GB/T 42366-2023
基本信息
标准号:
GB/T 42366-2023
中文名称:化学品 静水椎实螺繁殖试验
标准类别:国家标准(GB)
英文名称:Chemicals—Lymnaea stagnalis reproduction test
标准状态:现行
发布日期:2023-03-17
实施日期:2023-10-01
出版语种:简体中文
下载格式:.pdf .zip
下载大小:6168107
相关标签:
化学品
繁殖
试验
标准分类号
标准ICS号:13.300;13.020.40
中标分类号:综合>>标志、包装、运输、贮存>>A80标志、包装、运输、贮存综合
关联标准
出版信息
出版社:中国标准出版社
页数:28页【彩图】
标准价格:46.0
相关单位信息
起草人:许玫英、范雪滢、许玉洁、刘纯新、余明喧、梁秋、刘桃妹、窦从从、梅承芳、杨旭楠、周丽丽、冯宝欣、卢嘉慧、彭宜俊、吴才春、毛晓尧
起草单位:广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、中国检验检疫科学研究院、杭州瑞欧科技有限公司、厦门市格灵生物技术有限公司、广东环境保护工程职业学院、广东全庆检测有限公司、西安凯金哲检测有限公司、金久科技有限公司
归口单位:全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)
提出单位:全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC 251)
发布部门:国家市场监督管理总局 国家标准化管理委员会
标准简介
本文件描述了化学品静水椎实螺繁殖试验的试验原理、受试物信息、参比物、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据处理、报告。
本文件用于评价长期暴露下化学品对雌雄同体的淡水螺静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)生存和繁殖的潜在影响。
标准内容
ICS13.300;13.020.40
CCS A 80
中华人民共和国国家标准
GB/T 423662023
化学品
静水椎实螺繁殖试验
Chemicals-Lymnaea stagnalis reproduction tes2023-03-17发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-10-01实施
GB/T 42366—2023
1范围
2规范性引用文件
术语、定义和缩略语
试验原理
受试物信息
参比物
试验准备
试验程序
质量保证与质量控制
数据处理
11报告
附录A(资料性)静水椎实螺的驯养附录B(资料性)异常卵
附录C(资料性)时间-加权平均值的计算目
附录D(资料性)饲养液更换,物理化学监测数据和喂食数据记录表附录E(资料性)静水椎实螺繁殖量和存活情况数据记录表附录F(资料性)静水椎实螺繁殖量数据的统计方法参考文献
GB/T42366—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位:广东省科学院微生物研究所(广东省微生物分析检测中心)、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、中国检验检疫科学研究院、杭州瑞欧科技有限公司、厦门市格灵生物技术有限公司、广东环境保护工程职业学院、广东全庆检测有限公司、西安凯金哲检测有限公司、金久科技有限公司。
本文件主要起草人:许玫英、范雪滢、许玉洁、刘纯新、余明喧、梁秋、刘桃妹、窦从从、梅承芳、杨旭楠、周丽丽、冯宝欣、卢嘉慧、彭宜俊、吴才春、毛晓尧GB/T42366—2023
关于软体动物毒性测试的综述性论文强调了有必要针对部分化学品开展水生软体动物繁殖毒性试验,特别强调了这类重要的生态和经济生物的毒性测试方法的缺失。现有的繁殖试验方法很少涉及雌雄同体的水生物种。
试验的测试终点是化学品在28d暴露期间,螺的存活数和每只螺产出的卵群数。每个亲本壳长的增长量和产卵数量也可作为附加的测试终点。如采用本方法对混合物开展测试并将获得的数据用于监管时,需考虑试验结果是否充分且有效。如有法规明确规定可对混合物进行测试,则可直接采用本文件。1范围
化学品静水椎实螺繁殖试验
GB/T42366—2023
本文件描述了化学品静水椎实螺繁殖试验的试验原理、受试物信息、参比物、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据处理、报告本文件用于评价长期暴露下化学品对雌雄同体的淡水螺静水椎实螺(Lymnaea繁殖的潜在影响。
2规范性引用文件
stagnalis)生存和
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件:;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T21801
GB/T21802
GB/T21803
GB/T21831
GB/T 21856
GB/T21857
化学品
快速生物降解性呼吸计量法试验化学品快速生物降解性改进的MITI试验(I)化学品快速生物降解性DOC消减试验化学品快速生物降解性密闭瓶法试验快速生物降解性
化学品
二氧化碳产生试验
化学品
3术语、定义和缩略语
3.1术语和定义
快速生物降解性
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1
改进的OECD筛选试验
x%效应浓度x%effectiveconcentration;EC在给定测试周期内,与对照组相比,导致静水椎实螺繁殖量降低x%时的受试物浓度。3.1.2
最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentration;LOEC暴露期间与对照组相比,对受试生物产生显著效应(p<0.05)的最低受试物浓度,LOEC以上的所有试验浓度所产生的毒性效应等于或者显著高于LOEC中所观察到的毒性效应。3.1.3
无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration;NOEC试验中低于LOEC的最高受试物测试浓度,即在暴露期间与对照组相比,对受试生物未产生显著效应(p≥0.05)的受试物浓度。3.1.4
个体存活天数number of individual-day;NID个体的总观察期。
注:在此期间,个体均参与繁殖。GB/T 42366—2023
繁殖能力fecundity
生物体的实际繁殖率。
注:由卵群数量或产卵数来衡量。3.1.6
parentanimals
以其繁殖量为试验终点的繁殖成体。3.1.7
繁殖量reproductive output
28d试验周期内,每个存活亲代产生的子代数量。3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
TWA:时间-加权平均值(TimeWeightedAverage)4试验原理
试验主要用于评估受试物对静水椎实螺繁殖量的影响。将用于繁殖的亲螺暴露于一定浓度范围的受试物中,观察螺的存活数和繁殖量,试验周期为28d。椎实螺需取自无寄生物的试验环境,在试验前测量螺的大小,并放入试验容器中驯养。在添加受试物(测试的第0d)后,每天在喂食螺时记录存活率,并将死螺从试验容器中取出。每周至少2次测定螺的繁殖量,收集卵群,并计数。也可用每个卵群中的产卵数以及试验开始和结束时的壳长作为附加的测试终点。试验需记录存活亲螺数量和每个试验容器中卵群的数量。紧殖量反映每个存活亲螺的卵群产量。其他与受试物效应相关的参数,如每个存活亲螺的产卵数和生长情况(壳长)也宜记录。受试物对个体存活天数内每天卵群累积量的毒性效应,以EC,表示。可利用回归模型估算导致繁殖量出现x%下降时的受试物浓度。受试物的毒性效应也可用NOEC和LOEC表示。同一试验中可同时得到EC,值、NOEC和LOEC。5受试物信息
试验前,应掌握下列受试物信息:结构式;
b)纯度;
光稳定性:
试验条件下的稳定性;
解离常数(pKa);
正辛醇-水分配系数(Pow);
按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857测定的快速生物降解性;
水中溶解度:
蒸气压;
受试物在试验溶液中的定量分析方法、方法回收率和定量限。6参比物
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为确保试验条件的一致性和受试生物的敏感性,测试中宜设置参比物试验。已通过验证的参比物为氯化镉,其繁殖量ECs。值范围为40 μg/L~230μg/L(以Cd计)。7试验准备
7.1仪器设备
与试验溶液直接接触的容器及其他设备应由玻璃或其他情性材料制成,常用的仪器设备包括:a)用于控温的人工气候箱、恒温室或其他适用的设备:b)用于调节光照的设备和光照强度的测量设备;c)溶氧仪调节;
d)pH计;
e)电导率仪;
f)用于测量水硬度的试剂盒或其他适用的设备;9)用于测量水中氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐浓度的试剂盒或其他相关的设备;h)1L玻璃容器,可用开孔盖、网或其他器具覆盖,保证容器的透气性且能防止螺从容器内爬出:i)气泵、通气管和巴斯德管
j)气流调节阀;
数显游标卡尺;
1)刀片或尖勺;
m)配有光源的体视显微镜(用于卵的计数);n)用于配制溶液的容量瓶和其他玻璃器皿;0)玻璃滴管。
7.2受试生物
受试生物的选择
试验推荐的受试生物为静水椎实螺(Lymnaeastagnalis)。试验中所使用的成螺应取自同一实验室在无寄生物环境下养的群体。静水椎实螺的驯养环境条件(特别是光照和温度)应与试验环境条件相似(静水椎实螺的驯养程序参考附录A)。野外采集的群体不宜立即用于繁殖试验。7.2.2受试生物的准备
试验开始时,用于试验的静水椎实螺壳长应在2.5cm~3.0cm范围内,使用数显游标卡尺测量最大壳长,检查长度是否满足要求。测量过程中应谨慎操作,不宜破坏壳体,测量或操作过程中需注意保护壳尖。
7.3试验用水
7.3.1试验用水可使用经活性炭过滤脱氯的自来水、重组水或其他清洁用水,水质需符合7.3.2的要求。不宜使用自来水,水管中可能含有或释放金属铜,铜对受试生物具有较大毒性作用,不利于实验室间的结果比对。试验用水宜与饲养液保持一致(见附录A)。试验用水及更换用的水,在使用前的温度和溶解氧浓度应达到试验要求。3
GB/T42366—2023
7.3.2在试验开始及试验期间,水质应达到并维持以下要求:a)pH:6.58.5
b)溶解氧(对照组):大于6mg/L,20℃(即大于60%溶解氧饱和度);c)电导率:600 μS/cm±200μS/cm;d)硬度:140 mg/L~250 mg/L(以CaCO3计),以接近250mg/L为宜。7.4试验溶液
7.4.1可通过稀释备液得到不同浓度的试验溶液。采用振荡、搅拌、超声或者其他适用的方法使受试物溶解至试验用水中以获得贮备液,尽量避免使用助溶剂。对于难测试化学物质,可参考国外关于难测试物质和混合物水生毒性试验的测试方法。7.4.2如使用助溶剂配制稳定均匀的贮备液,宜尽可能降低助溶剂的最终浓度,且最终浓度不应超过20μL/L。如使用助溶剂,试验应增加溶剂对照组作为阴性对照。所有试验处理组和溶剂对照组的助溶剂浓度应一致。助溶剂应对试验生物无任何显著毒性效应。应根据受试物的物理化学参数和对受试生物的敏感性选择合适的助溶剂,宜通过预实验进行验证。8试验程序
8.1暴露条件
8.1.1周期
试验周期为28d。
8.1.2承载量
8.1.2.1试验开始前两天,往试验容器中注入1L干净的试验用水,水温应达到试验要求。使用刷子或平薄的勺子伸入螺体和玻璃的间隙中,收集试验用水中浮动或在缸壁爬行的成螺。移动螺体时宜佩戴手套,可不使用其他特定设备。收集前或收集时损坏的螺不可用于试验,同时应检查壳长是否在2.5cm3.0cm。每组5只成螺,应随机分到装有清洁试验用水和饲料的试验容器中。不同容器间受试生物的平均壳长不应存在显著差异(使用适当的统计学方法进行验证),8.1.2.2在两天的适应期内,需确认成螺在试验条件下可进行繁殖。如未能开始繁殖,适应期需延长至2/3以上试验容器中的成螺开始繁殖为止(至少观察到1个卵群)。适应期内,每周至少更换2次试验用水,移走并处理产生的卵群。在第0d,根据卵群产生量进行随机区组设计,将成螺随机分配到不同处理组中,以保证试验的均匀性。同时更换试验用水,添加受试物。8.1.3喂食
8.1.3.1用清水洗净螺体后,给螺喂食新鲜生菜。推荐采用具备有机认证或同等认证品质的生菜。宜采用结球生菜,或其他叶子平滑的生菜品种。螺一般不会食用叶片的坚硬部分。剩余菜叶不宜在试验容器中堆积,这可能会造成受试物的损失,宜清除。8.1.3.2在试验期内,受试生物自由进食,宜每个工作日喂食,或至少在每周2次更换试验用水时,进行喂食。每只成螺每周自由进食新鲜生菜量约为3.5g。如螺在两次喂食期间完全消耗所提供的食物,应增加投饵量;如观察到由受试物导致的受试生物摄食量下降,应减少投饵量,以防止食物残渣的积累,食物残渣可能会导致氨氮和亚硝酸盐等有害物质的产生。应在换水时从试验容器中取出食物残渣。投饵量会对繁殖量产生影响,如受试生物摄食量减少,应及时记录。4
8.1.4光照条件
GB/T 42366—2023
试验过程中,每天光暗比为16h:8h。光源(波长在天然白光段)应安装在试验容器的上方。试验溶液表面的光照强度范围为2501x~5001x。8.1.5温度
试验过程中,应控制试验溶液的温度为20℃土1℃,可允许在1d~2d内出现短暂性温度偏离,但不应超过±2℃。
8.1.6曝气
8.1.6.1通过玻璃管(巴斯德管)连接气泵对试验溶液进行曝气,使用气流调气阀,以确保连续稳定地供气。
8.1.6.2溶解氧饱和度应大于60%,宜缓慢通气以避免受试物的损失。采用开孔盖、网等覆盖试验容器,可减少受试物的挥发。
8.1.7试验设计
8.1.7.1试验一般为半静态测试,每周换水两次。对于易挥发的受试物,可以增加换水频率以保证受试物的暴露浓度维持在理论浓度的80%以上。静水椎实螺同样也适用于流水式测试。如为流水式测试,应对系统(包括流量)进行调整,以满足试验有效性的要求。8.1.7.2试验至少设置5个浓度,每个浓度6个平行,每个平行5只螺(即每个试验浓度30只螺),试验浓度按几何级数排列,各浓度的间隔系数不大于3.2。如果试验浓度少于5个或浓度间隔系数大于3.2,应在报告中予以说明(如根据预试验的浓度效应曲线进行解释)。提前了解受试物的毒性(如通过预试验),有助于选择合适的试验浓度。如旨在获得NOEC,试验浓度应包括NOEC的预期值。如旨在获得EC,值,无论x是多少,理想情况下,该浓度应包含在试验浓度范围内。8.1.7.3设计试验时,需要考虑试验目的是获得NOEC/LOEC、EC,值还是在理论模型中其他相关的试验终点。如旨在获得NOEC/LOEC,需增设平行数。如旨在估算EC值,则需增设试验浓度。如有必要,可增设试验浓度或各浓度的平行数,以确保有足够的统计数据。8.1.7.4往试验容器中加入受试物即为试验开始时间(第0d)。喂食前应先加入受试物,往装有1L试验用水的试验容器中加入适量的贮备液,搅拌均匀,得到一定浓度的试验溶液。或往装有6L试验用水的容器中加入适量的贮备液,配制一定浓度的试验溶液,搅拌均匀后分装到不同的试验容器中。8.1.8预试验
预试验宜采用最优方案。暴露条件(包括质控要求)应与正式试验一致,但预试验可减少试验浓度的设置、增加相邻浓度间隔系数、各处理组的平行数可减少至4个或缩短试验周期。8.1.9限度试验
如预试验观察到最高浓度组无显著毒性效应,或已知受试物对其他生物无毒性,或摄入量低时,该受试物极可能属于低毒或无毒物质,此时宜开展限度试验。限度试验设有1个处理组(10mg/L浓度处理组或最大水溶解度处理组)和1个对照组。处理组和对照组各设置10个平行。限度试验说明在极限浓度下受试物对受试生物无显著效应,如受试物对个体存活天数内每天产生的卵群数存在显著影响,则需开展正式试验。
8.1.10对照试验
对照组(不含受试物)至少设置6个平行。如配制受试物贮备液时使用了助溶剂,则需增设至少n
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6个溶剂对照平行,且浓度与处理组的助溶剂浓度一致。如为限度试验,对照组平行数应增加至10个。8.1.11试验溶液的更换下载标准就来标准下载网
8.1.11.1对于半静态暴露体系,各试验容器中的溶液至少每周更换2次,以保证暴露浓度在理论浓度的80%以上,同时保证两次连续换水周期之间维持一定的水质理化参数。如受试物可快速降解,更换频率宜增加至每周3次。降解速率可通过前期稳定性试验或受试物的理化参数获取。选择更换时间点时,需保证两次连续更换时间间隔相同(如在星期一早上和星期四下午,两次更换的间隔均为3.5d)。8.1.11.2试验溶液更换可参考以下流程:将溶液从试验容器中缓慢抽出,避免螺在试验容器中翻滚导致壳体损坏。用筛网收集在缸壁和食物残渣中的亲螺,检查残渣中是否有卵群后,清理残渣。用布清理试验容器中的粪便、食物残渣和生物膜,或更换干净的容器。往试验容器重新注入达到温度要求的试验用水后,迅速加入受试物贮备液,搅拌均匀,并将螺放回试验容器中。完成上述步骤后,给螺投喂食物,使螺自由进食。
8.2试验观察
宜在每天喂食时进行观察,每周至少观察2次,记录螺的异常行为(如浮出水面、厌食、聚集、嗜睡、收缩反射迟钝、同类相食)。
8.3死亡率测量
8.3.1死螺很容易辨认,它们会有将螺足伸出壳外的异常行为,可能伴有难闻的气味。死螺会失去收缩反射能力,当用钝针刺激螺足时没有反应即可认定为死亡。8.3.2喂食时记录死螺的数量,将死螺从试验容器中移出并计数。在计算繁殖量时需参考螺的死亡率。8.4繁殖量测量
更换试验溶液时,记录每个平行产生的卵群数量,每周至少2次。用刀片或尖勺小心地将卵群从缸壁上移走并计数。如旨在以产卵数作为附加的测试终点,需统计每个卵群的产卵数和异常卵出现的频次(异常卵的描述见附录B)。将卵群放到培养血中(或其他适用的容器,如6孔板),用立体显微镜进行观察并计数,记录每个卵群的产卵数。计数结束后,速冻处死卵群。8.5生长量测量
8.5.1如旨在以生长量作为附加的测试终点,需使用数字游标卡尺测定成螺壳长。计算处理组和对照组在试验开始和试验结束时壳长的平均生长量。8.5.2测定螺的生长量后,如没有其他测试终点(如组织病理学),试验后的成螺宜通过-80℃速冻或长期冷冻的方式处死。
8.6分析、测定的频率
8.6.1受试物的浓度
8.6.1.1试验期间,应定期测定受试物浓度。结果一般采用实测浓度,如整个测试过程中,试验溶液受试物浓度均达到理论浓度的土20%范围内,则结果既可使用理论浓度表示,也可使用实测浓度表示。8.6.1.2试验开始第一周内更换溶液时(最好在加入受试物贮备液后的第1个小时内),至少测定1次最高浓度和最低浓度试验处理组中新、旧试验溶液的浓度。宜将组内各平行的试验溶液混合后测定。此后每周测定1次。
8.6.1.3当受试物浓度不在理论浓度的土20%范围内,应在更换溶液后分析所有处理组的新、旧溶液。此时,结果应采用平均实测浓度或时间-加权平均浓度来表示(见附录C)GB/T42366—2023
8.6.1.4如受试物浓度分析所需样品体积较多,且取样时易对试验系统产生影响,应增设相同处理的试验平行(包含受试生物)专门用于分析测试,此平行不进行生物学观察。8.6.2物理化学参数
更换溶液前后,每个处理组选取一个平行,使用仪器设备测量新、旧溶液的pH、溶解氧浓度和温度。试验开始和试验结束时至少测定对照组和最高浓度处理组中一个平行的硬度。硬度会影响离子化合物的毒性,对于此类化合物的测试,应在试验开始、中期和结束时测定水的硬度。当在对照组或最低浓度处理组的一个平行中发现较高死亡率时,应测定溶液中氨氮、亚硝酸盐和硝酸盐的浓度。用表格记录所有理化参数值(示例见附录D)。9质量保证与质量控制
如果满足以下条件,试验结果有效:a)试验结束时,对照组中所有平行的平均死亡率不能超过20%;b)试验结束时,对照组每只亲螺个体存活天数内所产的卵群数不少于4个;试验期间溶解氧饱和度不低于60%;c)
d)试验期间水温应维持在20℃土1℃,允许水温出现短暂(1d~2d)的偏离,但不应超过土2℃。10数据处理
10.1结果处理
10.1.1本试验的目的是确定受试物对静水椎实螺繁殖量的影响。应使用表格记录亲螺的存活率和每个试验容器产生的卵群数量(示例见附录E)。其他负面效应如喂食或生长方式的改变、异常行为以及与毒理相关的关键变化,也应记录在最终报告中。10.1.2繁殖量应反映每只存活亲螺在试验期间(28d)卵群的产量。对于任一平行,卵群繁殖量的计算方法是:将某一试验容器在28d内收集的卵群总数除以该试验容器的NID值(见附录F)。10.1.3如必要,可分析其他与受试物相关的效应,如每只存活亲螺的产卵数和平均生长量。对于任一平行,卵繁殖量的计算方法是:将某一试验容器在28d内收集的总卵数除以该试验容器的NID(见附录F)。10.1.4如试验中同时包含空白对照组和溶剂对照组,且它们之间没有显著差异,可将两个对照组合并。当监管部门有相关要求时,可只采用溶剂对照组数据。10.2EC,值的估算
10.2.1采用统计方法对个体存活天数内每天产生的卵群(或卵数)进行拟合和回归分析得到EC,值及置信上下限。本试验推荐使用在静水椎实螺繁殖试验验证过程中开发的软件(详细信息见附录F)。10.2.2试验设计应能得出ECso值、NOEC值和LOEC值,还可得出EC1o值或EC20值,但应通过结果的95%置信区间范围检查所得结果的可信性和生物学相关性。应选择适宜的试验浓度,当设置的试验浓度范围包含ECs。值时,可能得不到准确的EC10值或EC2o值,所得的EC10值或EC20值可能是由最低浓度值外推所得的估算值。当设置的试验浓度范围包含ECo值或ECo值时,可能得不到准确的EC30值,所得的ECs。值可能是由最高浓度值外推所得的估算值。10.3
NOEC/LOEC评估
10.3.1如要确定NOEC或LOEC,应根据相关的文献选择合适的统计学方法进行分析。通常采用单
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