GB/T 38421-2019.Fur- Detection of animal derived materia l-Qualitative real-time polymerase chain reaction ( PCR) methods.
GB/T 38421规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光PCR检测方法。
GB/T 38421适用于八种天然毛皮(水貂、兔、貉子、浣熊.马、牛、山羊和绵羊)的源性成分定性检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产 品检测实验室 技术要求
GB/T 21102- -2007动物 源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光 PCR方法
GB/T 25165- -2010明胶中牛 .羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光 PCR法.
3术语和定义、缩略语
3.1术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1.1实时荧光聚合酶链式反应real-time poly merase chain reaction在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累,实时监控整个PCR进程,并通过扩增曲线对未知模板进行定性分析的方法。
注:改写GB/T 19495.4-2018 ,定义3.1.2.
3.1.2Ct值cycle threshold每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。
[GB/T 19495.4-2018 ,定义3.1.5]
3.2缩 略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA:脱氧核糖核酸( deoxy ribonucleic acid)
DTT:二硫苏糖醇(dithiothreitol )
dNTPs:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
FAM:6-羧基荧光素(6-carboxy-fluorescein)
NaxEDTA:乙二胺四乙酸钠盐(ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt)

ICS59.140.30
中华人民共和国国家标准
GB/T 38421—2019
源性成分检测
实时荧光定性
聚合酶链式反应（PCR)检测方法Fur-Detection of animal derived material--Oualitative real-timepolymerase chain reaction (PCR) methods2019-12-31发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2020-07-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由中国轻工业联合会提出。本标准由全国皮革工业标准化技术委员会（SAC/TC252)归口。GB/T38421—2019
本标准起草单位：广州检验检测认证集团有限公司、国家皮革质量监督检验中心（浙江）、深圳华大基因科技服务有限公司、浙江方圆检测集团股份有限公司、中国皮革制鞋研究院有限公司、陕西科技大学、中国计量大学、东莞市惟思德科技发展有限公司。本标准主要起草人：覃芳芳、黄新霞、孙海陆、陈宗良、王学川、冯爱明、张弛、孙霞、赵洋、章文福1
1范围
毛皮源性成分检测实时荧光定性聚合酶链式反应（PCR）检测方法本标准规定了天然毛皮中动物源性成分定性分析的实时荧光PCR检测方法，GB/T38421—2019
本标准适用于八种天然毛皮（水貂、免、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊)的源性成分定性检测规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求GB/T21102一2007动物源性饲料中兔源性成分定性检测方法实时荧光PCR方法GB/T25165一2010明胶中牛、羊、猪源性成分的定性检测方法实时荧光PCR法术语和定义、缩略语
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1.1bZxz.net
real-timepolymerasechain reaction实时荧光聚合酶链式反应
在聚合酶链式反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，实时监控整个PCR进程，并通过扩增曲线对未知模板进行定性分析的方法。注：改写GB/T19495.4—2018，定义3.1.2。3.1.2
Ct值cyclethreshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。［GB/T19495.4—2018，定义3.1.5]3.2缩略语
下列缩略语适用于本文件。
DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）DTT：二硫苏糖醇（dithiothreitol）dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein）NazEDTA：乙二胺四乙酸钠盐（ethylenediaminetetraaceticaciddisodiumsalt）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）SDS：十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）GB/T38421—2019
TAMRA：6-羧基四甲基若丹明（6-carboxy-tetramethylrhodamine）Taq酶：DNA聚合酶（TaqDNApolymerase)Tris：三羟甲基氨基甲烷[（hydroxymethyl)methylaminomethane18SrRNA：真核生物核糖体小亚基18S基因（18SribosomalRNA）4原理
提取动物毛皮试样中的DNA，针对水貂、免、貉子、浣熊、马、牛、山羊、绵羊物种特异性的内源基因序列设计引物，通过特异性引物和标记荧光物质探针，对动物源性的DNA进行实时荧光PCR扩增，根据PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的强弱判定，实现对毛皮中动物源性成分的定性分析。5试剂和材料
一般规定：除非另有说明，所用试剂均为分析纯·试验用水应符合GB/T6682中一级水的规定。5.2灭菌水。
3氢氧化钠(NaOH)。
三羟甲基氨基甲烷(Tris)。
盐酸（HCI)。
乙二胺四乙酸钠盐（NazEDTA）。5.7
十二烷基硫酸钠（SDS)。
5.8氯化钠。
乙酸钠。
冰乙酸。
蛋白酶K（20mg/mL），一20℃条件下保存。二硫苏糖醇(DTT)。
苯酚（Tris平衡酚pH7.0~8.0）。三氯甲烷。
异丙醇。
无水乙醇。
乙醇溶液（体积分数75%）：取75mL无水乙醇（5.16），加水定容至100mL。Tris-HCI缓冲液（1mol/L，pH=7.6和pH=8.0)：称取121.1g三羟甲基氨基甲烷（5.4)，溶于800mL水中，冷却至室温，用盐酸（5.5)调节pH至所需值，加水定容至1L,121℃条件下高压灭菌20min5.19Na?EDTA溶液（0.5mol/LpH=8.0）：称取186.1gNaEDTA（5.6），溶于700mL水中，用氢氧化钠（5.3）调节pH至8.0.加水定容至1L,121℃条件下高压灭菌20min。5.20氢氧化钠溶液（5mol/L）：称取40g氢氧化钠（5.3)溶于100mL水中，冷却后，加水定容至200mL5.21
氯化钠溶液（5mol/L）：称取58.44g氯化钠（5.8）溶于100mL水中，加水定容至200mL。SDS裂解缓冲液：在500mL水中分别加入100mLpH为7.6的Tris-HCl缓冲液（5.18）、5.22
100mLNazEDTA溶液（5.19）、100mL氯化钠溶液（5.21）和5gSDS（5.7），完全溶解后加水定容至1L.121℃条件下高压灭菌20min
5.23乙酸钠溶液（3mo1/L，pH5.2）：称取49.21g乙酸钠（5.9）.溶手120mL水中，用冰乙酸（5.10）调节pH至5.2.加水定容至200mL。5.24TE缓冲液：在800mL水中分别加人10mLpH为8.0的Tris-HCl缓冲液（5.18）和2mLNazEDTA溶液（5.19），加水定容至1L，121℃条件下高压灭菌20min。5.25DNA吸附柱。
DNA提取试剂盒。
GB/T38421—2019
实时荧光PCR试剂盒，包括Taq酶、dNTPs、PCR体系缓冲液等，按试剂盒要求保存水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊基因组DNA，0℃～4℃条件下保存引物和探针：所需引物和探针信息见表1，一20℃条件下保存。表1
引物名称
内参引物探针”
水貂引物探针
免引物探针
貉子引物探针
浣熊引物探针
马引物探针
牛引物探针
山羊引物探针
绵羊引物探针
引物和探针信息
引物和探针序列（5'-3'）
CCTGAGAAACGGCTACCAT
CGTGTCAGGATTGGGTAAT
(FAM)TGCGCGCCTGCTGCCTTCCT(TAMRA)CCACTAACATCATCCATCACCA
AATGAGTGGGTAGGGCATGG
(FAM)CTCCCATCCTAGCCCTAACACTAGCCCTT(TAMRA)TAATCGTCACCGCACATGCC
CTATGTCAGGAGCCCCAATTATCA
(FAM)ACAAGCCAGTTCCCGAAGCC TCCA(Eclipse)CCTATCCCTCTCCCACGTATGAA
TTAGGGATGAAACCGGATAGTGG
(FAM)CATTGATAACCTCCGTCATCCTGGCCC(TAMRA)GCTGACTTCCAATCAACTAGTTCTG
AGCTGTGGTAATCAGAACGCGAT
(FAM)CCTACTTACCAACACACTCCTAGCCTCC(TAMRA)CTTCAACCCCACAGCGTCCATCA
AGCGATCATCATTAACCTCATACAC
(FAM)TACTCAGAAGTGGAATGGTGTGAG(TAMRA)CCGATGGATGTTCAGAGCT
GCCAAATGTCTGGGTGTAGATACC
(FAM)TGGGCTTTAGGGCTTCCGAATGTGAA(TAMRA)TGCACTAACCACCCTAACCCTAT
AAAGGCACATGAAACGACCGT
(FAM)CCGCACCCATCATAATAACCAACCTCAAT(TAMRA）ACACAACTTCTACCACAACCC
AAACAATGAGGGTAACGAGGG
(FAM)ACACCGAAACAAAATACTCCTTGAGAAACA (TAMRA)该引物和探针见GB/T25165—2010。该引物和探针见GB/T21102—2007。该引物和探针见GB/T25165—2010。该引物和探针见GB/T25165—2010。目标基因
真核生物18SrRNA
基因（内参基因）
水貂内源基因
（线粒体基因）
兔内源基因
（线粒体基因）
貉子内源基因
（线粒体基因）
浣熊内源基因
（线粒体基因）
马内源基因
(线粒体基因）
牛内源基因
(生长激素基因）
山羊内源基因
（线粒体基因）
绵羊内源基因
（线粒体基因）
GB/T38421—2019
6仪器与设备
分析天平，精度为0.01g
6.2pH计，精度为0.1。
6.3高压灭菌锅。
6.4剪刀。
6.5恒温水浴箱。
6.6涡旋振荡器。
6.7高速冷冻离心机。
6.8微量可调移液器：0.1μ~2.5μ、1μ～10、2μ～20μ20μ200μ、100μ1000μL
6.9超微量核酸蛋白分析仪。
6.10超净工作台。
实时荧光PCR热循环仪（发射波长：500、533、568、610、640、670；单位：nm）。7试验步骤
DNA提取
7.1.1试样DNA提取
将试样去毛后剪碎（小于2mm×2mm），称取1g~2g试样.放人50mL离心管中，加人5mL预热至65℃氢氧化钠溶液（5.20），混匀（混勾时间不宜超过10s），立即加入10mL灭菌水（5.2）。12000r/min离心5min，倾去上层液体。加入15mL灭菌水（5.2），混匀后12000r/min离心5min，倾去上层液体。浅色试样重复本操作1次2次，深色样品重复本操作3次~4次。加入2.5mL～3.0mLSDS裂解缓冲液（5.22），混勺后用冰乙酸（5.10）或乙酸钠溶液（5.23）调节pH为7.0~7.5，加人50μL蛋白酶K（5.11)和50μLDTT（5.12）.58℃恒温水浴4h（或42℃恒温水浴6h24h)，期间振荡混匀3次～6次。取出，室温放置5min，12000r/min离心5min。取2mL上清液，加入等体积苯酚（5.13），振荡混匀5min，12000r/min离心15min，然后取2mL上清液重复操作一次。
取上清液，加人等体积三氯甲烷（5.14），振荡混匀5min，12000r/min离心10min，然后取上清液重复操作一次，
取上清液，加人等体积异丙醇（5.15），混匀后冰上静置2h以上。将混合液转入DNA吸附柱（5.25），室温放置2min，12.000r/min离心30s，倾去液体。加入600μL75%乙醇溶液（5.17），12000r/min离心30s。倾去液体后重复操作一次。12000r/min继续离心2min加快乙醇挥发，然后将DNA吸附柱放人新的1.5mL离心管中，室温放置5min，使乙醇挥发完全。加人50μLTE缓冲液（5.24），室温静置5min，12000r/min离心2min，取上清液，即为试样DNA溶液，待测。注：除上述方法外，也可用等效的DNA提取方法提取试样DNA。4
7.1.2阴性对照模板DNA提取
以滤纸代替试样，按7.1.1的方法提取DNA溶液，作为PCR扩增的阴性对照。7.1.3DNA质量评估
GB/T38421—2019
用超微量核酸蛋白分析仪（6.9）对试样DNA的质量进行评估，分别检测230nm、260nm和280nm波长处的吸光值OD230、OD26和OD280，若同时满足以下要求则适宜PCR扩增：10ng/μL≤DNA浓度≤20ng/μL；1.6≤OD260/OD28a≤2.0；
OD260/OD230≥1.0。
者按照7.1.1的方法提取的试样DNA不能满足以上要求时，应将DNA进一步纯化注：可根据试样的具体情况选择苯酚-三氯甲烷抽提、DNA纯化柱等方式进行纯化。7.2实时荧光PCR检测
7.2.1内参基因检测
可先将试样DNA进行内参基因的实时荧光PCR检测，若检测结果为阳性，表明提取的试样DNA适宜进行PCR检测可以进行动物内源基因的检测；若检测结果为阴性，表明提取的DNA不适宜进行PCR检测，应重新提取DNA。若重新检测结果仍为阴性，则本方法不适用于该试样检测，7.2.2实时荧光PCR扩增体系
为确保检测结果的准确性，在进行试样检测时，应同时设立空白对照、阴性对照和阳性对照试验，在超净工作台（6.10）中按表2配制实时荧光PCR扩增体系，每个试样DNA的PCR平行扩增2次。
试剂名称
10×PCR缓冲液
dNTPs(2.5mmol/L)
引物（20pmol/μL）
探针（10pmol/μL）
Ex Tag酶(5 U/μL)
模板DNA
灭菌水
实时荧光PCR扩增体系
正向：0.5μ
反向：0.5l
0.2μL(1U)
1 μL(10ng~20ng)
补足总体积至20.0μL
注1：空白对照试验时.用灭菌水(5.2)代替试样DNA。注2：阴性对照试验时，用模板DNA(7.1.2)代替试样DNA。注3：阳性对照试验时，用水貂、兔、貉子、浣熊、马、牛、山羊和绵羊基因组DNA（5.28）。5
GB/T38421—2019
7.2.3实时荧光PCR扩增循环参数混匀离心后置于实时荧光PCR仪上进行PCR扩增，PCR扩增参数根据不同仪器有所不同。一般反应参数为：94℃预变性5min后，按94℃/10s，60℃/30s，45个循环，最后于4℃结束反应。7.3
平行试验
每个试样应至少平行试验2次。
8结果分析
质量控制
8.1.1实时荧光PCR有效性判定
空白对照：无FAM荧光信号，相应Ct值≥40.0。阴性对照：无FAM荧光信号，相应Ct值≥40.0阳性对照：有FAM荧光信号，且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤36.0。否则判定为PCR无效。
8.1.2DNA提取有效性判定
取内参照引物对试样DNA提取液进行PCR扩增，在符合8.1.1的情况下，被检测试样DNA应有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现明显的扩增曲线，Ct值≤36.0。否则DNA提取无效，应重新提取DNA，直至Ct值≤36.0。8.2动物内源基因的检测结果判定在符合8.1.2的情况下，对试样DNA提取液进行各动物内源基因的实时荧光PCR扩增检测如有FAM荧光检出，且Ct值≤36.0.则判断该试样检出该动物源性成分。如Ct值≥40.0.则判断该试样未检出该动物源性成分如36.0试样DNA内参基因的检测结果为阴性，则表述为“该试样不适用于本方法检测”试样DNA内参基因的检测结果为阳性且某种动物（如水貂)内源基因的检测结果为阳性·则表述为“该试样检出该动物（如水貂）源性成分”：试样DNA内参基因的检测结果为阳性且某种动物（如水貂)内源基因的检测结果为阴性，则表述为“该试样未检出该动物（如水貂)源性成分”。10
防护措施和废弃物处理
检测过程中各种防护措施和废弃物处理按GB/T19495.2的规定进行试验报告
试验报告应包含以下内容：
本标准编号；
样品来源及描述；
结果表述；
试验过程中所出现的异常现象；实测方法与本标准的不同之处。GB/T38421—2019
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