本文件规定了使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂急性经口毒性的试验原理、试验方法、结果计算与表示、质量保证与质量控制和试验报告。本文件适用于使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂的急性经口毒性。

ICS13.300;13.020
CCS A 80
中华人民共和国国家标准
GB/T42475—2023
化学品
中华蜜蜂急性经口毒性试验
Chemicals-Apis cerana cerana Fabricius acute oral toxicity test2023-03-17发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-10-01实施
GB/T42475—2023
本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会(SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：中国科学院生态环境研究中心、北京科润天朗环境技术有限公司、中检科健（天津)检验检测有限责任公司、中国检验检疫科学研究院、厦门尹巢科技有限公司、广东铭凯科技有限公司、浙江辉日环境检测有限公司、金久科技有限公司。本文件主要起草人：万斌、王会利、李建中、徐鹏、李伟、王瀛寰、韩永涛、张艳峰、姜福平、周丽丽、李季、易仲辉、万青兰、毛晓尧。1范围
化学品中华蜜蜂急性经口毒性试验GB/T 42475—2023
本文件规定了使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂急性经口毒性的试验原理、试验方法、结果计算与表示、质量保证与质量控制和试验报告。本文件适用于使用小烧杯法和饲喂管法测定化学品对中华蜜蜂的急性经口毒性。2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件：不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB5749生活饮用水卫生标准
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
急性毒性acutetoxicity
生物体短时间(1d～4d)内一次或多次暴露于某种化学物质而产生的明显不良反应。注：在本试验中，急性经口毒性用半数致死浓度(LC0)来表示，即在特定时间内(最高96h)导致50%数量的受试蜜蜂死亡的物质浓度。
4试验原理
用受试物与蜂蜜水混合成不同浓度的溶液饲喂中华蜜蜂，生物学背景见附录A。以48h为一个试验周期，在24h、48h时记录蜜蜂的死亡数，并计算各组死亡率，分别确定50%试验蜜蜂死亡时的受试物浓度，用24h-LC30或48h-LC30表示。若研究时间延长，则继续记录72h、96h蜜蜂的死亡数5试验方法
5.1仪器设备
5mL小烧杯、温度控制及连续测温设备、加湿器及温湿度仪、饲喂管、精密天平（至少精确到±0.1%)。
5.2试验容器
试验容器可为长、宽、高分别为10cm、10cm和10cm，以网纱衬里的蜂笼；或恒温恒湿培养箱，以保证试验温度和湿度稳定。当受试物具有挥发性时，实验室应装有通风装置；当受试物不具有挥发性时，试验容器底部、顶部应开。试验前对容器进行清洗，干燥后备用。将试验容器在试验区域随机放GB/T42475—2023
置。使用分组设计可以控制实验室中的系统影响，每个区域每个处理组应随机设计。试验过程中，容器应避免不必要的干扰，如搬动或移动容器、人员频繁走动。5.3受试蜜蜂
中华蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius)成年工蜂，试验应选择同一批体长和年龄相似的成年工蜂。人工饲养的成年工蜂在试验前需要转入到试验用蜂笼进行为期一周的化，在驯化期间饲喂试验用蜂蜜水或蔗糖水，没有出现明显死亡状况则可以选取身体健康、大小一致的工蜂进行试验。受试中华蜜蜂的驯养方法按照附录B进行。5.4试验用水
试验用水使用饮用水（需除氯）或纯净水应符合GB5749的要求。除氯后的试验用水中氯化物含量应小于或等于250mg/L。试验用水的pH应为6.5～8.5。5.5试验条件
试验在23℃~27℃、相对湿度为50%～70%的黑暗环境中进行；试验开始2h前停止喂食，试验过程中用小烧杯法或饲喂管法进行喂食；对照组中试验蜜蜂的存活率应大于90%。5.6受试样品制备
将已知量的受试物溶于一定体积去离子水或蒸馏水中。如果受试物为水溶性，则可直接溶于喂饲的蔗糖溶液中。贮备液应当天配制。对于化学性质较稳定的物质，可配制供2d以上使用的溶液，配好后低温保存。对于水溶解度低的物质，可使用超声波分散混匀，也可加入对蜜蜂低毒的有机溶剂、乳化剂或分散剂助溶（如二甲基亚砜、二甲基甲酰胺、丙酮等)，配制试验物质储备液应使用分析纯试剂。所有受试物测试浓度组中助溶剂的用量应该相同，且其浓度一般不超过1%。贮备液的配制推荐使用机械方式（例如搅拌或超声），使受试物在稀释水中进行简单的混合或搅动。通过稀释储备液来配制所选定浓度的试验溶液。
5.7试验步骤
5.7.1预试验
5.7.1.1剂量设置
正式试验前先进行预试验，以确定试验中的浓度范围。配制一系列浓度，该系列浓度一般以10为等比做间距，例如：0.1mg/L、1mg/L、10mg/L、100mg/L、1000mg/L,也可根据需要以其他公比进行配制。设空白对照组，对照组至少设置3个重复，如果使用助溶剂还应增加溶剂对照组5.7.2预试验方法
5.7.2.1小烧杯法
试验可在长、宽、高均为10cm的网纱衬里的木质蜂笼中进行。用质量浓度为0.5g/mL的蜂蜜水与药剂母液混合，按等比序列配制成不同浓度的药液。取10mL配制好的药液移至放有脱脂棉的5mL小烧杯内，再将小烧杯倒扣于蜂笼顶部供蜜蜂取食。每个蜂笼放20只成年工蜂。每个处理组（包括空白对照组）设置3个重复。试验开始后每隔24h检查、记录各组蜜蜂中毒和死亡情况。5.7.2.2饲喂管法
试验在网纱衬里的木质蜂笼中进行。笼顶部安装一个饲喂管，供试蜜蜂可将喙伸入管内吸取药液。2
GB/T42475—2023
药液配制同小烧杯法，将10mL配好的药液放入饲喂管中供蜜蜂取食。每4h记录一次药液消耗量。每只笼中一次性移入20只成年工蜂。每处理（包括空白对照）设置3个重复。在小烧杯法与饲喂管法结果不一致的情况下，以饲喂管法为仲裁法。5.7.3正式试验
5.7.3.1剂量设计
在预试验中，根据蜜蜂最低全致死浓度与最高全存活浓度之间，以几何级数做间距，公比不超过2.2，至少选择5个浓度为正式试验的浓度，使死亡率分布在0%～100%。其浓度范围在3个依次的几何系列浓度中最好能够测得20%～80%的死亡率以估算LCso值。5.7.3.2试验方法
每个浓度组至少设置3个重复，供试蜂数量至少为20只，测试持续时间为48h。试验初始的4h,观察蜜蜂死亡数，从结果中减去。每隔24h对蜜蜂进行观察。如果试验蜂蜷缩于蜂笼底部不动，可视为已死亡。同时，记录内容还应包括各种观察到的异常行为（如蜜蜂在笼底部乱转，挤成一堆等）。记录24h、48h的蜜蜂死亡数，对试验数据进行数理统计，求出LCs。值及95%置信限。如研究时间延长，可记录直至96h。化学品浓度、重复次数、死亡率和症状样本数据记录见附录C5.7.3.3饲喂管法应每天补充添加药物的蜜水，以保证蜜蜂随时取食。5.7.4限度试验
在预计一种受试物为低毒等情况下，应进行限度试验，以确定LC。是否大于限度值。在本文件规定的试验条件下，若受试物的最大水溶解度大于2000mg/L时，则以2000mg/L为限度试验浓度进行试验。若受试物的最大水溶解度无法达到2000mg/L，则以受试物在介质中的最大水溶解度（或者是形成稳定分散溶液的最大浓度）为限度试验浓度进行测定。取20只中华蜜蜂成年工蜂进行试验，试验时间为48h，试验结束时若无受试蜂死亡，则不再进行下一步试验。限度试验中若有死亡发生，应进行完整试验。如果观察到致死效应，则应进行记录。试验结果以48h-LC。大于该物质的最大水溶解度或大于2000mg/L表示。
6结果计算与表示
中华蜜蜂急性经口毒性半数致死剂量LCsO值的计算可采用寇氏法、直线内插法或概率单位图解法估算，也可应用有关毒性数据计算软件进行分析和计算。7质量保证与质量控制
7.1正式试验至少设3组重复试验。试验结束时，对照组死亡率不应超过10%。如果在第一个24h之后死亡率持续增加了10%以上，则需要延长实验，最长至96h。7.2试验期间，试验环境温度恒定控制在23℃~27℃，相对湿度控制在50%～70%，且在黑暗环境下。
7.3试验开始前，检测配制的受试物实际浓度，应不低于理论浓度的80%。8试验报告
试验结果报告应包括以下内容：GB/T424752023
受试物物理性质和相关物理化学性质；化学标识数据，包括受试物的纯度及定量分析方法；中华蜜蜂大致年龄(周)、采集方法、采集日期、健康状况、是否处理等信息：蜂蜜水来源及配置方法：
贮备液的制备方法，如果受试物难溶于水，则记录配制贮备液和试验液的方法，所用助溶剂物质的浓度；
温度、湿度条件，保证试验全过程黑暗：选择试验方法的原因和详细过程；试验设计（如试验容器数量、试验浓度、重复）；试验理论浓度、实测浓度平均值和试验容器间标准差，以及分析试验方法：所用化学分析法的方法步骤以及试验结果；如果进行了限度试验，报告结果；在每次建议的观察时间，记录各浓度下的累积死亡数及对照组结果；试液浓度及每一推荐观察时间的LC5o值（置信度95%）；一试验过程中死亡率为0的最大试验浓度(LC。），试验过程中死亡率为100%的最小试验浓度(LC10);
蜂所有异常反应的发生率，以及所有因受试物而引起的反应。附录A
(资料性)
中华蜜蜂生物学背景资料
GB/T42475—2023
中华蜜蜂(ApisceranaceranaFabricius),动物界，节肢动物门，昆虫纲，膜翅目，细腰亚目，蜜蜂科。文称中华蜂、中蜂、土蜂，是东方蜜蜂的一个亚种，是中国独有的蜜蜂当家品种，是以杂木树为主的森林群落及传统农业的主要传粉昆虫，有利用零星蜜源植物、采集力强、利用率较高、采蜜期长及适应性、抗螨抗病能力强等优点。中华蜜蜂工蜂腹部颜色因地区不同而有差异，有的较黄，有的偏黑；吻长平均5mm。蜂王有两种体色：一种是腹节有明显的褐黄环，整个腹部呈暗褐色；另一种是腹节无明显褐黄环，整个腹部呈黑色。雄蜂一般为黑色。南方蜂种一般比北方的小，工蜂体长约10mm～13mm雄
蜂体长约11mm13.5mm蜂王体长约13mm～16mm。成年工蜂体长约10mm±2mm。
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附录B
(资料性)
受试中华蜜蜂的驯养方法
春夏季节将中华蜜蜂蜂箱置于实验室外搭建的遮雨棚内，定期查看蜜蜂酿蜜情况，酌情给予一定的蔗糖水或蜂蜜水防止食物短缺。中华蜜蜂飞行敏捷，嗅觉灵敏，出巢早、归巢迟，每日外出采集的时间比意大利蜂多2h～3h,善于利用零星蜜源。造脾能力强，喜欢新脾，爱啃旧脾；抗蜂螨和美洲幼虫腐臭病能力强，但容易感染中蜂囊状幼虫病，易受蜡危害；喜欢迁飞，在缺蜜或受病敌害威胁时特别容易弃巢迁居；易发生自然分蜂和盗蜂；不采树胶，分泌蜂王浆的能力较差；蜂王日产卵量比西方蜜蜂少，群势小。冬季天冷后，于蜂箱内添加隔温板，往蜂排上添加一定量蜂蜜水以备蜂群过冬，并于蜂箱上添加稻草。如果温度仍然较低，可以将蜂箱转移到温室内。温室内种植草莓等蜜源植物，蜜蜂可以为其授粉，提高产量，丰富的蜜源也有利于蜜蜂生存，为毒理试验提供活力强的中华蜜蜂。注意定期检查蜂箱，及时清除闯入蜂箱的外族蜂，以防中华蜜蜂受攻击。保持蜂箱周围整洁干燥，防止传染病发生。受试蜜蜂的选择：应在试验温度的饲养室饲养一周以上，饲喂与试验中种类相同的足量蜂蜜水。训化期间，记录死亡率并按照以下的标准评判。1)7
d内试验蜂死亡率大于10%：舍弃整批蜂。d内试验蜂死亡率在5%～10%：再饲养7d；如果接下来的7d内试验蜂死亡率小于5%：接收本批蜂；如果接下来的7d内，试验蜂死亡率超过5%，舍弃整批蜂。d内试验蜂死亡率小于5%：接收本批蜂。3)7
保证试验中使用的蜂没有明显疾病，舍弃所有病蜂。试验期间及试验前两周不应对蜂做任何疾病处理。经抗生素等化学物质处理的蜜蜂，在最后一次处理结束后的4周内不应用本试验驯养期间环境记录见表B.1，饲养记录见表B.2。表B.1蜜蜂养环境记录表
控温空间面积：免费标准bzxz.net
温度：T=
控温方式：
相对湿度：
温度/℃
温度/%
%(相对湿度）
异常情况及处理记录
记录人
活动状况
蜜蜂饲养记录表
有无蜂王
病虫害
GB/T 42475—2023
记录人
GB/T424752023
附录C
(资料性)
样本数据记录表
化学品浓度、重复次数、死亡率和症状样本数据记录表见表C.1。表C.1化学品浓度、
重复次数、死亡率和症状样本数据记录表日期(精确到时间)：
温度：
备注：
计算所采用方法：
LCs。值：
死亡数
观察周期：
湿度：
95%置信限：
记录人：
光照：
死亡数
参考文献
［1]OECD
No.213《蜜蜂急性经口毒性试验》（1998年）GB/T
424752023
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