本文件描述了化学品新西兰泥蜗繁殖试验的试验原理、受试物信息、参比物、方法描述、试验程序、质量保证与质量控制、数据和报告。 本文件适用于化学品的新西兰泥蜗繁殖试验。

ICS13.300；13.020.40
CCS A 80
中华人民共和国国家标准
GB/T42879—2023
化学品
新西兰泥蜗（Potamopyrgus
antipodarum）繁殖试验
Chemicals-Potamopyrgus antipodarum reproduction test2023-08-06发布
国家市场监督管理总局
国家标准化管理委员会
2023-12-01实施
规范性引用文件
术语和定义
试验原理
受试物信息
参比物
方法描述
试验程序
质量保证与质量控制
数据处理
报告：
附录A（资料性）
附录B（资料性）
附录C（资料性）
附录D（资料性）
参考文献
新西兰泥蜗的驯养
新西兰泥蜗的图片和软体示意图样本数据记录表
时间-加权平均浓度的计算
GB/T42879—2023
GB/T42879—2023
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请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任本文件由全国危险化学品管理标准化技术委员会（SAC/TC251)提出并归口。本文件起草单位：广东省科学院微生物研究所（广东省微生物分析检测中心）、生态环境部固体废物与化学品管理技术中心、中国检验检疫科学研究院、上海市检测中心、厦门市格灵生物技术有限公司、生态环境部南京环境科学研究所、沈化测试技术（南通)有限公司、中国化工信息中心有限公司、中国化工经济技术发展中心、浙江亚旺科技有限公司。本文件主要起草人：曾国驱、刘纯新、安超、陈桂兰、杨旭楠、王青柏、梁燕珍、黄叶梅、高亮、许玫英、周丽丽、郭敏、张瑛、赖伟、李建威、梁诗捷、赵玉艳、陈智勇、王哲思。GB/T42879—2023
本文件用于评价长期暴露下化学品对新西兰泥蜗（Potamopyrgusantipodarum）繁殖和生殖后代存活的潜在影响。
关于软体动物毒性测试的综述性论文强调了针对部分化学品开展水生软体动物繁殖毒性试验的必要性，特别强调了这类在生态和经济上具有重要地位的生物在毒性试验方法方面的缺失。试验暴露28d后，测定死亡率并以每只雌蜗所产的胚胎总数（不区分发育阶段)来评价其繁殖量。如采用本方法对混合物开展测试并将获得的数据用于监管时，需考虑试验结果是否充分且有效。如有法规明确规定可对混合物进行测试，则可直接采用本文件。I
1范围
化学品新西兰泥蜗（Potamopyrgusantipodarum）繁殖试验
GB/T42879—2023
本文件描述了化学品新西兰泥蜗繁殖试验的试验原理、受试物信息、参比物、方法描述、试验程序、质量保证与质量控制、数据和报告。本文件适用于化学品的新西兰泥蜗繁殖试验2规范性引用文件
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GB/T21801
GB/T21802
GB/T21803
GB/T21856
GB/T21857
3术语和定义
化学品
快速生物降解性
呼吸计量法试验
化学品
快速生物降解性
改进的MITI试验（I）
化学品
化学品
化学品
DOC消减试验
快速生物降解性
快速生物降解性
二氧化碳产生试验
快速生物降解性
改进的OECD筛选试验
下列术语和定义适用于本文件。3.1bZxz.net
x%效应浓度
x%effectconcentration;Ec
暴露期间引起新西兰泥蜗繁殖量降低工%时的受试物浓度3.2
最低可观察效应浓度lowestobservedeffectconcentrationLOEC暴露期间与对照相比，对受试生物产生显著效应（p<0.05)（繁殖量和死亡率)的最低受试物浓度。注：LOEC以上的所有试验浓度所产生的毒性效应等于或者显著高于LOEC中所观察到的毒性效应。3.3
无可观察效应浓度
度noobservedeffectconcentration；NOEC在暴露期间与对照组相比，对受试生物未产生显著效应（力<0.05)的受试物浓度。3.4
死亡mortality
受试生物停止活动。
注：用镊子轻轻触碰受试生物的蜗足或蜗（如果泥蜗缩进蜗壳内)未见反应，视为死亡。试验原理
试验主要目的是通过统计暴露28d结束后孵育囊中的胚胎数量（不区分发育阶段）来评价化学品1
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对新西兰泥蜗繁殖量的影响。将蜗暴露于一定浓度范围的受试物中进行试验，当受试物为难测试化合物（如受试物为易挥发、不稳定、可快速生物降解和吸附性物质）时，试验应采用流水式试验来代替半静态方式（见8.3），28d暴露期结束后考察蜗的存活率和试验结束时蜗的繁殖情况。受试物对胚胎数量的毒性效应以EC或无可观察效应浓度和最低可观察效应浓度（NOEC/LOEC)来表征。受试物对胚胎数量的毒性效应以EC或无可观察效应浓度（NOEC）和最低可观察效应浓度(LOEC)来表征，前者通过采用合适的回归模型拟合后估算导致胚胎数量出现%下降时的受试物浓度。试验浓度应包括出现效应的最低浓度（例如EC1。），该浓度通过内插法而非外推法得出。5
受试物信息
在试验前，应掌握受试物的下列信息：结构式；
b）纯度；
光稳定性；
试验条件下的稳定性；
水解作用；
解离常数(pKa)；
正辛醇/水分配系数（P。w）；
按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21856、GB/T21857测定的快速生物降解性；
水中溶解度；
蒸气压；
受试物在水溶液中的定量分析方法、回收率和定量限。参比物
为确保受试生物和试验条件的一致性和敏感性，应定期或在需要时开展参比物试验。已得到验证的参比物质包括：氯化镉、三丁基氯化锡（TBT-Sn）和咪鲜胺，其对以新西兰泥蜗胚胎数量作为繁殖量（见8.6）的ECso范围分别是5μg/L～20μg/L（以Cd计）、35ng/L～190ng/L和100μg/L～800μg/L(以a.i.计）。
7方法描述
仪器设备
试验容器或其他与试验溶液接触的器皿应为全玻璃或其他化学情性材料制成，测试过程中如使用塑料材质的容器应确保无增塑剂或其他化合物浸出。常用的仪器设备包括：用穿孔盖或纱布覆盖的500mL烧杯或其他可透气的防止试验蜗逃逸的器具；a）
空气泵、空气管和巴斯德管；
用于气流控制的可调节阀；
用于配制溶液的容量瓶和其他玻璃器血；e)
玻璃移液管；
溶解氧测定仪；
pH计；
电导率仪；
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用于测量水中氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐、总有机碳和水硬度的试剂盒或其他相关的设备；装有光源的体视显微镜；
用于控制温度、光照的人工气候室或空调室或其他合适的设备；1）
解部副盘和解剖器械。
7.2受试生物
7.2.1试验以新西兰泥蜗（Potamopyrgusantipodarum）为受试生物。用于验证试验的亲蜗属于单倍型t和形态型WarwickA”，因此建议使用单倍型t和形态型“WarwickA”的亲蜗进行试验。单倍型t和形态型“WarwickA”具有明显不同的遗传和解剖标记7.2.2试验用蜗应为实验室饲养、取自同一群体的健康成蜗（即未表现任何受胁迫现象，如死亡率高、繁殖力差和寄生虫感染等）。亲蜗应在相同的环境条件（光照、温度、培养基和喂食)下进行驯养（新西兰泥蜗的养见附录A）。如通过市售购买亲蜗，获得后至少需开展2周的试验前驯养以避免生物受到胁迫。由于不清楚泥蜗的（污染)历史，不宜采用野外获得的蜗开展试验。7.3配制水（合成水)/试验培养基7.3.1应使用配制水作为唯一的试验培养基。将3g海盐（或等效海盐）和1.8g碳酸氢钠溶解于10L去离子水中配制成配制水（合成水）。配制水（即添加饲料之前）中总有机碳质量浓度应小于2mg/L，应在情性材料（如玻璃或不锈钢）的容器中制备，而且容器的容积需足够大，例如50L玻璃缸，制成后储存备用。配制水宜在黑暗中室温保存，并于2周内使用，使用前应至少曝气24h。7.3.2配制水应符合下列水质参数要求：a）pH:8.0±0.5；
氧饱和度：大于空气饱和值的60%；电导率：770μS/cm士100μS/cm；c）
总有机碳：小于2mg/L。
7.3.3试验容器盛装400mL的配制水，用穿孔盖或纱布覆盖确保与外部保持空气流通。玻璃烧杯应每周更换。可将各平行的溶液混合后分析受试物浓度，有时为了满足分析要求可能需要制备更大容量的试验液。
7.4试验溶液
7.4.1通过稀释贮备液得到不同浓度的试验溶液。采用搅拌、超声波处理或其他适当的方法，将受试物溶解于配制水来制备贮备液，尽量避免使用助溶剂或分散剂。对于难测试化学物质可参考文献。如果使用助溶剂以配制适当浓度和均匀的贮备液，其最终浓度应尽可能低，且不应超过20uL/L。除了配制水对照组外，应增设一个助溶剂对照组。在所有的试验浓度组和助溶剂对照组中，助溶剂的浓度应保持相同。
7.4.2根据受试物的物理化学性质和试验敏感性选择合适的助溶剂，助溶剂应在试验的前期确定。所用的助溶剂和分散剂应对亲蜗的繁殖无明显效应。对于助溶剂的选择，可以参考关于难测试化学物质毒性测试的文献。在验证试验中，使用的助溶剂包括二甲基亚（DMSO）、三乙二醇（TEG）、丙酮和冰醋酸。二甲基亚矾、三乙二醇和丙酮的特点是毒性低（对亲蜗的NOEC>12.5mL/L，至少高于助溶剂在试验中最高浓度20μL/L的625倍），而且不会在试验容器中形成生物膜。相反，使用乙醇作为助溶剂，即使当浓度低至30uL/L时也会导致真菌和细菌的大量繁殖。3
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8试验程序
8.1暴露条件
8.1.1周期
试验周期为28d。
8.1.2承载量
应检查用于试验的亲蜗繁殖能力。试验前从用于试验的培养批次中挑选20只亲蜗，测定其外壳长度和胚胎数量（参见附录B的图B.1）。亲蜗的外壳长度应为3.5mm～4.5mm，每只亲蜗平均产胚胎数量在5～20之间，即为实验室长期培养的亲蜗繁殖胚胎的上限和下限（参见附录A）。平均胚胎数量的变异系数不应超过40%。
8.1.2.2用镊子将6只成龄亲蜗随机分配到各个盛有受试物溶液的试验容器中。容器应随机摆放，例如按随机分组表进行摆放，以减少试验位置带来的影响，否则可能造成偏差，这种偏差可能归因于浓度导致的效应。尤其是如果按照不同组别或浓度顺序来进行试验单元的操作，则易出现某些与时间顺序相关的效应，例如疲劳操作或其他错误，易导致浓度越高的试验组效应越明显。8.1.3喂食
宜每天喂食，至少每周3次喂食细碎的市售饲料[60ug/（蜗·d）～80μg/（蜗·d)]，喂食频次和数量应在报告中注明。用去离子水或者蒸馏水制备均匀的饲料悬浊液，采用不断搅拌的方式避免饲料颗粒沉淀，将适量的悬浮饲料转移到各个试验容器中。添加到每个浓度组的饲料悬浊液体积应尽可能小，以减少对试验溶液的稀释。饲料应即配即用。8.1.4光照条件
试验过程中，每天光暗比为16h：8h，试验溶液表面的光照强度为5001x士1001x。如果进行光敏感的受试物试验，应降低光照强度。光源应安装在试验容器的上方，试验容器应放置于深色的台面上避免亲蜗逃逸。光照条件的偏离应在报告中说明理由8.1.5温度
试验过程中，应控制试验溶液的温度为16℃土1.5℃。8.1.6曝气
8.1.6.1通过连接到空气管道系统的玻璃管（巴斯德管）对试验溶液进行曝气，使用流量阀控制曝气强度。如果受试物为挥发性化合物，不宜进行曝气。对于易挥发的物质应采用容积足够大且完全充满试验溶液的密闭容器进行测试，以避免氧气不足。8.1.6.2溶解氧含量应维持大于空气饱和度的60%，并轻轻充气以免受试物挥发。8.2试验设计
8.2.1正式试验
正式试验至少设置5个受试物试验浓度组，每个浓度组包含6个平行，每个平行放人6只亲蜗（即每浓度组36只亲蜗）。试验浓度可按几何数列设置，间隔系数不超过3.2。如果少于5个浓度组和/或者浓度间距天于3.2应作说明（例如以通过预试验的浓度效应曲线进行解释）。通过预试验或者其他来4
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源如交叉参照等获知的受试物毒性信息，有助于选择合适的试验浓度范围。试验的最高浓度不应高于受试物的饱和溶解度。试验宜设置5个（或更多）浓度组，每个浓度组6个平行，以同时获得EC以及NOEC/LOEC。预期毒性值应在试验浓度范围内，如需计算EC，理想状况下EC，应在设置的试验浓度范围内。
8.2.2限度试验
如果预试验表明在最高浓度（10mg/L受试物溶液或者饱和溶液）中未观察到效应，或者受试物的毒性效应非常低，可设置一个试验浓度组，如10mg/L和空白对照组进行限度试验。10mg/L组和空白对照组均设置10个平行，每个平行6只亲蜗。限度试验有可能会显示在限定浓度时无明显的效应，但当限度试验产生效应浓度时，则需开展完整的正式试验。试验少于10个平行应说明理由。8.2.3空白对照
不含受试物的空白对照组试验中应包括适当数量的平行。配制水空白对照组平行数为6个，需要时还应增设助溶剂对照组（仅含有助溶剂)6个平行。如果试验为限度试验，空白对照组应增加到10个平行（见8.2.2）。
8.3试验溶液的更换
8.3.1溶液的更换频率取决于受试物的稳定性，但至少每周3次。烧杯应每周更换。如果初步的稳定性试验或者受试物的理化性质表明受试物不稳定（即超出配制浓度的80%～120%或低于初始测定浓度的80%），受试物在最长的更换周期内（即3d)不稳定，宜增加更换频率。例如受试物为难测试物质（即易挥发、不稳定、可快速生物降解和吸附性化合物）时，则宜进行流水式试验。试验程序已在半静态试验的条件下通过验证，流水式试验也可采用该程序，但应进行适当的调整并予以说明。8.3.2试验溶液的更换可参考以下流程。轻轻地将试验容器中的暴露溶液完全移出，用筛网收集可能从玻璃壁上脱落的亲蜗，筛网收集到的亲蜗应尽快放回试验容器。在试验温度下将配制水重新注人试验容器，立即将受试物（例如采用贮备液）添加到更换的配制水中。对新制备的暴露试验溶液进行人工搅拌使之均匀，然后将亲蜗重新放回试验容器中。一旦完成对照组和试验溶液更换，立即给受试生物饲喂定量（见8.1.3）的饲料。
8.4试验观察
每周至少观察试验容器3次，对任何异常行为进行目测评估（如浮出水面、拒食或嗜睡，即完全缩进蜗壳内静止不动或将蜗足伸出蜗壳并逃离试验容器），宜在更新试验溶液和其后喂食期间，观察受试生物的胁迫情况，任何胁迫情况都应记录下来。如果发现亲蜗逃离对照和试验溶液，应马上将其转移回溶液中。
8.5死亡
受试生物停止活动，即用镊子轻轻触碰受试生物的蜗足或蜗（蜗缩进蜗壳内时)也未见反应，视为死亡。宜每天或至少在溶液更新时将死亡的亲蜗从试验容器中移出，并进行记录。8.6繁殖
8.6.1试验结束时，统计所有存活蜗孵育囊中胚胎的数量。宜将蜗快速冷冻（在液氮或一80℃的超低温冰箱中），并贮存在一20℃直至分析计数。如做组织病理学的检查，则需在解剖前将蜗置于用去离子水或蒸馏水配制的2.5%六水合氯化镁（MgCl2·6HzO)溶液中麻醉45min～90min。8.6.2蜗壳的长度（从壳尖至蜗口的下边缘，见图B.1)应在体视显微镜下用目镜的测微尺进行测量。5
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壳长与雌蜗的繁殖能力呈正相关，可作为一个辅助性的指标。8.6.3用钳子小心地将蜗壳弄破，然后将蜗置于有少量试验用水或自来水的解剖盘中。用解剖针或尖的镊子将壳移除，获得蜗的软体，透过上皮可以很容易地观察到蜗的胚胎（见图B.2和图B.3）。用解部针小心打开蜗的孵育囊，然后将胚胎（包括带壳的和无壳的）移出和计数，以计算每只雌性蜗的繁殖成功率（见图B.4）
8.6.4如果受试蜗未产出胚胎，则需鉴定其性别。雄性蜗的特征是在颈部有雄性生殖器（在吻和两个触须后的外套腔的底部）。因为在实验室培养的单倍型蜗t中从未出现过雄性蜗，出现雄性蜗对繁殖试验结果的影响尚未清楚。假如在试验中出现了雄性蜗，则应将其从繁殖能力的统计分析中剔除。8.6.5数据应记录在合适的数据记录表（见附录C的范例)中，计算壳长和胚胎数量的平均值及其变异系数，例如标准偏差或标准误差。8.7分析、测定的频率
8.7.1受试物的浓度
8.7.1.1试验期间定期测定受试物的浓度。应建立浓度分析方法，包括合适的定量限和受试物在试验体系中的稳定性信息。
8.7.1.2在半静态试验中，受试物的浓度预计能维持在理论浓度的士20%的范围内（即在80%～120%范围内，见8.3），在更换溶液时应至少测定最高和最低浓度组中新旧试验溶液中的受试物浓度。分析测定的样品应来自同一试验溶液，包括新旧溶液。此后应至少每周重复测定。8.7.1.3如果预计受试物浓度不能维持在理论浓度的士20%的范围内，则需要测定所有试验组新、旧试验溶液的受试物浓度。但是，在受试物的初始实测浓度不在理论浓度的士20%范围时，如有足够的证据表明受试物的初始实测浓度重复性好且稳定（即在初始浓度的80%～120%范围内），那么第2周、第3周和第4周受试物的浓度分析可减少为仅测定最高和最低浓度试验组。受试物浓度的测定应在同一试验组的不同平行容器中交替进行，任何情况下，仅需测定其中一个平行容器中受试物的浓度。8.7.1.4与半静态试验类似的采样策略同样适用于流水式试验（只是“旧溶液”的测定不适用于流水式试验）。但在试验的第1周应增加采样的次数（至少测定2次），这有利于证明受试物浓度保持稳定。在正式试验开始之前需要完成浓度稳定性的验证工作。在流水式试验中，每天都应检查稀释水和受试物贮备液的流速。
8.7.1.5如有证据表明在整个试验期间，受试物浓度始终维持在理论浓度或实测初始浓度的士20%范围内，可以理论浓度或实测初始浓度表示试验结果。如果受试物浓度的变化超过了理论浓度或实测初始浓度的士20%范围，试验结果应以时间-加权平均浓度表示（计算方法见附录D）。8.7.2物理化学参数
应至少每周测定一次空白对照组和每个受试物试验组中某个平行容器中新、旧溶液的水质参数，包括pH、溶解氧、电导率、温度、氨氮和亚硝酸盐浓度。如果空白对照组或最低浓度试验组中出现异常高的死亡率，则需增加测定硝酸盐和总硬度的浓度。质量保证与质量控制
如满足以下条件，试验结果有效：a
试验结束时，空百对照组所有重复的平均死亡率不超过20%；b）i
试验结束时，空白对照组中每个亲蜗所产的平均胚胎数不少于5个；c）
试验期间，空白对照组和暴露组的溶解氧含量不低于空气饱和值的60%；6
d）试验期间，空白对照组和暴露组的平均水温在16℃士1.5℃范围内。10数据处理
10.1结果处理
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10.1.1试验目的是评价受试物对繁殖量的影响。28d暴露试验结束时，用表格的形式（见附录C的示例)列出存活的亲蜗及其孵育囊中胚胎（不考虑发育阶段的差别)的数量。计算每个试验组所有平行所产胚胎数量的平均值，并进行统计学分析。在繁殖试验中，标准的浓度-效应关系是产胚胎数量的平均值随着受试物浓度的增加而下降。繁殖试验已通过化学物质进行验证，证实化学物质会导致胚胎数量减少。试验中也可能会出现繁殖量增加的情况，这种情况已在乙醇和其他一些已知或疑似对脊椎动物有雌激素效应的物质的繁殖试验中观察到。但是本繁殖试验不适用于仅仅根据胚胎数量的增减证明内分泌的介导作用。
10.1.2在进行统计学分析，如方差检验、比较受试物试验组与空白对照组的Dunnett’s检验、Williams检验或Jonckheere-Terpstra递减趋势检验（见10.3.2）前，如果需要满足特定统计检验的要求，宜将数据进行转换。如果采用非参数检验方法，可考虑根据Holm或Jonckheere-Terpstra趋势检验得到的Bonferroni-U检验方法，可用各受试物试验组的平均值计算95%的置信限。另外，含有Poisson或负二项误差分布的广义线性混合模型(GLMM)也可用于胚胎数量的统计分析。10.1.3空白对照组存活亲蜗的数量是试验有效性指标之一，应予以记录和报告。所有其他的负面效应也应在最终报告中进行描述，如异常行为（浮出水面、拒食或嗜睡，即完全缩进壳内静止不动或将蜗足伸出蜗壳并逃离试验容器)和胚胎的异常外观（如没有壳的已完全发育的胚胎、带畸形壳的胚胎）。10.2ECr
对采用合适的统计学方法，如泊松误差分布逻辑模型，计算EC，及其95%的置信限范围。需注意的是，Weibull和Spearman-Karber检验是在非连续效应时使用的，如固定数量受试生物受到胁迫时的存活率。这与繁殖不同，对于繁殖，胚胎的数量是因亲本的不同而变化。有时也将这些非连续效应作为带有正态误差的连续效应进行分析，但针对不同的情况应仔细评估。为了计算EC1o、ECso或其他EC.，应采用回归分析模型分析所有的数据。10.3NOEC/LOEC
10.3.1如果统计NOEC或LOEC，应根据参考文献选用合适的统计学方法。通常采用单边假设检验（p<0.05)比较受试物试验组与空白对照组的毒性效应，但参考文献未覆盖非正态误差分布的GLMM模型。
10.3.2正态分布和方差齐性可用合适的统计方法进行检验，如分别用Shapiro-Wilk检验（p<0.05）和Levene检验（p<0.05）。如果使用GLMM模型，应检查过度分散（额外泊松变率），选择如负二项误差分布代替Poisson误差分布，然后进行单因素方差分析和多重比较。多重比较（如Dunnettstest）或step-down趋势检验（如Williams'检验或Jonckheere-Terpstra递减趋势检验）均可用于计算受试物试验组与空白对照组之间是否存在显著性差异（P<0.05）（根据参考文献选择推荐的检验方法）。此外，非参数检验方法（如根据Holm或Jonckheere-Terpstr趋势检验得到的Bonferroni-U检验）也可以用于确定NOEC和LOEC。
11报告
试验报告应包括以下内容。
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