本文件描述了化学品原生动物活性污泥抑制试验的试验原理、受试物信息、参比物、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据处理、报告。 本文件适用于化学品的原生动物活性污泥抑制试验。

ICS13.300;13.020.40
CCS A 80
中华人民共和国国家标准
GB/T42367——2023
化学品
原生动物活性污泥抑制试验
Chemicals-Protozoan activated sludge inhibition test2023-03-17发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-10-01实施
规范性引用文件
术语和定义
试验原理
受试物信息
参比物，
试验准备
试验程序
质量保证与质量控制
数据处理
11报告..．
附录A（资料性）试验用水
附录B（资料性）底物
附录C（资料性）洋地黄皂苷溶液附录D（资料性)浓度-效应曲线
参考文献
GB/T 42367—2023
GB/T42367—2023
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GB/T42367—2023
生活污水处理厂(STP）开展生物处理的原理是将流入的污水中含有的有机物部分转化为微生物生物量，进而将微生物与液体分离得到净化的污水，目的在于最大程度地减少污水中的有机负荷，并减少氨氮、硝酸盐和磷酸盐等营养物质的含量，同时使生物污泥的量最小化。活性污泥的生物吞噬作用对这处理过程起到了促进作用。在传统的污水厂中，通常由纤毛虫主导上述吞噬作用，它们以细菌为食、净化污水，并进一步提高污水的透明度，降低了出水中的有机负荷。本方法目的是评价化学物质对污水处理厂中消费者的影响，这些消费者主要由具有纤毛的原生动物组成。
本试验基于一项国际比对研究，相关试验方法已在5家实验室中得到了验证。上述研究采用了5种假定具有非极性或极性麻醉型毒性作用模式(MOA)的单一组分有机物作为受试物，分别为：1-辛胺(CAS:111-86-4）、3,5-二氯苯酚(CAS:591-35-5)、二甲基亚矾(CAS:67-68-5)、二苯醚(CAS:101-84-8)和六氯酚(CAS:70-30-4)，这些物质的分配系数范围为-1.366.91。如采用本方法对混合物开展测试并将获得的数据用于监管时，需考虑试验结果是否充分且有效。如有法规明确规定可对混合物进行测试，则可直接采用本文件。1范围
化学品原生动物活性污泥抑制试验GB/T42367—2023
本文件描述了化学品原生动物活性污泥抑制试验的试验原理、受试物信息、参比物、试验准备、试验程序、质量保证与质量控制、数据处理、报告。本文件适用于化学品的原生动物活性污泥抑制试验。2规范性引用文件
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GB/T 21801个
化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T21802
GB/T 21803
化学品快速生物降解性改进的MITI试验(I)化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T 21831个
化学品快速生物降解性密闭瓶法试验化学品水溶解度试验
GB/T21845
GB/T 21852
GB/T 21853
GB/T21856
GB/T21857
GB/T22228
化学品分配系数（正辛醇-水）高效液相色谱法试验化学品分配系数（正辛醇-水)摇瓶法试验化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平GB/T22229
GB/T27850化学品快速生物降解性通则EN15934污泥、处理过的生物废弃物、土壤和废弃物通过测定干物质含量或水分计算干物质质量分数(Sluge,treatedbiowaste,soil andwasteCalculation of drymatterfraction afterdetermina+tion of dry residue orwater content)3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
x%效应浓度x%effectiveconcentration;ECr在给定测试周期内，与对照组相比，导致活性污泥吞噬活性降低x%时的受试物浓度。3.2
无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration;NOEC在给定测试周期内，与对照组相比，在统计学意义上对试验组未产生显著效应(p≥0.05)）的最高受试物浓度。
GB/T42367—2023
4试验原理
4.1本方法用于评估特定条件下不同浓度的化学物质对活性污泥吞噬作用（即分散细菌的消耗)的影响，适用于可溶于水、难溶于水和挥发性的受试物。对于水溶解度有限的受试物，可能无法得到ECs0值。对于挥发性的受试物，尽管试验过程中使用密闭的试验容器，但仅当暴露期结束时仍有大于80%的受试物留存在反应体系中时，试验结果才是有效的。难测试化学物质的试验见参考文献4.2采用2mL培养体积的玻璃试验瓶，将活性污泥样品暴露于受试物。试验瓶用氧渗透型瓶盖密封后置于22℃土1℃振荡22h。试验开始时，污泥样品中的原生动物以悬浮细菌为食，导致对照组中细菌浊度降低，但受到化学抑制的试验组中细菌未被消除。为广量化原生动物的春噬活性，分别在培养2h(t1)和22h(t2）测定光密度（入=440nm)，以获得所添加细菌随时间的减少量。基于两个光密度值的差异，计算与未经处理的对照组相比春噬活性减少的百分比。本试验通常用于确定受试物的EC2（如ECso)。为补偿添加的细菌底物与污泥絮体之间的非特异性反应（如结合作用)或受试物对污泥样品浊度的影响（如解聚作用），空白对照组和每个浓度的试验组中都应包括去除原生动物（因而无春噬作用）的污泥平行样品。5受试物信息
试验前，应掌握下列受试物信息，a）结构式；
纯度；
按照GB/T21852和GB/T21853测定的正辛醇-水分配系数；c)
按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T27850、GB/T21856和GB/T21857测定的快速生物降解性：按照GB/T21845测定的水中溶解度，尤其是受试物在试验条件下的水溶解度：e
f）按照GB/T22228和GB/T22229测定的蒸气压；水溶解度和蒸气压可用于计算亨利常数，以表征受试物的挥发性；
g）受试物在试验溶液中的定量分析方法。6参比物
参比物测试作为一种技术手段，用于验证试验条件是否符合要求。3.5-二氯苯酚对活性污泥吞噬作用抑制的ECso在1.5mg/L～5.1mg/L范围内。由于EC3。值可能因试验所用的污泥不同而具有显著差异，上述EC5o值范围仅供参考，并非满足试验有效性的必要条件。参比物的试验结果应在测试报告中注明。
7试验准备
7.1试验设备
常规设备包括：
a）透明玻璃螺口瓶，45mmx15mm（外观尺寸），体积4mL；b）开孔盖(开孔螺纹盖)，特氟龙表面、硅胶衬垫：c）转速可调至250r/min的旋转振荡器，其支架可使试验瓶呈倾斜状，与水平面呈20°~40°2
夹角；
d）光度计（入=440nm)；
e）保温柜或保温室，温度可维持在22℃土1℃。7.2试验用水
7.2.1宜用合成水稀释活性污泥并配制系列浓度的受试物溶液，其组分见附录A。GB/T42367—2023
7.2.2某些情况下可能需要对试验用水进行调整，如在不同的pH条件下开展测试时。使用经调整的试验用水应具有充分的理由，并予以详细描述，7.3接种物
7.3.1选择来源于运行良好且主要处理生活污水的处理厂曝气池的活性污泥作为吞噬试验的接种物。采集活性污泥时应避免浮渣，且不在浮渣累积的死角处进行采集。将采样工具完全浸没至液面下取样，如采样过程中取样瓶发生飘浮，可将玻璃瓶轻轻倾斜或用玻璃棒进行手动搅拌，易使表层沉降至瓶底部。
7.3.2试验前应获悉污泥的干重，悬浮物固体浓度的适宜范围为2g/L～4g/L。通常情况下，污水处理厂持续性地对污泥浓度开展日常监测。如无法获得干重数据，应开展实际测定：将污泥在60℃下干燥至恒重，精确至0.1mg。如已经测定了干物质或含水率，也可采用其他替代的标准方法如EN15934或类似标准，计算干物质质量分数。根据干重结果计算原始活性污泥悬浮液的添加体积。应将污泥悬浮在2mL测试体系中，以获得悬浮固体质量浓度为0.9g/L±0.1g/L的活性污泥混合液。7.3.3活性污泥应于采集当天使用。如未当天使用，应将整批未经稀释的原始污泥置于4℃7℃冰箱中保存，最长不超过一周。
7.4底物
7.4.1具有较低的聚集、絮凝和活性污泥絮团吸附特性的细菌可作为底物使用，满足上述要求且适合作为污泥中原生动物食物源的细菌底物见附录B，也可使用符合试验有效性标准的其他菌株。7.4.2根据验证试验结果，用于喂食的细菌质量浓度宜为0.36g/L（干重）。该浓度可确保充足的食物供给和可靠的光密度(OD)测定。7.5受试物
7.5.1试验开始时，用试验用水稀释贮备液以制备新鲜的预稀释系列试验溶液。针对难溶性受试物首选采用超声波分散或其他适用的物理方法溶解受试物。某些情况下溶剂可用于制备适当浓缩的贮备液，如丙酮、乙醇和二甲基亚等均可用作载体溶解低水溶性受试物。由于二甲基亚矾具有低毒性，其浓度应尽可能低，例如不超过0.1mL/L，随后在添加污泥之前将其挥发。应尽可能采取措施以避免使用溶剂类物质，如确实需要使用，则应在试验中增设溶剂对照组，且该溶剂不应明显抑制吞噬活性。7.5.2试验时不应调节pH。如pH可能有较大变化，应将贮备液的pH调节至7土1[必要时用盐酸和氢氧化钠(NaOH）进行调节]。pH的调节不应使贮备液的浓度发生明显变化，且不应导致受试物发生化学反应或沉淀。
7.6无吞噬对照
7.6.1由于部分细菌底物可能形成聚集体或附着于污泥絮凝体上，从而改变上层悬浮液的浊度。此外，化学品(尤其是高浓度时)可能对活性污泥的絮凝体结构产生影响，导致浊度增加。因此有必要设置无春噬作用的对照组，以反映试验体系中由手被动的、非特异性的反应所导致的浊度变化7.6.2真核生物抑制剂洋地黄皂苷(CAS:11024-24-1）已被证明是一种有效的特异性吞噬作用抑制剂en
GB/T42367—2023
可以完全去除活性污泥中的原生动物。为获得无吞噬作用的数据，空白对照组和所有浓度的试验组中都应包括洋地黄皂苷终质量浓度为200mg/L的平行样品，洋地黄皂苷溶液的配制见附录C。7.7试验条件
7.7.1周期
连续振荡22h。
7.7.2容器
带透氧螺旋盖的玻璃瓶。
7.7.3光照
试验应在黑暗中进行。
7.7.4温度
22℃±1℃。
7.7.5供氧
整个试验期间，采用250r/min快速振荡试验瓶的方式来维持充足的氧气供应。试验体积不宜超过2mL（装于4mL试验瓶中），试验瓶应用透氧型瓶盖密封，并与水平面呈40°。8试验程序
8.1平行和对照
试验设计应包括每个试验浓度3个平行(n=3）和6个空白对照平行(n=6）。如使用溶剂，应增设6个溶剂对照平行。每项测试都应包括具有相同数量的无吞噬作用平行（每个浓度3个平行和6个对照平行），含有质量浓度为200mg/L的特异性抑制剂洋地黄皂苷。如需要，应单独制备试验溶液（每个浓度1个平行）用以分析测定受试物浓度。每项测试不少于5个试验浓度，浓度宜按几何数列设置（间隔系数不超过2.0）。最低浓度对生长应无可观察效应，最高试验质量浓度至少为100mg/L，且与对照组相比，最少抑制50%的生长，最好完全抑制生长。出于统计上的原因，试验浓度范围宜将50%的效应水平包括在内。
注：洗涤剂洋地黄皂苷选择性地使真核生物而非细菌细胞的细胞膜具有通透性。加入洋地黄皂苷，一方面提供了吞噬活性完全受到抑制的对照平行：另一方面可以测定所添加的细菌悬浮液（即营养底物）产生的被动反应8.2测定
试验周期为22h。剧烈振荡试验瓶，使污泥沉降30min后，采用分光光度法（440nm）测定培养2h（t1）和22h(t2）后上清液的光密度。吸光度法是一种非侵入性评价污泥样品中已发生的吞噬活性的快速方法，在试验条件下光密度与细菌量成正比8.3预试验
如缺乏受试物对细菌的毒性数据，则应开展预试验，以确定吞噬活性对受试物0%100%的耐受范围。预试验应至少包括5步稀释，稀释系数为10，稀释的初始质量浓度为1000mg/L或受试物的最大溶解度。优先选用低于受试物水溶解度的浓度开展试验，但受试物的不溶部分也可能有抑制作用。4
8.4限度试验
GB/T42367—2023
在某些情况下，如预试验表明受试物在100mg/L或其水溶解度上限（以较低者为准)时无毒，则需开展限度试验，包含一个对照组和一个试验组（质量浓度为100mg/L或受试物最大溶解度）作为对比，应分析暴露浓度。前述所有试验条件和有效性标准均适用于限度试验，但试验组的平行数应增加一倍。对照组和试验组的生长情况可采用统计检验进行均值比较。8.5其他观察
可通过显微镜观察并验证接种物活性污泥的外观是否正常和健康，并观察细菌进食者尤其是原生动物的异常表现。
8.6受试物浓度分析
8.6.1针对高挥发性或强吸附性的受试物，有必要测定试验瓶中受试物的浓度。试验期间暴露浓度相对于配制浓度的变化小于20%时，在试验开始和结束时选择一个低浓度、高浓度和在预期EC5o附近的试验组进行分析。当浓度无法维持在配制浓度的80%120%范围内时（例如受试物的挥发性和吸附性较强），则宜在试验开始和结束时对所有浓度的试验组进行分析。任何情况下，测定受试物浓度时仅需选择各试验组中某一个平行进行分析即可，或将各试验组所有平行的样品合并后分析。8.6.2专门用于分析暴露浓度的样品应采取和试验样品完全相同的制备方法，应对其接种活性污泥、提供营养，并在相同条件下培养。如需分析溶解的受试物浓度，则有必要将固体组分与水相分离。宜采用离心法分离，以使活性污泥和悬浮的细菌底物充分沉降。8.6.3如有证据表明试验期间受试物的浓度能较好地维持在理论浓度或初始实测浓度的土20%范围内，试验结果可以基于理论浓度或初始实测浓度。暴露浓度如相对于理论浓度或初始测试浓度的偏差大于20%，则试验结果应基于暴露期间实测浓度的平均值。9质量保证与质量控制
如满足以下条件，试验结果有效a）在2h～22h试验周期内，对照组因吞噬作用而导致的OD下降应超过30%；b）在试验周期内，OD的非特异性减少（含细菌底物的去原生动物对照组）应不超过25%；如某个受试物浓度下去原生动物平行的样品中OD平均上升超过5%，在效应统计时应排除c)
该浓度。
10数据处理
10.1结果处理
以测得的光密度(OD4O）表征试验容器中悬浮细菌的含量，将受试物试验组和对照组测得的光密度与受试物浓度和测定时间一同绘制成表格。根据培养2h和22h测定的光密度之差按式（1）计算吞噬活性：免费标准下载网bzxz
△ OD=OD2 h_OD2 h
式中：
不含洋地黄皂的对照组和试验组在2h和22h的光密度差。.
为了校正非特异性光密度变化（例如由细菌底物的结合、络合、裂解或受试物的抗累凝作用等导GB/T42367—2023
致），试验设计应包括经洋地黄皂苷处理的去吞噬活性的平行，并根据式（2）在上述△OD中减去它们光密度的变化值△OD4（2h的光密度值减去22h的光密度值）：AoDa=ODa.2h—ODa.22h
式中：
含洋地黄皂苷的对照组和试验组在2h和22h的光密度差。为了补偿非特异性光密度的变化，对照组和试验组中所有平行均应按式(3)进行校正：AoD。=△oD-AoDa
式中：
△OD一-不含洋地黄皂苷的对照组(n=6）和试验组(n=3）中单个平行的△OD值；OD4
10.2试验结果
含洋地黄皂苷对照组(n=6）和试验组(n=3）在2h和22h的OD差值的平均值。对照组OD下降百分率（质量保证的要求之一）按式（4)计算：p
式中：
AOD。
△OD1,2h-
对照组OD下降百分率；
对照组△OD平均值减去对照组△ODa平均值的差，n=6:所有对照平行(n=6)在2h的OD平均值(t=2h的初始OD)。.(4)
对于无吞噬活性的含洋地黄皂苷对照组，非特异性OD下降百分率（质量保证的要求之一）按式（5）计算：
式中：
AOD1.a.2h
X 100%
含洋地黄皂苷对照组的非特异性OD下降百分率：含洋地黄皂苷对照组(n=6）在2h和22h的OD差值的平均值：++. (5)
含洋地黄皂苷对照组(n=6)在2h的OD平均值(t=2h的初始OD)。某个浓度受试物对其去原始动物平行中光密度的效应(质量保证的要求之一)按式(6)计算：P..
式中：
一某浓度含洋地黄皂苷试验组(n=3）的OD变化百分率：AOD2，
一某浓度含洋地黄皂苷试验组(n=3）在2h与22h的OD差值的平均值；6
△OD2.2h——某浓度含洋地黄皂苷试验组(n=3）在2h的OD平均值(t1=2h的初始OD)。10.3吞噬活性的减少
每个受试物浓度的试验组中每个平行吞噬活性的抑制程度表示为对照组吞噬活性平均值的百分比，按式(7)计算：
×100%
式中：
一一某浓度试验组中某个平行吞噬活性的抑制率；GB/T 42367—2023
△OD2
一某个浓度试验组中某个平行在2h和22h经校正的OD差值，即△OD2减去△ODa平均值的差：
对照组和含洋地黄皂苷对照组的经校正的OD差值的平均值，即△OD平均值减去△ODa平均值。
如使用溶剂制备受试物溶液，则应采用溶剂对照而非空白对照来计算抑制率。10.4绘制浓度效应曲线
将每个试验瓶（平行）的抑制率与受试物浓度的对数（每个浓度试验组n=3）作图，比较抑制曲线，可参考附录D绘制曲线。曲线应包括每个平行（每个浓度试验组n=3）相应地去除原生动物对照中非特异性OD变化的数据，按照式(8)计算：Ps-0D×100%
式中：
一一某浓度含洋地黄皂苷试验组中某个平行的OD变化百分率；△OD2,d--—某浓度含洋地黄皂苷试验组中某个平行在2h与22h的OD差值；(8)
△OD2,a,2h一某浓度含洋地黄皂苷试验组(n=3）在2h的OD平均值(ti=2h的初始OD)：10.5EC值的估算
10.5.1通过统计方法推导EC，值。将所有数据除以对照组的校正数据（对照组所有平行的平均值)进行标准化，采用非线性回归方法对浓度对数拟合浓度-效应曲线。宜在基于三参数和四参数(对称和不对称)S型函数的基础上计算EC5。值。将每个平行视为一个独立的点，曲线顶部和底部的停滞期分别被限制为0%和100%，只考虑效应在0%～100%的数据点（某些受试物在低浓度时可以刺激生长，称为毒物兴奋效应）。应报告EC，值及其95%置信限。10.5.2当所获数据不足以采用标准曲线拟合的方法计算EC5。值时，可采用无效应的最高浓度和产生100%抑制效应的最低浓度粗略估算EC5（通常是这两个浓度的几何平均值）。11报告
测试报告应包括以下内容。
a）受试物：
1）单组分物质：物理性状、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如IUPAC名称或CAS名称、CAS号、SMILES码或InChI编码、结构式、纯度等信息，在适当情况下还应提供杂质的化学鉴别信息（必要时包括有机碳含量），2）多组分物质、不明复杂物质(UVCBs）（成分未知或组分多变的物质、复杂反应产物或生物材料）和混合物：尽可能提供各组分的化学鉴别信息（如上）、含量和相关的物理-化学特性。
b）活性污泥：来源、污水处理厂的运行条件及进水情况、干重、采样日期、储存条件、预处理方式等。
c）试验条件：
1）试验开始和结束的日期；
2）活性污泥浓度（混合液悬浮固体）；
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