.6~6.8。将溶液用旋转蒸发仪再次干燥后,加入3mL甲醇(MgSO干燥),6000g离心10min。脱盐后,将产物用干燥的空气或N2干燥[13]。6.3细胞壁衍生化
采用糖睛乙酰化衍生法将干燥产物中的MA转变成挥发性物质[13]。配制含32mg/mL的盐酸羟胺和40mg/mL的4-二甲氨基吡啶的吡啶-甲醇混合溶液(体积比为4:1)。在15mL该溶液中加入0.05mg肌醇。之后,取0.3mL上述溶液加人至3mg干燥样品中,封口并手动震荡约30s,在75℃~80℃条件下加热30min。之后将反应瓶取出冷却至室温,加人1mL乙酸酐,封口震荡后,再次加热20min,其后将2mL二氯甲烷连续注人到已冷却的样品溶液中。进行GC-MS分析前宜使用1mol/L浓度的HC1和H2O充分洗涤产物3次。最后,将有机层在45℃条件下用氮气干燥,并溶解于200uL5
GB/Z42840—2023/ISO/TS16550:2014二氯甲烷中[13]
6.4气相色谱-质谱
利用气相色谱与质谱联用检测MA。宜选择分离比为1:30的非极性柱(30m×0.25mmID,厚度0.25μm),温度程序设置如下:维持初始柱温90℃,1min之后以10℃/min的速度升温至250℃,并在该温度下保持3min;
关闭离子源电离模式,10min之后采用SIM法(用于痕量样品)检测10min,检测质荷比(m/z)范围为50~1000;
调节离子源温度至200℃。
为了提高定量分析的准确度,宜使用内标物(如肌醇),图2展示了分离MA和肌醇的色谱图。计数值
17.550.1000
75%手
50%手
25%手
997688
质荷比(m/2)
肌醇的质谱图
数据分析和结果阐释
胞壁酸
色谱图
6221758
485256
75%手
50%手
25%号
255598
1829351
159306
图2标准溶液的GC-MS分析
259711
质荷比(m/2)
c)胞壁酸的质谱图
保留时间/min
宜按照前述方法配制MA(1000μg/mL)的储备液,并将其稀释至1μg/mL~1000μg/mL,其中6
GB/Z42840—2023/IS0/TS16550:2014包含作为内参的肌醇。肌醇(内参)的峰面积用于修正胞壁酸的峰面积,消除注射产生的误差。每个浓度宜平行测定3次。通过公式(1)计算修正后的MA峰面积。修正响应=MA的平均峰面积/肌醇的平均峰面积....................(I)
将修正响应对相应浓度作图,结果如表2所示。分别将信噪比为3和10的修正响应确定为检出限和定量限。为了评估方法的检出限和定量限,每个样品宜检测3次,然后确定建议的方法及信噪比。表2结果的验证和量化
检出限/(μg/mL)
定量限/(μg/mL)
线性动态范围/(μg/mL)
决定系数/r2
标准偏差/SD
3银纳米颗粒样品的检测方法
3.3~1000
± 0.012 8
AgNP测试样品悬液和工作/参比银纳米颗粒(见附录C)宜配制成系列不同浓度的溶液(见表1)。银纳米颗粒测试样品释放的胞壁酸与参比银纳米颗粒释放的胞壁酸的差异表明了测试样品的效力。可接受的效力水平是基于制造商和用户之间的协议决定的。阴性对照宜包括银纳米颗粒测试样品的溶剂/溶媒。
当胞壁酸浓度很低,样品介质较为复杂时,能采用串联质谱和选择性离子检测技术来提高灵敏度
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